La inmunofluorescencia para supervisar la captación celular de lactoferrina humana y su Asociado actividad antiviral contra el virus de hepatitis C

Resumen

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Resumen

La inmunofluorescencia es una técnica de laboratorio utilizada para estudiar muchos aspectos de la biología. Normalmente se utiliza para visualizar la distribución y / o localización de una molécula diana en células y tejidos. La inmunofluorescencia se basa en la especificidad de los anticuerpos marcados con fluorescencia contra sus correspondientes antígenos dentro de una célula. Ambos enfoques directos e indirectos de inmunofluorescencia se pueden utilizar que se basan en el uso de anticuerpos unidos con un fluorocromo. La inmunofluorescencia directa se utiliza con menos frecuencia, ya que proporciona señal inferior, implica mayor costo y menor flexibilidad. En contraste, inmunofluorescencia indirecta se utiliza más comúnmente debido a su alta sensibilidad y proporciona una señal amplificada desde más de un anticuerpo secundario se puede unir a cada anticuerpo primario. En este manuscrito, tanto microscopía de epifluorescencia y la microscopía confocal se usaron para monitorizar la internalización de la lactoferrina humana, un componente importante de la respuesta inmunesistema, en las células hepáticas. Además, monitoreamos el potencial inhibitorio de hLF en la replicación intracelular del virus de la hepatitis C mediante inmunofluorescencia. Ambos se discuten las ventajas y desventajas asociadas con estos enfoques.

Introducción

Immunofluorescence is a technique that uses a fluorescence microscope to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in a biological sample. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell¹. It is typically used on tissue sections and cultured cell lines in order to analyze the distribution/localization of various biological molecules such as proteins, nucleic acids and glycans. It should be noted that immunofluorescence is often used in combination with other non-antibody methods of fluorescent staining such as the 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stains which are typically used to label DNA². Moreover, this technique involves fixation of the cells which allows the analysis of cells at a specific time.

Different types of microscopes can be used to analyze immunofluorescence samples. The simplest is the epifluorescence microscope (Figure 1) for which excitation of the fluorochrome and detection of the fluorescence are done through the same light path³. Because most of the excitation light is transmitted through the sample, only reflected excitatory light can reach the objective together with the emitted light. This approach unfortunately leadsto a frequent high signal to noise ratio.In contrast, confocal microscopy (Figure 2) offers a distinct advantage for increasing optical resolution and contrast by means of adding a spatial pinhole placed at the confocal plane of the lens to eliminate out-of-focus light⁴. This approach allows the reconstruction of three-dimensional structures from the obtained images. However, since an important fraction of the light from the sample is blocked at the pinhole, long exposures are often required.

There are two classes of immunofluorescence techniques, primary (or direct) and secondary (or indirect). Direct immunofluorescence involves a primary antibody linked with a fluorochrome (Figure 3). This method is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility¹. Moreover, such antibodies are generally harder to find commercially. On the other hand, the direct attachment of the fluorochrome to the antibody significantly reduces the number of steps in the procedure, saving time and frequently reducing non-specific background signal. This also limits the possibility of antibody cross-reactivty.

Indirect immunofluorescence involves a primary unlabelled antibody which is specific for the epitope of interest¹. A secondary antibody which carries the fluorochrome then recognizes the primary antibody and binds to it (Figure 3). Although indirect immunofluorescence is more complex and time consuming than direct immunofluorescence, it is frequently used because of its high sensitivity and it also provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In addition, a vast array of commercial secondary antibodies is available at affordable prices.

Hepatitis C virus (HCV) is a major public-health problem with 130-170 million individuals chronically infected worldwide. In order to halt the epidemic, therapy against HCV will need to be both effective and widely available. Studies focusing on safe and affordable natural product active against HCV have revealed the antiviral activity of the human Lactoferrin (hLF) protein which binds and neutralizes the circulating virion⁵. In the current study, investigation of hLF activity on the HCV subgenomic replicon system, which is independent from viral entry and shedding, revealed a distinct antireplicative activity of hLF against HCV. This manuscript presents a study in which immunofluorescence assays were performed to monitor the internalization of hLF, an important component of the immune system⁶, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus (HCV).

Protocolo

1. Las células de Preparación y Tratamiento

1. En una placa de 24 pocillos, poner una tapa de vidrio en el fondo de los pozos. Lavar cada pocillo con tampón fosfato salino (PBS).
2. Semilla Huh-7 células de soporte replicón VHC subgenómico en cada pocillo a una densidad de 5 x 10 ⁴ células / pocillo. Si no existe ningún tratamiento para hacerlo, las células pueden ser sembradas a una densidad más alta. El medio de cultivo es medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM y 250 mg / ml de G-418 (para mantener el replicón).
3. Incubar a 37 ° C y 5% de CO _{2. El} día siguiente, el tratamiento de las células con 3 M de hLF purificada a partir de la leche humana.

2. El paraformaldehído / Preparación de sacarosa (12% PAF y 12% de sacarosa)

1. Poner 500 ml de PBS en un vaso de precipitados y se calienta entre 20 ° C y 30 ° C. Disolver 60 g de sacarosa en la PBS. Disolver 60 g de paraformaldehído (PAF) en el / solución de sacarosa PBS. Se añade lentamente NaOH 2 N (3 a 7 ml) hasta que se obtiene una solución clara.
2. Ajustar el pH a 7,4 con HCl. Volumen completa a 500 ml con PBS. Filtrar por gravedad sobre filtro Whatman. Antes de su uso, diluir la solución con PBS a una concentración final de 4% PAF y 4% de sacarosa (Almacenamiento 4 ° C durante 1 semana como máximo).

3. La inmunofluorescencia

1. En el momento deseado (0 hr, 2 hr o 24 h de tratamiento), lavar células dos veces (1 min) con PBS y se fijan con PBS / 4% PAF / 4% de sacarosa durante 20 min a RT. Las células son típicamente a 30-40% de confluencia y se utilizan de 1,5x10 ⁵ células.
2. Permeabilizar las células con 0,15% de Triton X-100 en PBS durante 5 min a RT y el bloque en 10% de suero normal de cabra (NGS) en PBS durante 20 min.
3. Diluir el anticuerpo primario de la proteína de interés en 10% NGS (ejemplo: ratón primaria anticuerpo anti-hLF diluyó 1: 1000). Aplicar el anticuerpo primario a las células.
4. Tras 4 horas a temperatura ambiente o O /N a 4 ° C, lavar las células tres veces durante 5 minutos con 10% NGS. Teñir las células con anticuerpo secundario marcado con fluorocromo diluidos en 10% NGS (ejemplo: Fluorocromo con una longitud de onda de excitación de 488 nm ligado a un anticuerpo anti-ratón 1: 1000) durante 1 hora a RT en la oscuridad.
5. Se lavan las células una vez por 5 min con PBS y teñir las células con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 mg / ml) durante 15 min a TA en la oscuridad.
6. Lavar las células dos veces durante 5 min con PBS. Monte cubre gafas en medio de montaje SlowFade antes de la visualización a través de microscopía. Las células están ahora listas para el análisis por epifluorescencia o microscopía confocal.
7. Utilizar diferentes controles para asegurar la especificidad de la detección. Por ejemplo, todos los anticuerpos pueden ser omitidos con el fin de detectar la autofluorescencia. El anticuerpo primario se puede omitir para determinar la tinción no específica por el anticuerpo secundario. Por último, si es posible, el control de células o tejidos que no lo hacenexpresar la molécula de interés también puede ser utilizado.
8. Visualice las muestras usando el microscopio de fluorescencia apropiada (epifluorescencia o confocal) y conjuntos de filtros apropiados para el marcaje fluorescente utilizado. Slides también se puede almacenar en una caja de portaobjetos a <-20 ° C para su posterior examen.

4. microscopía de fluorescencia

1. Mantener las muestras en la oscuridad para evitar photobleaching. Encienda la fuente de luz de un microscopio elegido (epifluorescencia o confocal).
2. Encienda el microscopio. Encienda la cámara para el microscopio. Poner la diapositiva en el microscopio para la visualización. Añadir aceite de inmersión en la diapositiva para aumentar la apertura numérica de la lente objetivo.
3. Seleccione los filtros adecuados. Ajuste el enfoque y objetivo apropiado. Ajuste las persianas a fin de detectar el fluorocromo apropiado, pero evitar photobleaching. Mantenga las luces del techo fuera para minimizar la luz de fondo cuando se mira en la muestra.
4. Cambiar ªfiltros de correo para visualizar diversos fluorocromos (por ejemplo, DAPI y para una longitud de onda de excitación de 488 nm). Tomar fotos con la cámara.

Resultados

La capacidad de la línea celular hepática Huh-7 para internalizar exógenamente administrada hLF se monitorizó mediante inmunofluorescencia en un miscroscope confocal. hLF se añadió al medio de cultivo y la internalización se dejó durante 24 horas, después de lo cual, hLF extracelular se lavó con PBS y la membrana residual unido hLF se degradó con un 5 min tratamiento con tripsina (1 ml). Las células se volvieron a sembrar y se dejan volver a adherir durante 18 h antes de la tinción de inmunofluorescencia. C...

Discusión

La epidemia del VHC sigue siendo una amenaza global, con el 80% de los pacientes recientemente infectados desarrollan una infección crónica, que los pone en riesgo de cirrosis, insuficiencia hepática o carcinoma hepatocelular. Por acción directa agentes antivirales dirigidas a la replicación del VHC y la maduración representan agentes anti-VHC primos, según lo demostrado recientemente por la aprobación reglamentaria de dos inhibidores de la proteasa NS3 N-terminal (Boceprevir y Telaprevir). La actividad anti-VHC...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000