Иммунофлуоресценции для мониторинга клеточного поглощения лактоферрин человека и его противовирусной активностью против вируса гепатита С

Резюме

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Аннотация

Иммунофлуоресценции является метод лабораторной обычно используется для изучения многих аспектов биологии. Это, как правило, используется для визуализации распределения и / или локализации молекулы-мишени в клетках и тканях. Иммунофлуоресценции зависит от специфики флуоресцентных-меченых антител против антигенов, соответствующих их в клетке. Прямые и косвенные подходы иммунофлуоресцентные может быть использован, которые основаны на использовании антител, связанных с флуорохромом. Прямой иммунофлюоресценции менее часто используется, поскольку обеспечивает низкую сигнал, включает высокую стоимость и меньшую гибкость. В противоположность этому, непрямой иммунофлуоресценции чаще используется из-за его высокой чувствительностью и обеспечивает усиленный сигнал, так как более одного вторичного антитела можно прикрепить к каждому первичного антитела. В этой рукописи, и эпифлуоресцентной микроскопии и конфокальной микроскопии для контроля интернализации лактоферрина человека, важный компонент иммуннойСистема, в печеночных клетках. Кроме того, мы наблюдали за ингибирующее потенциал чЛФ на внутриклеточного репликации вируса гепатита С с использованием иммунофлуоресценции. Оба обсудили преимущества и недостатки, связанные с этими подходами.

Введение

Immunofluorescence is a technique that uses a fluorescence microscope to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in a biological sample. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell¹. It is typically used on tissue sections and cultured cell lines in order to analyze the distribution/localization of various biological molecules such as proteins, nucleic acids and glycans. It should be noted that immunofluorescence is often used in combination with other non-antibody methods of fluorescent staining such as the 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stains which are typically used to label DNA². Moreover, this technique involves fixation of the cells which allows the analysis of cells at a specific time.

Different types of microscopes can be used to analyze immunofluorescence samples. The simplest is the epifluorescence microscope (Figure 1) for which excitation of the fluorochrome and detection of the fluorescence are done through the same light path³. Because most of the excitation light is transmitted through the sample, only reflected excitatory light can reach the objective together with the emitted light. This approach unfortunately leadsto a frequent high signal to noise ratio.In contrast, confocal microscopy (Figure 2) offers a distinct advantage for increasing optical resolution and contrast by means of adding a spatial pinhole placed at the confocal plane of the lens to eliminate out-of-focus light⁴. This approach allows the reconstruction of three-dimensional structures from the obtained images. However, since an important fraction of the light from the sample is blocked at the pinhole, long exposures are often required.

There are two classes of immunofluorescence techniques, primary (or direct) and secondary (or indirect). Direct immunofluorescence involves a primary antibody linked with a fluorochrome (Figure 3). This method is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility¹. Moreover, such antibodies are generally harder to find commercially. On the other hand, the direct attachment of the fluorochrome to the antibody significantly reduces the number of steps in the procedure, saving time and frequently reducing non-specific background signal. This also limits the possibility of antibody cross-reactivty.

Indirect immunofluorescence involves a primary unlabelled antibody which is specific for the epitope of interest¹. A secondary antibody which carries the fluorochrome then recognizes the primary antibody and binds to it (Figure 3). Although indirect immunofluorescence is more complex and time consuming than direct immunofluorescence, it is frequently used because of its high sensitivity and it also provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In addition, a vast array of commercial secondary antibodies is available at affordable prices.

Hepatitis C virus (HCV) is a major public-health problem with 130-170 million individuals chronically infected worldwide. In order to halt the epidemic, therapy against HCV will need to be both effective and widely available. Studies focusing on safe and affordable natural product active against HCV have revealed the antiviral activity of the human Lactoferrin (hLF) protein which binds and neutralizes the circulating virion⁵. In the current study, investigation of hLF activity on the HCV subgenomic replicon system, which is independent from viral entry and shedding, revealed a distinct antireplicative activity of hLF against HCV. This manuscript presents a study in which immunofluorescence assays were performed to monitor the internalization of hLF, an important component of the immune system⁶, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus (HCV).

протокол

1. Клетки подготовки и обработки

1. В 24-луночный планшет, поставить стеклянную крышку в нижней части лунки. Промыть каждую лунку фосфатно-солевым буфером (PBS).
2. Семенной Ха-7 клетки, поддерживающие HCV субгеномного репликон в каждой лунке до плотности 5 × 10 ⁴ клеток / лунку. Если нет обработка сделать, клетки могут быть посеяны на более высокой плотностью. Культуральную среду Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 250 мг / мл G-418 (для поддержания репликон).
3. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО _2. На следующий день, лечения клеток с 3 мкМ чЛФ очищенного из грудного молока.

2. Параформальдегид / сахарозы Подготовка (12% СУП и 12% сахарозы)

1. Поместите 500 мл PBS в химический стакан и нагреть его в пределах от 20 ° С до 30 ° С. Растворить 60 г сахарозы в PBS в. Растворите 60 г paraformalвого альдегида (СУП) в растворе сахарозы / PBS. Медленно добавить NaOH 2N (от 3 до 7 мл) до получения прозрачного раствора.
2. Доведения рН до 7,4 с помощью HCl. Полный объем до 500 мл с PBS. Фильтр по тяжести на Ватман фильтра. Перед использованием разбавить раствор с PBS до конечной концентрации 4% PAF и 4% сахарозы (хранение 4 ° С в течение 1 недели максимум).

3. Иммунофлуоресценции

1. В нужное время (0 ч, 2 ч или 24 ч лечения), промыть клетки дважды (1 мин) с PBS и зафиксировать PBS / 4% PAF / 4% сахарозы в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки, как правило, на 30-40% слияния и 1.5X10 ^{5 клеток} используются.
2. Клетки проницаемыми с 0,15% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре и блок в 10% нормальной козьей сыворотки (NGS) в PBS в течение 20 мин.
3. Развести первичных антител из интересующего белка в 10% NGS (например: первичная мышиное анти-антитела чЛФ разводили 1: 1000). Применение первичное антитело к клеткам.
4. Через 4 ч при комнатной температуре или O /N при 4 ° С, промыть клетки три раза в течение 5 мин с 10% NGS. Пятно клетки с вторичным антителом, меченным флуорохромом, разведенного в 10% NGS (например: Флуорохром с длиной волны возбуждения 488 нм, связанного с антителом против мыши 1: 1000) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
5. Промыть клетки один раз в течение 5 мин с PBS и окрашивают клетки 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1 мкг / мл) в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
6. Промыть клетки дважды в течение 5 мин с PBS. Установить крышку очки на SlowFade монтажа среду до визуализации через микроскопии. Клетки готовы для анализа эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
7. Используйте различные элементы управления, чтобы обеспечить специфичность обнаружения. Например, все антитела могут быть опущены, чтобы обнаружить флуоресценции. Первичные антитела могут быть опущены, чтобы определить неспецифическое окрашивание вторичным антителом. Наконец, если это возможно, контролировать клеток или тканей, которые не делаютвыразить интерес молекула также могут быть использованы.
8. Представьте образцы, используя подходящий флуоресцентный микроскоп (эпифлуоресцентной или конфокальной) и наборы фильтров, подходящий для флуоресцентной метки используются. Слайды также могут быть сохранены в виде слайд-поле в <-20 ° C для последующего анализа.

4. флуоресцентной микроскопии

1. Держите образцы в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивания. Включите источник света выбранной микроскопом (эпифлуоресцентной или конфокальной).
2. Включите микроскопа. Включите камеру для микроскопа. Положите слайд на микроскопе для визуализации. Добавить иммерсионное масло на слайде, чтобы увеличить числовую апертуру объектива.
3. Выберите соответствующие фильтры. Отрегулируйте фокусировку и подходящий цели. Отрегулируйте жалюзи в целях выявления соответствующего флуорохром но предотвратить фотообесцвечивания. Держите накладные огни, чтобы минимизировать фоновый свет, глядя на образец.
4. Изменить йе фильтров для визуализации различных флуорохромов (например DAPI и для длине волны возбуждения 488 нм). Возьмите фотографии с камеры.

Результаты

Способность печени Ха-7 клеточной линии интернализации экзогенно администрируемых чЛФ контролировали с помощью иммунофлуоресценции на конфокальной miscroscope. чЛФ был добавлен в культуральной среде и интернализации давали в течение 24 ч, после чего внеклеточный чЛФ промывали PBS и остаточ?...

Обсуждение

Эпидемия гепатита остается глобальной угрозой, с 80% вновь инфицированных пациентов развивающихся хроническую инфекцию, положить их на риск цирроза, печеночной недостаточности или гепатоцеллюлярной карциномы. Прямого действия противовирусных препаратов, направленные репликацию HCV и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000