Hepatit C Virüsü Karşı İnsan laktoferrinin Hücresel Alımı ve İlişkili Antiviral Aktivite Monitör İmmünofloresan

Özet

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Özet

İmmünofloresan yaygın biyoloji birçok yönlerini incelemek için kullanılan bir laboratuar tekniğidir. Bu, tipik olarak hücre ve dokularda bir hedef moleküle dağılımı ve / veya lokalizasyonunu göstermek için kullanılır. Immunofluorescence bir hücre içinde bunlara karşılık gelen antijenlere karşı floresan etiketli antikorların özelliğine dayanır. Doğrudan ve dolaylı immünofloresans yaklaşımlarının florokrom bağlanmış antikorların kullanımına dayalı olan kullanılabilir. Bu alt sinyali sağlar yüksek maliyet ve daha az esneklik içerir çünkü direkt immünfloresan az sıklıkla kullanılmaktadır. Bunun aksine, dolaylı immunofluoresans daha yaygın olarak, çünkü, yüksek hassasiyet kullanılan birden fazla ikincil antikor, her birincil antikor eklemek çünkü güçlendirilmiş bir sinyal sağlar. Bu yazıda, Epifloresans mikroskobu ve konfokal mikroskopi hem insan laktoferrin içselleştirilmesi, bağışıklık önemli bir bileşeni izlemek için kullanıldıKaraciğer hücrelerine sistemi. Ayrıca, immünofloresan ile Hepatit C virüsünün hücre replikasyonu üzerindeki hLF önleyici potansiyelini izlenir. Hem bu yaklaşımların ile ilgili avantaj ve dezavantajları tartışılmıştır.

Giriş

Immunofluorescence is a technique that uses a fluorescence microscope to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in a biological sample. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell¹. It is typically used on tissue sections and cultured cell lines in order to analyze the distribution/localization of various biological molecules such as proteins, nucleic acids and glycans. It should be noted that immunofluorescence is often used in combination with other non-antibody methods of fluorescent staining such as the 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stains which are typically used to label DNA². Moreover, this technique involves fixation of the cells which allows the analysis of cells at a specific time.

Different types of microscopes can be used to analyze immunofluorescence samples. The simplest is the epifluorescence microscope (Figure 1) for which excitation of the fluorochrome and detection of the fluorescence are done through the same light path³. Because most of the excitation light is transmitted through the sample, only reflected excitatory light can reach the objective together with the emitted light. This approach unfortunately leadsto a frequent high signal to noise ratio.In contrast, confocal microscopy (Figure 2) offers a distinct advantage for increasing optical resolution and contrast by means of adding a spatial pinhole placed at the confocal plane of the lens to eliminate out-of-focus light⁴. This approach allows the reconstruction of three-dimensional structures from the obtained images. However, since an important fraction of the light from the sample is blocked at the pinhole, long exposures are often required.

There are two classes of immunofluorescence techniques, primary (or direct) and secondary (or indirect). Direct immunofluorescence involves a primary antibody linked with a fluorochrome (Figure 3). This method is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility¹. Moreover, such antibodies are generally harder to find commercially. On the other hand, the direct attachment of the fluorochrome to the antibody significantly reduces the number of steps in the procedure, saving time and frequently reducing non-specific background signal. This also limits the possibility of antibody cross-reactivty.

Indirect immunofluorescence involves a primary unlabelled antibody which is specific for the epitope of interest¹. A secondary antibody which carries the fluorochrome then recognizes the primary antibody and binds to it (Figure 3). Although indirect immunofluorescence is more complex and time consuming than direct immunofluorescence, it is frequently used because of its high sensitivity and it also provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In addition, a vast array of commercial secondary antibodies is available at affordable prices.

Hepatitis C virus (HCV) is a major public-health problem with 130-170 million individuals chronically infected worldwide. In order to halt the epidemic, therapy against HCV will need to be both effective and widely available. Studies focusing on safe and affordable natural product active against HCV have revealed the antiviral activity of the human Lactoferrin (hLF) protein which binds and neutralizes the circulating virion⁵. In the current study, investigation of hLF activity on the HCV subgenomic replicon system, which is independent from viral entry and shedding, revealed a distinct antireplicative activity of hLF against HCV. This manuscript presents a study in which immunofluorescence assays were performed to monitor the internalization of hLF, an important component of the immune system⁶, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus (HCV).

Protokol

1. Hücreler hazırlanması ve Tedavi

1. Bir 24-yuvalı plaka içinde, kuyu altındaki cam kapak koydu. Fosfat Tamponlu Salin (PBS), her kuyu yıkayın.
2. / Gözenek 5 x 10 ⁴ hücrelik bir yoğunlukta her oyukta bulunan HCV subgenomik replikon destekleyici Tohum Huh-7 hücreleri. Yapmak için hiçbir tedavi yoktur ise, hücreler daha yüksek bir yoğunlukta ekildi edilebilir. Kültür ortamı, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı 10% Dana Fetus Sığır Serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat ve 250 mg / ml G-418 (replikon korumak için) ile desteklenmiş (DMEM) 'dir.
3. 37 ° C'de inkübe edin ve% 5 CO _2. Bir sonraki gün, insan sütü saflaştırılmış hLF 3 uM hücrelerin tedavisi.

2. Paraformaldehit / Sakaroz hazırlanması (% 12 PAF ve% 12 sükroz)

1. 20 ° C ve 30 ° C arasına, bir beher içinde 500 ul PBS ml koyun ve ısıtın. PBS içinde sükroz: 60 g çözündürülür. Paraformal 60 g çözülürPBS / sükroz solüsyonunda feniltiyoasetaldehit (PAF). Yavaş yavaş berrak bir çözelti elde edilene kadar NaOH 2N (3 7 ml) ekleyin.
2. HCI ile 7.4'e pH ayarlayın. PBS ile 500 ml'ye tamamlayın hacmi. Whatman filtre üzerindeki yerçekimi ile Filtre. Kullanımdan önce,% 4 PAF ve% 4 sukroz (saklama 1 haftalık maksimum 4 ° C) bir son konsantrasyona PBS ile seyreltilir.

3. İmmünofloresan

1. İstenen zaman (0 saat, 2 saat ve 24 saat tedavi), PBS (1 dakika) hücreler iki kez yıkama ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS /% 4 PAF /% 4 sukroz ile sabitleyin. Hücreler 30-40% konfluansa tipik olarak ve 1.5x10 ⁵ hücreleri kullanılır.
2. 20 dakika boyunca PBS içinde% 10 normal keçi serumu (NGS) içinde, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.15 Triton X-100 ile hücreler ve blok geçirgenliği.
3. % 10 NGS daki proteinin birincil antikor seyreltilir (örneğin: 1000: Primer fare anti-hLF antikoru 1 seyreltilmiş). Hücrelere birincil antikor uygulayın.
4. Oda sıcaklığında veya O C'de 4 saat sonra /4 ° C 'de N,% 10 NGS ile 5 dakika boyunca hücreler üç kez yıkayın. % 10 NGS içinde seyreltilmiş fluorokrom ile etiketlenmiş sekonder antikor ile hücrelerin Leke (örneğin: bir florokrom, bir antikorun bir anti-fare 1 ile bağlantılı olan 488 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ile: 1000), karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
5. PBS ile 5 dakika boyunca bir kez hücreler yıkanır ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 ug / ml) ile hücrelerin leke.
6. PBS ile 5 dakika boyunca iki kez hücreleri yıkayın. Dağı mikroskobu ile görselleştirme önce Slowfade montaj orta gözlük kapsamaktadır. Hücreler artık Epifloresans veya konfokal mikroskobu ile analiz için hazırız.
7. Algılama özgünlüğünü sağlamak için farklı kontrolleri kullanın. Örneğin, tüm antikorlar otoflüoresan tespit etmek için göz ardı edilebilir. Birincil antikor, ikincil antikorun spesifik olmayan bir boyama belirlemek için göz ardı edilebilir. Mümkünse Nihayet, değil mi hücreleri ya da dokuları kontrolilgi konusu molekülün de kullanılabilir ifade eder.
8. Kullanılan floresan etiket için uygun uygun floresan mikroskop (Epifloresans veya konfokal) ve filtre setleri kullanarak örnekleri gözünüzde canlandırın. Slaytlar, aynı zamanda <-20 ° C sıcaklıkta daha sonra muayene bir slayt kutuda saklanabilir.

4. Floresan Mikroskopi

1. Photobleaching önlemek için karanlıkta örnekleri tutun. Seçilen mikroskobu (Epifloresans veya konfokal) ışık kaynağı açın.
2. Mikroskop açın. Mikroskop için Kamerayı açın. Görselleştirme için mikroskop slayt koyun. Objektif lens sayısal açıklık artırmak için slayt daldırma yağı ekleyin.
3. Uygun filtreleri seçin. Odağı ve uygun hedefi ayarlayın. Uygun florokrom algılamak ama photobleaching önlemek için kepenkleri ayarlayın. Numune bakarken arka plan ışığı en aza indirmek için havai ışıkları tutun.
4. Değişim incie filtreler (örneğin DAPI ve 488 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu için), çeşitli fluorochromes görselleştirmek için. Kamera ile fotoğraf çekme.

Sonuçlar

Dışsal olarak halde uygulanan hLF içselleştirmeye hepatik Huh-7 hücre hattının yeteneği konfokal miscroscope ile immünofloresan kullanılarak izlenmiştir. hLF kültür ortamına ilave edildi ve içselleştirme sonra, hücre dışı hLF PBS ile yıkanmış ve hLF bağlı kalan membran 5 dk tripsin tedavisi (1 mi) ile hazmedilmiştir, 24 saat süre ile bırakıldı. Hücreler yeniden tohumlandı ve immünofloresan boyama öncesi 18 saat yeniden yapışmaya bırakıldı. Sitoplazmik sınırları anlatabilmek içi...

Tartışmalar

HCV salgın siroz, karaciğer yetmezliği veya hepatosellüler karsinom riski koyarak, kronik enfeksiyon gelişen yeni enfekte hastaların% 80'i, küresel bir tehdit olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda iki NS3 N-terminal proteaz inhibitörleri (boseprevir ve Telaprevir) düzenleyici onayı ile gösterildiği gibi doğrudan etki eden HCV replikasyonu ve olgunlaşmasını hedefleyen antiviral ajanlar, başbakan anti-HCV ajanlardır. HLF, anti-HCV aktivitesi şu virionlar dolaşımdaki ve hepatoselüler hedef halin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000