استخدام الأنزيمية أجهزة الاستشعار لقياس الذاتية ATP أو H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; في الكلى

Oleg Palygin; Vladislav Levchenko; Louise C. Evans; Gregory Blass; Allen W. Cowley Jr.; Alexander Staruschenko

doi:10.3791/53059

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H₂O₂ in the kidney.

Abstract

وقد استخدمت على نطاق واسع أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية لقياس إشارات الخلية في الوقت الحقيقي. أكثر من استخدامها قد اقتصر على شرائح الدماغ والخلايا العصبية الثقافات. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطبيق هذه التكنولوجيا إلى الأجهزة كلها. وقد أحرز تقدم في تصميم أجهزة الاستشعار ممكن قياس الإشارات الخلوية في الكلى في الجسم الحي perfused الدم. تسرد البروتوكولات الحالية الخطوات اللازمة لقياس ATP وH _{2 O 2} الإشارات في الخلالي الكلى الفئران. وتستخدم تصميمين استشعار منفصلة للخارج الحي والبروتوكولات الجسم الحي. والمغلفة كلا النوعين من أجهزة الاستشعار مع biolayer الأنزيمية رقيقة فوق طبقة permselectivity لإعطاء الاستجابة بسرعة، أجهزة الاستشعار الحساسة وانتقائية. طبقة permselectivity يحمي إشارة من interferents في الأنسجة البيولوجية، وطبقة الأنزيمية تستخدم للتفاعل محفز متتابعة من كيناز الجلسرين والجلسرين-3-فوسأوكسيديز الفوسفات في وجود ATP لإنتاج H _{2 O 2.} مجموعة من أجهزة الاستشعار المستخدمة في السابق الدراسات المجراة الكشف عن مزيد من تحليلها عن طريق أكسدة H _{2 O 2 على} البلاتين / الايريديوم (PT-IR) سلك كهربائي. أجهزة الاستشعار للدراسات في الجسم الحي وتقوم بدلا من ذلك على الحد من H _{2 O 2 على} الوسيط الذهب المطلي القطب مصممة للالأنسجة perfused الدم. تم الكشف عن التغييرات تركيز النهائية amperometry الوقت الحقيقي تليها معايرة لتركيزات معروفة من تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، خصوصية إشارة amperometric يمكن التأكد من خلال إضافة الانزيمات مثل الكاتلاز وآبيراز التي كسر H _{2 O 2 و} ATP تبعا لذلك. هذه المجسات أيضا تعتمد بشكل كبير على المعايرة دقيقة قبل وبعد كل تجربة. البروتوكولات التاليين تضع دراسة كشف في الوقت الحقيقي من ATP وH ₂_O 2 في أنسجة الكلى، ويمكن تعديل أيضا على تمديد الطريقة الموصوفة لاستخدامها في المستحضرات البيولوجية الأخرى أو الهيئات كلها.

Introduction

وكانت أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمي (المشار إليها أيضا باسم أجهزة الاستشعار في هذا المخطوط) أداة قيمة لدراسة العمليات الإشارات الحيوية في الخلايا والأنسجة الحية. أجهزة الاستشعار بتوفير المزيد من قرار الزمني والمكاني من الخلايا الجزيئات يشير في تركيزات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. بدلا من أخذ العينات وتحليل سوائل خارج الخلية التي اتخذت في فترات على مدى فترات طويلة من الزمن، هذه المجسات تستجيب بالسرعة تتفاعل الانزيمات لتحليلها، وبالتالي إنتاج قياسات الوقت الحقيقي ^1،2. كشف سريع من تركيزات فراغي من العوامل autocrine ونظير الصماوي، مثل البيورينات أو بيروكسيد الهيدروجين، وديناميات الإفراج عنهم يمكن استخدامها لإنشاء لمحة عن آثار المخدرات في الظروف العادية والمرضية ^3. حاليا، كانت الغالبية العظمى من التطبيقات التي تستخدم أجهزة الاستشعار في الدماغ شرائح الأنسجة والثقافات خلية ^4-10. البروتوكولات بالتفصيل في هذا الهدف مخطوطة لوضع الوسائل لقياس تركيزات بدقة في الوقت الحقيقي من التحاليل في الكلى كلها.

وقد وضعت البروتوكولات التالية لدراسة ATP الخلالي وH _{2 O 2} الإشارات في الكلى. في البيئة المحلية في الكلى، وcatabolized خارج الخلية ATP بسرعة عن طريق ectonucleotidases الذاتية إلى مشتقاته (ADP، AMP والأدينوزين). أجهزة الاستشعار المستخدمة هنا هي انتقائية للغاية إلى ATP على البيورينات أخرى أو ATP منتجات التحلل ^11. وهذا يوفر ميزة كبيرة لأنها تتيح رصد دقيق لتركيزات ثابتة وديناميكية الإفراج ATP وظيفة إشارات لها. يتم قياس تركيز ATP الخلالي باستخدام مزيج من اثنين من الميكروية، جهاز استشعار ATP وجهاز استشعار لاغية. جهاز استشعار لاغية في تركيبة مع تطبيقات الكاتالاز قادر على كشف الخلالي H _{2 O 2} تركيزات ^12. البروتوكولات التالية تستخدم اثنين من تصاميم مختلفة من الحرفيRS التي لها خصائص الأمثل إما خارج الجسم الحي أو في التطبيقات الجسم الحي.

وتقوم كل من التصاميم على تفاعل محفز متتابعة من كيناز الجلسرين والجلسرين أوكسيديز-3-فوسفات الواردة في طبقة استشعار الأنزيمية وتحركها من وجود ATP. في مجموعة من أجهزة الاستشعار المستخدمة في السابق الدراسات المجراة، H _{2 O 2، وناتج} التفاعل الأنزيمي النهائي، تم الكشف عنها بواسطة الأكسدة على البلاتين / الايريديوم (PT-IR) سلك كهربائي. أجهزة استشعار للدراسات في الجسم الحي وتقوم بدلا من ذلك على H _{2 O 2} تخفيض على الوسيط الذهب المطلي القطب مصممة للالأنسجة perfused الدم. هو مبين في الشكل رقم 1 هو مخطط كل من البروتوكولات المذكورة في هذه المخطوطة. جهاز استشعار لاغية مطابق لالمقابل استشعار ATP لها إلا أنها تفتقر إلى الانزيمات ملزمة. لذلك، بالإضافة إلى الكشف عن H _{2 O 2} مع إنزيم الكاتلاز، والشرق الأوسط وأفريقيا استشعار لاغيةسورس التدخلات غير محددة. يتم حساب تركيزات ATP عن طريق طرح الكشف عن اغية التدخلات غير محددة وخلفية H _{2 O 2} من إشارة استشعار ATP. العديد من أجهزة الاستشعار وتتوفر أيضا تجاريا للكشف عن التحاليل الأخرى بما في ذلك الأدينوزين، ionosine، هيبوزانتين، أستيل كولين، الكولين، الصوديوم، الجلوكوز، اللاكتات، د-سيرين للخارج الحي التطبيقات أو الأدينوزين، ionosine، وهيبوزانتين في الجسم الحي عندما يقترن اغية المقابلة أجهزة الاستشعار.

قدرة جهاز استشعار للكشف عن أدق التحاليل تتوقف على ما قبل السليم والمعايرة ما بعد ^13. وهذا يضمن أن التحليل يمثل الانجراف في حساسية الاستشعار التي تحدث أثناء الاستخدام في الأنسجة البيولوجية. أجهزة الاستشعار يحمل مستودع من الجلسرين الذي يتم استخدام كاشف في التفاعلات الأنزيمية الاستشعار. إذا لم يتم استخدام أجهزة الاستشعار في حلول حمام تحتوي على الجلسرين، وسوف تزول مع الزمن. أقصر صمرات تسجيل مفيدة ضرورية للحد من انجراف استشعار ذلك الحين. استشعار بالإضافة إلى ذلك قاذورات التي كتبها البروتياز الذاتية وشظايا البروتين يمكن أن يقلل كثيرا من حساسية من أجهزة الاستشعار ^14.

المخطوطة الحالية تنص على استخدام أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية للخارج الحي والاستعدادات الكلى الجسم الحي. يوفر في الوقت الحقيقي تحليلها الكمي بتفاصيل غير مسبوقة من الإشارات الخلوية التي قد تكشف عن رؤى جديدة في آليات أمراض الكلى وكلاء الدوائية.

Protocol

إجراءات الحيوانات التالية انضمت إلى دليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم الحصول على موافقة مسبقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC).
وينبغي أن يتم استعراض تعليمات الشركة الاستشعار خلال تصميم التجربة وقبل استخدامها: ملاحظة. وباتباع هذه التعليمات تنتج أفضل النتائج عند استخدام أجهزة الاستشعار.

1. الاستشعار المعايرة

إعداد الحلول الأسهم الجديدة قبل بدء التجربة.
إنشاء مخزن وتحتوي على 10 ملي NaPi العازلة، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم MgCl _2، و 2 ملي الجلسرين. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. تخزين في 2-8 ° C.
باستخدام تركيز الأسهم ATP (100 ملم) المخزنة في -20 ° C، إنشاء الطازجة 10 ملي ATP حل المعايرة عن طريق إضافة الأوراق المالية 10 ميكرولتر إلى 90 ميكرولتر من العازلة A.
ترطيب استشعار ATP عن طريق وضع طرفها (الشكل 2) في رانه الإماهة غرفة تحتوي على مخزن A لمدة 10 دقيقة على الأقل في 2-8 ° C.
ملاحظة: بعد الإماهة، لا ينبغي أن يتعرض أجهزة الاستشعار في الهواء لأكثر من 20 ثانية أو ربما يتم تخفيض حساسية الاستشعار. إذا كان متوقعا التعرض الطويل للهواء، وتراجع استشعار لفترة وجيزة في حل من الجلسرين. ويمكن استخدام أجهزة الاستشعار لتجارب متعددة ولكن هذه يجب أن تحدث في نفس اليوم الذي استشعار الإماهة. يمكن تخزين أجهزة الاستشعار في غرفة الإماهة مع العازلة A لمدة تصل إلى 24 ساعة.
بدوره على قناة potentiostat المزدوج (الشكل 3) وبدء برنامج نظام التسجيل.
إعداد غرفة المعايرة مع 3 مل من العازلة A. مكان القطب المرجعية في غرفة المعايرة. اتخاذ كل أجهزة الاستشعار من غرفة الإماهة، ثم إرفاقه مناور وأدخله في حل غرفة المعايرة.
ملاحظة: استخدام سيليكون المغلفة طبق بتري القياسية باعتباره غرفة المعايرة. تنفيذ جميع المعايرة والحادي والعشرينudies في قفص فاراداي على طاولة الهواء المختبر عالية الأداء للحد من الضوضاء إشارة خلال التسجيلات amperometry (الشكل 4). المعايرة تتم الأفضل أقرب إلى بدء جمع البيانات ممكن. لتقديم الطلبات في الجسم الحي الوقت الأمثل للمعايرة وخلال فترة النقاهة بعد جراحة الحيوان.
فيفو السابقين المعايرة
1. أداء voltammetry دوري في غرفة المعايرة من قبل ركوب الدراجات أجهزة الاستشعار من -500 إلى +500 بالسيارات بالسيارات بمعدل 100 فولت / ثانية لمدة 10 دورات. هذا يحسن كثيرا من حساسية من أجهزة الاستشعار. انظر الشكل 5 للآثار لوحظ من 10 دورات.
2. استقطاب أجهزة الاستشعار ل+600 بالسيارات بعد الدورة الأخيرة. وأجهزة الاستشعار الحالية الاضمحلال إلى الخط المقارب. ويتحقق القراءة ثابتة بعد مدة لا تقل عن 5 دقائق. تسجيل القراءة الصفر.
في الجسم الحي معايرة أجهزة الاستشعار
1. عدم تنفيذ voltammetry دوري على المجراة الحرفيروبية. بدلا من ذلك، استقطاب أجهزة الاستشعار في غرفة المعايرة لمدة 30 ثانية إلى +500 بالسيارات. ثم تعيين potentiostat إلى 0 بالسيارات والسماح للاستشعار الحالي ليرتفع إلى الخط المقارب. وأجهزة الاستشعار الحالية تأخذ 2 دقيقة على الأقل إلى الخط المقارب. تسجيل القراءة الصفر.
على التوالي إضافة كميات محددة من حل ATP الى غرفة لإنتاج خط معايرة تضم مجموعة الكشف المطلوب. الحل ATP تنتج ذروة حادة في إشارة الاستشعار في البداية، تليها تسوس كما ينشر على ATP بالتساوي في جميع أنحاء الغرفة. قيم الإشارات سجل مرة واحدة على مستوى إشارة قد استقرت بعد كل إضافة للاعبي التنس المحترفين. أرقام 6A و 7 تظهر آثار واقترح تركيزات ATP لكل من خارج الجسم الحي والدراسات المجراة على التوالي.
ملاحظة: من المهم للتأكد من الانتقائية من الأقطاب الكهربائية باستخدام الزبالين من التحاليل. هذا البروتوكول يستخدم آبيراز لاختبار خصوصية استشعار ATP والكاتالاز لH <دون> 2 O ₂ إشارة (أرقام 6B). إذا الأدوية على أن تدار، ينبغي تحديد قياسات للتفاعل مع أجهزة الاستشعار قبل الدراسة.
إضافة 3 ميكرولتر من آبيراز من مخزون من 2 ملغ / مل (89 UN / ملغ) لاختبار خصوصية استشعار ATP (التيار تنتجها تطبيق ATP أن تخفض إلى مستوى الصفر (الشكل 7).
إضافة 3 ميكرولتر من الكاتلاز من مخزون من 2mg / مل (100 UN / ملغ) لاختبار خصوصية من أجهزة الاستشعار لاغية (التيار التي تنتجها H _{2 O 2} التطبيق يجب أن تخفض إلى القراءة صفر).

2. جراحة الحيوان للدراسات الاستشعار

عملية جراحية لخارج الجسم الحي
1. تخدير الحيوان التجريبي مع isoflurane (5٪ تحريض، 1،5-2،5٪ الصيانة) / الصف O الطبية ₂ أو طريقة أخرى وافق ¹⁵ 'يجب أن تراقب ¹² الحيوانات بشكل مستمر لضمان مستوى مناسب من التخدير. سانتتستخدم قادرة التنفسي رد الفعل معدل وقرصة أخمص قدميه لتأكيد التخدير المناسب.
  ملاحظة: الموت ببطء الحيوان وفقا لبروتوكولات IACUC المعتمدة. عند الانتهاء من جميع إجراءات عدم البقاء على قيد الحياة والموت ببطء الحيوانات الخدر بعمق بضع الصدر حمل استرواح الصدر للتأكد من زوال إنسانية لهذا الحيوان ^12.
2. وضع الفئران على طاولة العمليات الجراحية التي تسيطر عليها درجة الحرارة في موقف ضعيف. مع الحفاظ على عمق التخدير المناسبة، وجعل شق خط الوسط من حوالي 5 سم وذلك تمشيا مع الكلية اليسرى وفضح الشريان الأورطي البطني البعيدة.
3. لف رباط حول الاضطرابات الهضمية والشرايين المساريقي العلوي، والشريان الأورطي البطني فوق هذه الشرايين ولكن لا ligate. التفاف اثنين من الأربطة حول الشريان الأورطي البطني تحت الشرايين الكلوية.
4. المشبك الشريان الأورطي البطني فوق الحروف المركبة. ربط انخفاض رباط. يقثطر الشريان الأورطي البطني مع أنابيب البولي ايثيلين (PE50). تأمين القسطرة مع ربطة الشريان الأورطي الثاني.
5. إزالة المشبك وligate المساريقي والاضطرابات الهضمية الشرايين. يروي الكلى في 6 مل / دقيقة مع هانكس محلول الملح المتوازن في RT لمدة 2-3 دقيقة حتى يتم المقشر الكلى تماما.
6. استئصال الكلى والقسطرة، متصلة جزء من الشريان الأورطي. وضع الكلى إلى 3 مل طبق بتري مملوءة بمحلول حمام.
  ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها بروتوكول التجربة في RT. يحتوي الحل حمام في ملي: 145 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 2 MgCl _2، 1 CaCl _2، 10 HEPES، ودرجة الحموضة 7.35 تعديلها مع هيدروكسيد الصوديوم.
عملية جراحية لفي الجسم الحي
1. تخدير الفئران باستخدام بروتوكولات IACUC المعتمدة. لفي الجسم الحي تحليل تخدير الفئران مع الكيتامين (20 ملغ / كغ IM) وinactin (50 ملغ / كغ الملكية الفكرية). يجب مراقبة الحيوانات باستمرار لضمان مستوى مناسب من التخدير. وتستخدم مجموعة مستقرة التنفسي رد الفعل معدل وقرصة أخمص قدميه لتأكيد التخدير المناسب.
2. بعد عمق التخدير الصحيح هو الحصول علىالطبعه، وضع الفئران في موقف ضعيف على سطح الارض يمكن التحكم بدرجة حرارته تقع على الطاولة الهواء. وينبغي مسخن المياه السطحية والحفاظ على 36 ° C.
3. مع الحفاظ على عمق التخدير المناسبة، وجعل شق خط الوسط حوالي 5 سم وذلك تمشيا مع الكلى.
4. استخدام الخيط قدرة على الصمود وترسيخ الأنسجة الجلدية وتحت الجلد بحيث الكلى بالكامل مرئيا. وضع الكلى في كوب الكلى للحد من أي حركة القطع الأثرية.
5. استخدام ضخ الرابع من 2٪ BSA: 0.9٪ كلوريد الصوديوم في 1 مل / 100 ز / ساعة عبر الوريد الوداجي للحفاظ على حجم الدم. يقني؛ يدخل القنية كل من الحالب لجمع البول. العلاقات مكان حول المساريقي والاضطرابات الهضمية الشرايين متفوقة وأبهري البعيدة للتلاعب ضغط التروية الكلوي (أرقام 10A).
6. إذا كان مطلوبا تطبيق كلاء الدوائية خلال التجارب المجراة، يوصى بإدخال قسطرة الخلالي (أرقام 10B ).

الإعداد 3. الحصول على البيانات

فتح البرنامج الحصول على البيانات وتحديد قطبية لها على حد سواء خارج الجسم الحي وفي التجارب المجراة على بأكسيد الألومنيوم إيجابي. وضع برنامج لحفظ البيانات كرمز ASCII.
ضع micromanipulators لالإدراج السريع للأجهزة الاستشعار في الكلى.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم التحقيق وهمية تعلق على micromanipulator للمساعدة في تحقيق موضع المطلوب من أجهزة الاستشعار.
فيفو السابقين الحصول على البيانات
1. يروي الكلى مع الحل حمام (من 2.1.6) عن طريق الشريان الأورطي مقنى بمعدل ثابت من 650 ميكرولتر / دقيقة. باستخدام مقص جراحي، وإزالة بعناية الكبسولة الكلى، وهو أمر ضروري لإدخال جهاز الاستشعار.
2. تأمين الكلى مع الأربطة المطاطية مربوطة على الكلى وتعلق على طبق المغلفة سيليكون مع دبابيس.
3. وضع القطب إشارة على مقربة من الكلى في طبق بتري مع طرفها المغمورة فيحل العازلة.
في الحصول على البيانات الجسم الحي
1. وضع الكلى في كوب الكلى. اعتمادا على سلالة وعمر الحيوان استخدام حجم الكأس التي يحمل الكلى فضفاضة الشكل 8 عروض بمرتين من الكؤوس الكلى. تستخدم أكواب مماثلة للنهج الفسيولوجية المختلفة التي تركز على تحليل وظائف الكلى مثل بزل مجهري الخ ^16.
  ملاحظة: إن موقف كوب الكلى أمر بالغ الأهمية لإزالة الضوضاء الميكانيكية التي تنتجها التنفس الحيوان، ولكن لا ينبغي أن تتداخل مع أو منع نضح الكلى أو تدفق البول.
2. سماح 45 دقيقة من وقت الانتعاش قبل تنفيذ جمع البيانات.
3. باستخدام إبرة 26-30G، وجعل ثقب ثقب في الموقع المطلوب وعمق من أجهزة الاستشعار في الكلى. وصمة عار ثقب السطح لإزالة الدم ناضح. إضافة حل الجلسرين على سطح الكلى. وهذا يمنع السطح الكلى من الجفاف أثناء التجربة.
4. إزالة أول مستشعر من غرفة الإماهة وإرفاقه micromanipulator. بسرعة، في غضون 20 ثانية، وإدراج القطب في الحفرة التي تم إنشاؤها حديثا في الكلى. كرر الخطوات من 3،5-3،9 لاستشعار فارغة.
5. إدراج القطب المرجعية في الكلى، ما يقرب من 1 سم من من أجهزة الاستشعار.
بدوره على potentiostat وتفعيل برنامج تسجيل على الكمبيوتر. الشكل 9 يظهر الإعداد النهائي للخارج الحي الحصول على البيانات الكلى. يوضح الشكل 10 الإعداد النهائي للحصول على البيانات الكلى في الجسم الحي مع القسطرة المدرجة.

تحليل 4. البيانات

استيراد ملف بيانات ASCII إلى المنشأ أو أي برامج أخرى مماثلة.
تركيز العلاقة الحالية
1. استخدام الخطية وظيفة تناسب / استقراء لبناء تركيز الخطي (محور السينية) للتيار (ص -axis) علاقة للATP أو H ₂ نقطة _O 2 المعايرة (أرقام 6 و 7).
  خطي خط مناسبا: ص = MX + ب
مساواة التيار الى تركيز
طرح آثار يقاس من أجهزة الاستشعار لاغية من تلك من أجهزة الاستشعار ATP للحصول على التيار الفعلي التي تنتجها ATP داخل الخلايا.
تحويل القيم ATP في السلطة الفلسطينية التي حصلت عليها amperometry إلى نانومتر باستخدام معادلة المعايرة بالتفصيل في 4.2.1. تحديد تركيز التتبع البيانات تطرح من أجهزة الاستشعار ATP عن طريق استيراد كل تيار المعدل في "س" قيمة وحل لص (تركيز الحليلة).
وبالمثل، حساب H _{2 O 2} تركيز من معادلة المعايرة لها إذا لزم الأمر.

النتائج

تصميم مسرى مكروي جهاز الاستشعار البيولوجي الأنزيمية يسمح للكشف في الوقت الحقيقي من التحاليل في الكلى كلها. ويتضح تصميم تجربة العام إما خارج الجسم الحي أو الدراسات المجراة في الشكل 1. وأجهزة الاستشعار المستخدمة وتختلف الإجراءات الجر?...

Discussion

وقد وضعت البروتوكولات الحالية لتعزيز والقرار الزماني والمكاني للATP وH _{2 O 2} الإشارات على الكلى-perfused الدم خارج الجسم الحي معزولة، perfused والحية. الاختلافات بين البروتوكولات وأجهزة الاستشعار المستخدمة هنا توفر الحصول على البيانات الأمثل لأي كلاء الدوائية...

Disclosures

قدمت أجهزة استشعار لتسجيل الفيديو من هذه المخطوطة التي كتبها ساريسا الطبية المحدودة (كوفنتري، المملكة المتحدة).

Acknowledgements

نحن نقدر ساريسا الطبية الحيوية لعملهم في تطوير أجهزة الاستشعار المستخدمة في هذا المخطوط. وأيد هذا البحث من قبل الوطني للقلب والرئة والدم المعهد يمنح HL108880 (A. Staruschenko)، HL 116264 (A. كاولي) وHL 122662 (A. Staruschenko وA. كاولي)، وهو مشروع ممول من كلية الطب في لجنة شؤون البحث العلمي ويسكونسن # 9306830 (O. Palygin) والنهوض و# برنامج البحوث والتعليم صحة ويسكونسن 9520217، والباحث الصغير منحة من مؤسسة الوطنية للكلى (O. Palygin).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensor Kit	Sarissa Biomedical	SBK-ATP-05-125	The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-ATP-05-125	store at 2-8 ^oC before use
Sarissagold ATP Biosensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-ATP-10-50	store at 2-8 ^oC before use
Sarissaprobe null sensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-NUL-20-125	store at 2-8 ^oC before use
Sarissagold null sensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-NUL-10-50	store at 2-8 ^oC before use
Sarissaprobe ATP Manual	Sarissa Biomedical		http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage	TMC
Dual channel potentiostat	Digi-Ivy	DY2021	Type II Faraday cage
Data acquisition program	Digi-Ivy	DY2000
Perfusion pump	Razel Scientific Instruments	Model R99E
Fiber optic illuminator	Schott	ACE 1
micromanipulator	Narishige	MM-3
micromanipulator magnetic stand	Narishige	GJ-8
air table	TMC	63-500
isoflurane ventilator	LEI Medical	M2000
3 ml petri dish	Fisher Scientific	S3358OA
needle	Santa Cruz		26-30 G
pins			Standard dissection pins
catheter			Polyethylene tubing (PE50)
catheter tissue glue	Vetbond	1469SB
suture	Look	SP117
rubber bands			any 2-4 mm wide rubber bands
silicone	Momentive	RTV-615 Clear 1#
clamp	Fine Science Tools	18052-03
standard dissection kit			Kit should include scalpel and dissection sissors
Kidney Cup			Of own design
standard chemicals	Sigma-Aldrich
ATP	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO	100 mM ATP solution
hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	216763
glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Apyrase	Sigma-Aldrich	A7646
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
isoflurane	Clipper	10250
inactin	Sigma-Aldrich	T133
ketamine	Clipper	2010012
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco	14025092

References

Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -. L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

104 ATP H 2 O 2 amperometry purinergic

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

استخدام الأنزيمية أجهزة الاستشعار لقياس الذاتية ATP أو H

In This Article