Immunofluorescence de suivi de l'absorption cellulaire de la lactoferrine humaine et de son activité associée antivirale contre le virus de l'hépatite C

Résumé

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Résumé

L'immunofluorescence est une technique de laboratoire couramment utilisés pour étudier de nombreux aspects de la biologie. Il est généralement utilisé pour visualiser la distribution et / ou la localisation d'une molécule cible dans des cellules et des tissus. Immunofluorescence repose sur la spécificité des anticorps marqués par fluorescence contre leurs antigènes correspondants au sein d'une cellule. Les deux approches directes et indirectes immunofluorescence peuvent être utilisés qui reposent sur l'utilisation d'anticorps liés à un fluorochrome. L'immunofluorescence directe est moins fréquemment utilisé, car il fournit le signal inférieur, implique un coût plus élevé et moins de flexibilité. En revanche, l'immunofluorescence indirecte est plus couramment utilisé en raison de sa haute sensibilité et fournit un signal amplifié depuis plus d'un anticorps secondaire peut se rattacher à chaque anticorps primaire. Dans ce manuscrit, à la fois microscopie à épifluorescence et microscopie confocale ont été utilisés pour contrôler l'internalisation de la lactoferrine humaine, un élément important de la réponse immunitairesystème, dans les cellules hépatiques. De plus, nous avons surveillé le potentiel d'inhibition de la hLF sur la réplication intracellulaire du virus de l'hépatite C par immunofluorescence. Aussi bien les avantages et les inconvénients associés à ces approches sont discutées.

Introduction

Immunofluorescence is a technique that uses a fluorescence microscope to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in a biological sample. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell¹. It is typically used on tissue sections and cultured cell lines in order to analyze the distribution/localization of various biological molecules such as proteins, nucleic acids and glycans. It should be noted that immunofluorescence is often used in combination with other non-antibody methods of fluorescent staining such as the 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stains which are typically used to label DNA². Moreover, this technique involves fixation of the cells which allows the analysis of cells at a specific time.

Different types of microscopes can be used to analyze immunofluorescence samples. The simplest is the epifluorescence microscope (Figure 1) for which excitation of the fluorochrome and detection of the fluorescence are done through the same light path³. Because most of the excitation light is transmitted through the sample, only reflected excitatory light can reach the objective together with the emitted light. This approach unfortunately leadsto a frequent high signal to noise ratio.In contrast, confocal microscopy (Figure 2) offers a distinct advantage for increasing optical resolution and contrast by means of adding a spatial pinhole placed at the confocal plane of the lens to eliminate out-of-focus light⁴. This approach allows the reconstruction of three-dimensional structures from the obtained images. However, since an important fraction of the light from the sample is blocked at the pinhole, long exposures are often required.

There are two classes of immunofluorescence techniques, primary (or direct) and secondary (or indirect). Direct immunofluorescence involves a primary antibody linked with a fluorochrome (Figure 3). This method is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility¹. Moreover, such antibodies are generally harder to find commercially. On the other hand, the direct attachment of the fluorochrome to the antibody significantly reduces the number of steps in the procedure, saving time and frequently reducing non-specific background signal. This also limits the possibility of antibody cross-reactivty.

Indirect immunofluorescence involves a primary unlabelled antibody which is specific for the epitope of interest¹. A secondary antibody which carries the fluorochrome then recognizes the primary antibody and binds to it (Figure 3). Although indirect immunofluorescence is more complex and time consuming than direct immunofluorescence, it is frequently used because of its high sensitivity and it also provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In addition, a vast array of commercial secondary antibodies is available at affordable prices.

Hepatitis C virus (HCV) is a major public-health problem with 130-170 million individuals chronically infected worldwide. In order to halt the epidemic, therapy against HCV will need to be both effective and widely available. Studies focusing on safe and affordable natural product active against HCV have revealed the antiviral activity of the human Lactoferrin (hLF) protein which binds and neutralizes the circulating virion⁵. In the current study, investigation of hLF activity on the HCV subgenomic replicon system, which is independent from viral entry and shedding, revealed a distinct antireplicative activity of hLF against HCV. This manuscript presents a study in which immunofluorescence assays were performed to monitor the internalization of hLF, an important component of the immune system⁶, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus (HCV).

Protocole

1. Les cellules élaboration et au traitement

1. Dans une plaque de 24 puits, mettre un couvercle de verre au fond des puits. Laver chaque puits avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Semences Huh-7 cellules de soutien réplicon sub-génomique du VHC dans chaque puits à une densité de 5 x 10 ⁴ cellules / puits. En l'absence de traitement à faire, les cellules peuvent être ensemencées à une densité plus élevée. Le milieu de culture est du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de Foetal Bovine Serum (FBS), 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM et 250 mg / ml de G-418 (pour maintenir le réplicon).
3. Incuber à 37 ° C et 5% de CO _{2. Le} lendemain, traiter les cellules avec 3 uM de hLF purifiée à partir de lait maternel humain.

2. Paraformaldéhyde / Préparation saccharose (12% PAF et 12% de saccharose)

1. Mettre 500 ml de PBS dans un bêcher et chauffer entre 20 ° C et 30 ° C. Dissoudre 60 g de saccharose dans le PBS. Dissoudre 60 g de Paraformalhyde (PAF) dans le / solution de saccharose PBS. Ajouter lentement NaOH 2N (3 à 7 ml) jusqu'à ce qu'une solution claire est obtenue.
2. Ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Complète le volume à 500 ml avec du PBS. Filtrez par gravité sur filtre Whatman. Avant l'emploi, diluer la solution avec du PBS à une concentration finale de 4% et de PAF 4% de saccharose (de stockage 4 ° C pendant 1 semaines maximum).

3. immunofluorescence

1. Au moment voulu (0 h, 2 h ou 24 h de traitement), laver deux fois les cellules (1 min) avec du PBS et on fixe avec du PBS / 4% PAF / 4% de saccharose pendant 20 min à température ambiante. Les cellules sont généralement à 30-40% de confluence et de 1,5x10 ⁵ cellules sont utilisées.
2. Perméabiliser les cellules avec 0,15% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min à température ambiante et le bloc de 10% de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS pendant 20 min.
3. Diluer l'anticorps primaire de la protéine d'intérêt dans 10% de NGS (exemple: souris anti-anticorps primaire hLF dilué à 1: 1000). Appliquer l'anticorps primaire pour les cellules.
4. Après 4 heures à température ambiante ou O /N à 4 ° C, laver les cellules trois fois pendant 5 min avec 10% de NGS. Colorer les cellules avec un anticorps secondaire marqué avec un fluorochrome dilué dans 10% de NGS (exemple: fluorochrome avec la longueur d'onde d'excitation de 488 nm lié à un anticorps anti-souris 1: 1000) pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité.
5. Laver les cellules une fois pendant 5 min avec du PBS et colorer les cellules avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 ug / ml) pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
6. Laver les cellules deux fois pendant 5 min avec du PBS. Placer le couvercle sur les verres SlowFade milieu de montage avant la visualisation au microscope. Les cellules sont maintenant prêts pour l'analyse par épifluorescence ou microscopie confocale.
7. Utiliser différentes commandes pour assurer la spécificité de la détection. Par exemple, tous les anticorps peuvent être omis dans le but de détecter autofluorescence. L'anticorps primaire peut être omis afin de déterminer la coloration non spécifique par l'anticorps secondaire. Enfin, si possible, contrôle de cellules ou de tissus qui ne sont pasexprimer la molécule d'intérêt peut également être utilisé.
8. Visualisez les échantillons en utilisant un microscope à fluorescence appropriée (à épifluorescence ou confocale) et jeux de filtres appropriés pour le marqueur fluorescent utilisé. Diapositives peut également être stocké dans une boîte de diapositives à <-20 ° C pour un examen ultérieur.

4. microscopie à fluorescence

1. Conserver les échantillons dans l'obscurité pour éviter photoblanchiment. Allumez la source de lumière du microscope choisi (épifluorescence ou confocale).
2. Allumez le microscope. Allumez l'appareil photo pour le microscope. Mettez la lame sur le microscope pour la visualisation. Ajouter de l'huile d'immersion sur le tiroir pour augmenter l'ouverture numérique de la lentille d'objectif.
3. Sélectionnez les filtres appropriés. Ajuster le focus et l'objectif approprié. Ajustez les volets afin de détecter le fluorochrome approprié, mais éviter photoblanchiment. Gardez plafonniers hors de minimiser fond clair quand on regarde l'échantillon.
4. Changer efiltres électroniques de visualiser différents fluorochromes (par exemple DAPI et pour une longueur d'onde d'excitation de 488 nm). Prenez des photos avec l'appareil photo.

Résultats

La capacité de la lignée de cellules Huh-7 hépatique administrée de manière exogène à internaliser hLF a été surveillée en utilisant une immunofluorescence sur Miscroscope confocale. hLF a été ajouté au milieu de culture et l'internalisation a été laissé pendant 24 heures, après quoi, la hLF extracellulaire a été lavée avec du PBS et la membrane résiduel lié hLF a été dégradé avec un traitement à la trypsine 5 min (1 ml). Les cellules ont été réensemencées et autorisés à ré-adhérer...

Discussion

L'épidémie de VHC demeure une menace mondiale, avec 80% des patients nouvellement infectés en développement une infection chronique, les mettant à risque de cirrhose, l'insuffisance hépatique ou carcinome hépatocellulaire. Action directe des agents antiviraux ciblant la réplication du VHC et de la maturation représentent premiers agents anti-VHC, comme l'a récemment démontré par l'approbation réglementaire de deux inhibiteurs de la protéase NS3 extrémité N-terminale (bocéprévir et téla...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000