المناعي لمراقبة الخلوية امتصاص اللاكتوفيرين الإنسان ولها نشاط مضاد للفيروسات أسوشيتد ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C

Summary

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Abstract

المناعي هو تقنية المختبرات تستخدم عادة لدراسة جوانب كثيرة من الأحياء. وعادة ما يتم استخدامه لتصور توزيع و / أو توطين جزيء الهدف في الخلايا والأنسجة. تعتمد المناعي على خصوصية الأجسام المضادة الفلورسنت المسمى ضد المستضدات يناظرها داخل الخلية. كلا النهجين المباشرة وغير المباشرة المناعي يمكن أن تستخدم التي تعتمد على استخدام الأجسام المضادة ترتبط مع تألقي. وأقل استخداما المناعي المباشر لأنه يوفر أدنى إشارة، ينطوي على ارتفاع تكلفة وأقل مرونة. في المقابل، يستخدم المناعي غير المباشر أكثر شيوعا بسبب حساسية عالية ويوفر إشارة تضخيم منذ الضد الثانوية أكثر من واحد يمكن أن نعلق على كل الأجسام المضادة الأولية. في هذه المخطوطة، واستخدمت كل من المجهري epifluorescence ومتحد البؤر المجهري لمراقبة استيعاب اللاكتوفيرين الإنسان، وهو عنصر مهم من جهاز المناعةالنظام، في الخلايا الكبدية. وعلاوة على ذلك، ونحن رصد إمكانات المثبطة للمؤسسة الأرض المقدسة على تكرار داخل الخلايا لفيروس التهاب الكبد C باستخدام المناعي. كلاهما مناقشة مزايا وعيوب المرتبطة بهذه النهج.

Introduction

Immunofluorescence is a technique that uses a fluorescence microscope to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in a biological sample. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell¹. It is typically used on tissue sections and cultured cell lines in order to analyze the distribution/localization of various biological molecules such as proteins, nucleic acids and glycans. It should be noted that immunofluorescence is often used in combination with other non-antibody methods of fluorescent staining such as the 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stains which are typically used to label DNA². Moreover, this technique involves fixation of the cells which allows the analysis of cells at a specific time.

Different types of microscopes can be used to analyze immunofluorescence samples. The simplest is the epifluorescence microscope (Figure 1) for which excitation of the fluorochrome and detection of the fluorescence are done through the same light path³. Because most of the excitation light is transmitted through the sample, only reflected excitatory light can reach the objective together with the emitted light. This approach unfortunately leadsto a frequent high signal to noise ratio.In contrast, confocal microscopy (Figure 2) offers a distinct advantage for increasing optical resolution and contrast by means of adding a spatial pinhole placed at the confocal plane of the lens to eliminate out-of-focus light⁴. This approach allows the reconstruction of three-dimensional structures from the obtained images. However, since an important fraction of the light from the sample is blocked at the pinhole, long exposures are often required.

There are two classes of immunofluorescence techniques, primary (or direct) and secondary (or indirect). Direct immunofluorescence involves a primary antibody linked with a fluorochrome (Figure 3). This method is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility¹. Moreover, such antibodies are generally harder to find commercially. On the other hand, the direct attachment of the fluorochrome to the antibody significantly reduces the number of steps in the procedure, saving time and frequently reducing non-specific background signal. This also limits the possibility of antibody cross-reactivty.

Indirect immunofluorescence involves a primary unlabelled antibody which is specific for the epitope of interest¹. A secondary antibody which carries the fluorochrome then recognizes the primary antibody and binds to it (Figure 3). Although indirect immunofluorescence is more complex and time consuming than direct immunofluorescence, it is frequently used because of its high sensitivity and it also provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In addition, a vast array of commercial secondary antibodies is available at affordable prices.

Hepatitis C virus (HCV) is a major public-health problem with 130-170 million individuals chronically infected worldwide. In order to halt the epidemic, therapy against HCV will need to be both effective and widely available. Studies focusing on safe and affordable natural product active against HCV have revealed the antiviral activity of the human Lactoferrin (hLF) protein which binds and neutralizes the circulating virion⁵. In the current study, investigation of hLF activity on the HCV subgenomic replicon system, which is independent from viral entry and shedding, revealed a distinct antireplicative activity of hLF against HCV. This manuscript presents a study in which immunofluorescence assays were performed to monitor the internalization of hLF, an important component of the immune system⁶, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus (HCV).

Protocol

1. خلايا إعداد والعلاج

1. في لوحة 24-جيدا، ووضع غطاء من الزجاج في الجزء السفلي من الآبار. يغسل كل جيدا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
2. البذور هوه-7 خلايا دعم HCV ريبليكون subgenomic في كل بئر لكثافة 5 × 10 ⁴ خلايا / جيد. إذا لم يكن هناك علاج لذلك، الخلايا يمكن المصنف في مناطق ذات كثافة أعلى. مستنبت هو Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ من الجنين مصل بقري (FBS)، 2mm و L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم و 250 ملغ / مل G-418 (للحفاظ على ريبليكون).
3. احتضان عند 37 ° C وCO _2. في اليوم التالي 5٪، وعلاج الخلايا مع 3 ميكرومتر من مؤسسة الأرض المقدسة تنقيته من الحليب البشري.

2. امتصاص العرق / إعداد السكروز (12٪ القوات الجوية الباكستانية و 12٪ سكروز)

1. وضع 500 مل من برنامج تلفزيوني في كوب وتسخينها بين 20 درجة مئوية و 30 درجة مئوية. حل 60 غرام من السكروز في برنامج تلفزيوني. حل 60 غرام من paraformaldehyde (القوات الجوية الباكستانية) في برنامج تلفزيوني / محلول السكروز. إضافة ببطء هيدروكسيد الصوديوم 2N (3-7 مل) حتى يتم الحصول على حل واضح.
2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك. حجم الكامل إلى 500 مل مع برنامج تلفزيوني. تصفية عن طريق الجاذبية على مرشح هتما. قبل الاستخدام، وتمييع الحل مع برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 4٪ القوات الجوية الباكستانية و 4٪ السكروز (التخزين 4 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع كحد أقصى).

3. المناعي

1. في الوقت المطلوب (0 ساعة، 2 ساعة أو 24 ساعة من العلاج)، وغسل الخلايا مرتين (1 دقيقة) مع برنامج تلفزيوني وإصلاح مع PBS / 4٪ القوات الجوية الباكستانية / 4٪ سكروز لمدة 20 دقيقة في RT. الخلايا عادة في 30-40٪ التقاء وتستخدم 1.5X10 ⁵ الخلايا.
2. Permeabilize الخلايا مع 0.15٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق على RT وكتلة في 10٪ مصل الماعز العادي (خ ع) في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
3. تمييع الأجسام المضادة الأولية من البروتين من الفائدة في 10٪ NGS (على سبيل المثال: الماوس الرئيسي لمكافحة HLF الأجسام المضادة المخفف 1: 1000). تطبيق الأجسام المضادة الأولية للخلايا.
4. بعد 4 ساعات في RT أو O /N عند 4 درجات مئوية، وغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع 10٪ NGS. وصمة عار على الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع تألقي مخففة في 10٪ NGS (على سبيل المثال: تألقي مع الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر ترتبط الأجسام المضادة لمكافحة فأر 1: 1000) لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.
5. غسل خلايا مرة واحدة لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني وصمة عار على الخلايا مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) (1 ميكروغرام / مل) لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
6. غسل الخلايا مرتين لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني. جبل تغطية النظارات على SlowFade المتوسطة المتزايدة قبل التصور من خلال المجهر. الخلايا هي الآن جاهزة لتحليلها من قبل epifluorescence أو المجهري متحد البؤر.
7. استخدام عناصر التحكم المختلفة لضمان خصوصية الكشف. على سبيل المثال، عن الأجسام المضادة يمكن أن يكون تم حذفها من أجل الكشف عن تألق ذاتي. يمكن حذف الأجسام المضادة الأولية لتحديد تلطيخ غير محدد من الأجسام المضادة الثانوية. وأخيرا، إذا كان ذلك ممكنا، والخلايا أو الأنسجة التي لا تحكمويمكن أيضا التعبير عن جزيء من الفائدة يمكن استخدامها.
8. تصور العينات باستخدام المجهر المناسب مضان (epifluorescence أو متحد البؤر) ومجموعات مرشح مناسب لتسمية الفلورسنت المستخدمة. الشرائح ويمكن أيضا أن تكون مخزنة في مربع الشريحة في <-20 ° C للفحص لاحقا.

4. مضان المجهر

1. الحفاظ على العينات في الظلام لمنع photobleaching من. بدوره على مصدر ضوء المجهر المختار (epifluorescence أو متحد البؤر).
2. بدوره على المجهر. تشغيل الكاميرا لالمجهر. وضع الشريحة على المجهر التصور. إضافة زيت الغمر على الشريحة لزيادة الفتحة العددية للعدسة موضوعية.
3. حدد الفلاتر المناسبة. ضبط التركيز والهدف المناسب. ضبط مصاريع من أجل الكشف عن تألقي المناسب ولكن منع photobleaching من. إبقاء الأضواء العلوية من لتقليل ضوء الخلفية عند النظر في العينة.
4. التغيير عشرمرشحات البريد لتصور fluorochromes مختلف (على سبيل المثال دابي وللحصول على الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر). التقاط الصور مع الكاميرا.

النتائج

تم رصد قدرة الكبد هوه-7 خط الخلية لاستيعاب الناجزة خارجيا مؤسسة الأرض المقدسة باستخدام المناعي على miscroscope مبائر. وأضاف مؤسسة الأرض المقدسة إلى وسائل الإعلام والثقافة، وسمح للاستيعاب لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك، تم غسلها خارج الخلية مؤسسة الأرض المقدسة مع برنامج تلفزيوني و...

Discussion

لا يزال وباء فيروس (سي) يشكل تهديدا عالميا، مع 80٪ من المرضى المصابين حديثا تطوير عدوى مزمنة، مما يعرضهم لخطر تليف الكبد، وفشل الكبد أو سرطان الكبد. العوامل المضادة للفيروسات التي تستهدف تكرار HCV والنضج التصرف المباشر تمثل رئيس كلاء المضادة للفيروس (سي)، كما تبين مؤخرا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000