El uso de biosensores para cuantificar enzimática endógena ATP o H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; En el riñón

Resumen

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H₂O₂ in the kidney.

Resumen

Biosensores enzimáticos de microelectrodos han sido ampliamente utilizados para medir la señalización extracelular en tiempo real. La mayor parte de su uso se ha limitado a secciones de cerebro y cultivos de células neuronales. Recientemente, esta tecnología se ha aplicado a los órganos enteros. Los avances en el diseño del sensor han hecho posible la medición de la señalización celular en vivo en los riñones perfundidos con sangre. Los actuales protocolos enumeran los pasos necesarios para medir el ATP y H _{2 O 2} de señalización en el intersticio de riñón de rata. Dos diseños de sensores separados se utilizan para la ex vivo y en los protocolos in vivo. Ambos tipos de sensor se recubren con una capa biológica enzimática delgada en la parte superior de una capa de permeabilidad selectiva para dar respondieron rápido, biosensores sensibles y selectivos. La capa permselectividad protege la señal de los interferentes en el tejido biológico, y la capa enzimática utiliza la reacción catalítica secuencial de glicerol quinasa y glicerol-3-phosfosfato oxidasa en presencia de ATP para producir H ₂ O _2. El conjunto de sensores utilizados para los estudios ex vivo detecta más analito mediante la oxidación de H _{2 O 2} en un platino / iridio (Pt-Ir) electrodo de alambre. Los sensores para los estudios in vivo se basan en su lugar la reducción de H ₂ O ₂ en un electrodo de oro mediador recubierta diseñada para el tejido perfundido con sangre. Cambios concentración final son detectados por amperometría en tiempo real seguido de calibración para concentraciones conocidas de analito. Además, la especificidad de la señal amperométrica se puede confirmar mediante la adición de enzimas como la catalasa y la apirasa que descomponen H ₂ O ₂ y ATP correspondientemente. Estos sensores también se basan en gran medida en las calibraciones precisas antes y después de cada experimento. Los dos protocolos siguientes establecen el estudio de la detección en tiempo real de ATP y H ₂O ₂ en los tejidos renales, y puede ser modificado adicionalmente para extender el método descrito para su uso en otras preparaciones biológicas u órganos enteros.

Introducción

Biosensores microelectrodos enzimática (También denominada sensores en el presente manuscrito) han sido una herramienta valiosa para el estudio de procesos de señalización dinámica en las células y tejidos vivos. Los sensores proporcionan una mayor resolución temporal y espacial de las moléculas de señalización celular en concentraciones biológicamente relevantes. En lugar de toma de muestras y el análisis de los fluidos extracelulares tomadas a intervalos durante largos períodos de tiempo, estos sensores responden tan rápido como sus enzimas reaccionan con el analito, produciendo de ese modo mediciones en tiempo real ^1,2. Detección rápida de las concentraciones intersticiales de factores autocrinos y paracrinos, como purinas o el peróxido de hidrógeno, y la dinámica de su liberación se puede utilizar para establecer un perfil de los efectos de las drogas en condiciones normales y patológicas ^3. En la actualidad, la mayoría de las aplicaciones que utilizan sensores de haber estado en cortes de tejido del cerebro y cultivos celulares ^4-10. Los protocolos detallados en este objetivo manuscrito aestablecer los medios para medir con precisión las concentraciones en tiempo real de analitos en los riñones enteros.

Los siguientes protocolos se desarrollaron para estudiar ATP intersticial y H _{2 O 2} de señalización en los riñones. En el entorno natural de los riñones, el ATP extracelular se cataboliza rápidamente por ectonucleotidasas endógenos en sus derivados (ADP, AMP y adenosina). Los sensores utilizados aquí son muy selectivos a la ATP sobre otras purinas o productos de degradación de ATP ^11. Esto ofrece una gran ventaja, ya que permite la monitorización precisa de las concentraciones constantes y dinámicos de la liberación de ATP y su función de señalización. La concentración de ATP intersticial se mide usando la combinación de dos microelectrodos, un sensor de ATP y un sensor de Null. El sensor de Null en combinación con aplicaciones de catalasa es capaz de detectar intersticial H ₂ O ₂ concentraciones ^12. Los siguientes protocolos utilizan dos diseños diferentes de sensors que tienen características óptimas para ya sea ex vivo o in vivo. aplicaciones

Ambos diseños se basan en la reacción catalítica secuencial de glicerol quinasa y glicerol oxidasa-3-fosfato contenida en una capa enzimática del sensor y está impulsado por la presencia de ATP. En el conjunto de sensores utilizados en los estudios ex vivo, H _{2 O 2,} el producto final de reacción enzimática, se detecta por oxidación en un platino / iridio (Pt-Ir) electrodo de alambre. Sensores para estudios in vivo en cambio se basan en H _{2 O 2} reducción en un electrodo de oro mediador recubierto diseñado para el tejido perfundido con sangre. Se muestra en la Figura 1 es un esquema de ambos protocolos descritos en este manuscrito. El sensor Null es idéntica a su sensor de ATP correspondiente, excepto que carece de las enzimas unidas. Por lo tanto, además de la detección de H ₂ O ₂ con la enzima catalasa, la mea sensor NullSures interferencias no específicas. Concentraciones de ATP se calculan restando el Null detecta interferencias no específicas y fondo H _{2 O 2} de la señal del sensor de ATP. Varios sensores también están disponibles comercialmente para detectar otros analitos incluyendo adenosina, ionosine, hipoxantina, la acetilcolina, colina, glutamato, glucosa, lactato, D-serina para aplicaciones ex vivo o adenosina, ionosine, e hipoxantina para in vivo cuando se combina con el Null correspondiente sensor.

La capacidad del sensor para detectar con precisión analitos depende de la pre adecuada y calibraciones posteriores ^13. Esto asegura que el análisis representa la deriva en la sensibilidad del sensor que se produce durante el uso en los tejidos biológicos. El sensor tiene un depósito de glicerol que se utiliza como reactivo en las reacciones enzimáticas del sensor. Si el sensor no se utiliza en soluciones de baño que contiene glicerol, que se lave con el tiempo. Shorter rtiempos ecording son entonces necesarias para minimizar la deriva del sensor. Además del sensor de ensuciamiento por proteasas endógenas y los fragmentos de proteínas puede disminuir en gran medida la sensibilidad de los sensores ^14.

El presente manuscrito establece el uso de microelectrodos de biosensores enzimáticos para ex vivo e in vivo en forma de preparados de riñón. Cuantificación de analitos en tiempo real ofrece un detalle sin precedentes de la señalización celular que puede revelar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de las enfermedades renales y agentes farmacológicos.

Protocolo

Los siguientes procedimientos con animales adheridos a la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La aprobación previa se obtuvo de el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC).
NOTA: Revisión de las instrucciones del fabricante del sensor se debe hacer durante el diseño de experimento y antes de su uso. Siguiendo estas instrucciones producirá resultados óptimos al utilizar los sensores.

1. Calibración del sensor

1. Prepare nuevas soluciones madre antes del inicio del experimento.
2. Crear Tampón A que contiene 10 mM de tampón NaPi, NaCl 100 mM, 1 mM de MgCl _2, y glicerol 2 mM. Ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH. Almacenar a 2-8 ° C.
3. Utilizando una concentración de solución madre de ATP (100 mM) se almacena a -20 ° C, crear una solución de calibración fresca 10 mM ATP mediante la adición de 10 l de stock a 90 l de tampón A.
4. Rehidratar el sensor de ATP mediante la colocación de la punta (Figura 2) en tél cámara de rehidratación que contiene tampón A por lo menos durante 10 minutos a 2-8 ° C.
   NOTA: Después de la rehidratación, los sensores no debe ser expuesto al aire durante más de 20 segundos o la sensibilidad del sensor puede ser reducida. Si se anticipan largas exposiciones al aire, sumergir el sensor brevemente en una solución de glicerol. Los sensores pueden ser utilizados para múltiples experimentos pero estos deben ocurrir en el mismo día como la rehidratación sensor. Los sensores pueden ser almacenados en la cámara de rehidratación con Tampón A para un máximo de 24 hr.
5. Encienda el potenciostato de doble canal (Figura 3) e iniciar el software del sistema de grabación.
6. Preparar una cámara de calibración con 3 ml de tampón A. colocar el electrodo de referencia en la cámara de calibración. Tome cada sensor de la cámara de rehidratación, a continuación, colóquelo en el manipulador y la inserta en la solución de cámara de calibración.
   NOTA: Utilice una silicona recubierto plato de petri estándar como una cámara de calibración. Llevar a cabo todas las calibraciones y studies en una jaula de Faraday en una mesa de aire de laboratorio de alto rendimiento para reducir el ruido de la señal durante las grabaciones amperometría (Figura 4). Las calibraciones se hacen mejor lo más cerca del inicio de la recolección de datos posible. Para aplicaciones en vivo el momento óptimo para la calibración es durante el período de recuperación después de la cirugía animal.
7. Ex vivo de calibración
   1. Realizar voltametría cíclica en la cámara de calibración en bicicleta a los sensores de -500 mV a 500 mV a una velocidad de 100 mV / s durante 10 ciclos. Esto mejora en gran medida la sensibilidad de los sensores. Consulte la Figura 5 para las huellas observadas a partir de los 10 ciclos.
   2. Polarizar los sensores a 600 mV después del último ciclo. La corriente del sensor decaerá a una asíntota. Una lectura constante se logra después de un mínimo de 5 min. Registre la lectura de cero.
8. En la calibración del sensor vivo
   1. No realice la voltametría cíclica en el in vivo sensors. En su lugar, polarizar el sensor en la cámara de calibración para 30 seg a 500 mV. A continuación, establezca el potenciostato a 0 mV y deje que el sensor de corriente a la altura de una asíntota. La corriente del sensor tomará por lo menos 2 minutos para asíntota. Registre la lectura de cero.
9. Añadir consecutivamente cantidades fijas de solución de ATP en la cámara para producir una línea de calibración que abarca un rango de detección deseada. La solución ATP produce un pico agudo en la señal del sensor inicialmente, seguido por un decaimiento como difumina la ATP de manera uniforme en toda la cámara. Valores de la señal de registro una vez que el nivel de la señal se ha estabilizado después de cada adición de ATP. Figuras 6A y 7 muestran rastros y sugirió concentraciones de ATP, tanto ex vivo y los estudios in vivo, respectivamente.
   NOTA: Es importante para confirmar la selectividad de los electrodos mediante el uso de eliminadores de los analitos. El presente protocolo utilizado apirasa para poner a prueba la especificidad del sensor de ATP y catalasa para la H _{2 O 2 de la señal (Figuras 6B). Si los medicamentos se administran, las mediciones de su reactividad con los sensores se deben determinar antes del estudio.}
10. Añadir 3 l de apirasa de un stock de 2 mg / ml (89 UN / mg) para poner a prueba la especificidad del sensor de ATP (la corriente producida por la aplicación de ATP debe reducir hasta el nivel cero (Figura 7).
11. Añadir 3 l de catalasa de un stock de 2 mg / ml (100 UN / mg) para poner a prueba la especificidad del sensor nula (la corriente producida por H _{2 O 2 aplicación} debería reducir a la lectura de cero).

2. Cirugía Animal de Estudios de sensores

1. Cirugía para la ex vivo
   1. Anestesiar el animal experimental con isoflurano (5% de inducción, de 1,5 a 2,5% de mantenimiento) / grado O médica ₂ u otro método aprobado. ^{15 '12} Los animales deben ser monitoreados continuamente para garantizar un nivel adecuado de anestesia. Sttasa de reacción y de los pies pizca respiratoria capaz se utilizan para confirmar la anestesia adecuada.
      Nota: La eutanasia del animal de acuerdo con los protocolos del IACUC aprobados. A la finalización de todos los procedimientos no-supervivencia eutanasia a animales profundamente anestesiados por toracotomía inducir neumotórax para asegurar la desaparición humanitario de los animales ^12.
   2. Coloque la rata en una mesa quirúrgica con control de temperatura en una posición supina. Mientras se mantiene una profundidad anestésica adecuada, hacer una incisión en la línea media de aproximadamente 5 cm en línea con el riñón izquierdo y exponer la aorta abdominal distal.
   3. Envuelva una ligadura alrededor del celíaco y las arterias mesentérica superior y la aorta abdominal por encima de estas arterias pero no ligar. Envolver dos ligaduras alrededor de la aorta abdominal por debajo de las arterias renales.
   4. Sujete la aorta abdominal por encima de las ligaduras. Ate la ligadura inferior. Cateterizar la aorta abdominal con tubo de polietileno (PE50). Asegure el catéter con la segunda ligadura aorta.
   5. Retire la abrazadera y ligar las arterias mesentéricas y celíacos. Perfundir el riñón a 6 ml / min con Hanks Balanced Salt Solution a TA durante 2-3 min hasta que el riñón está completamente palideció.
   6. Extirpar el riñón y el catéter, conectado porción de la aorta. Coloque el riñón en una placa de Petri de 3 ml lleno de solución del baño.
      Nota: protocolo de experimento se puede realizar a temperatura ambiente. La solución del baño contiene en mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 _MgCl 2, 1 CaCl _2, 10 HEPES, pH ajustado con NaOH 7,35.
2. Cirugía en in vivo
   1. Anestesiar la rata utilizando protocolos IACUC aprobados. Para el análisis in vivo anestesiar las ratas con ketamina (20 mg / kg IM) y inactina (50 mg / kg ip). Los animales deben ser controlados continuamente para garantizar un nivel adecuado de anestesia. Una reacción tasa y puntera pizca respiratoria estable se utiliza para confirmar la anestesia adecuada.
   2. Después de la profundidad de anestesia adecuada es obtenered, coloque la rata en una posición supina sobre una superficie a tierra de temperatura controlada situado en la mesa de aire. La superficie debe ser precalentado y se mantiene a 36 ° C.
   3. Mientras se mantiene la profundidad anestésica adecuada, hacer una incisión en la línea media de aproximadamente 5 cm en línea con el riñón.
   4. Utilice una sutura para desviar y anclar el tejido cutáneo y subcutáneo de manera que todo el riñón es visible. Coloque el riñón en una taza de riñón para minimizar los artefactos de movimiento.
   5. Utilice una infusión IV de 2% BSA: 0,9% de NaCl a 1 ml / 100 g / hr a través de la vena yugular para mantener el volumen de sangre. Canular ambos uréteres para la recolección de orina. Coloque los lazos alrededor de las arterias mesentéricas celíacas y superiores y la aorta distal para la manipulación de la presión de perfusión renal (Figuras 10A).
   6. Si se requiere la aplicación de agentes farmacológicos durante los experimentos in vivo, la inserción de un catéter intersticial se recomienda (Figuras 10B ).

Configuración 3. Adquisición de Datos

1. Abra el programa de adquisición de datos y establecer su polaridad tanto ex vivo e in vivo a anódica positiva. Ajuste el programa para guardar datos como código ASCII.
2. Coloque los micromanipuladores para la inserción rápida de los sensores en los riñones.
   NOTA: También puede utilizar una sonda ficticio unido al micromanipulador para ayudar a lograr la colocación deseada de sensores.
3. Adquisición de datos Ex vivo
   1. Perfundir el riñón con solución de baño (de 2.1.6) a través de la aorta canulado a una velocidad constante de 650 l / min. Con unas tijeras quirúrgicas, retire con cuidado la cápsula renal, la cual es necesaria para la inserción del sensor.
   2. Asegurar el riñón con bandas de goma atadas sobre el riñón y unidos al plato recubierto de silicona con alfileres.
   3. Coloque el electrodo de referencia cerca del riñón en la placa de Petri con su punta sumergida enla solución tampón.
4. En la adquisición de datos in vivo
   1. Coloque el riñón en una taza de riñón. Dependiendo de la cepa y edad del animal utilizar un tamaño de copa que sostiene el riñón sin apretar. La Figura 8 muestra dos tamaños de copas de riñón. Tazas similares se utilizan para diferentes enfoques fisiológicos se centraron en el análisis de la función renal como micropunción etc ^16.
      Nota: La posición de la copa renal es fundamental para eliminar el ruido mecánico producido por la respiración animal, pero no debe interferir con o bloquear la perfusión renal o el flujo de orina.
   2. Permitir 45 minutos de tiempo de recuperación antes de realizar la recolección de datos.
   3. Usando una aguja 26-30G, hacer un agujero de punción en el lugar deseado y la profundidad del sensor en el riñón. Seque el agujero superficie para eliminar la sangre exudada. Añadir solución de glicerol a la superficie del riñón. Esto evitará que la superficie de riñón se seque durante el experimento.
   4. Retire el primer sensor de la cámara de la rehidratación y adjuntarlo a la micromanipulador. Rápidamente, dentro de los 20 segundos, inserte el electrodo en el agujero recién creado en el riñón. Repita los pasos 3,5 a 3,9 para el sensor nulo.
   5. Insertar el electrodo de referencia en el riñón, aproximadamente 1 cm a partir de los sensores.
5. Encienda la potenciostato y activar el programa de grabación en el equipo. La Figura 9 muestra la configuración final de la adquisición de datos de riñón ex vivo. La Figura 10 muestra la configuración final de la adquisición de datos de riñón in vivo con un catéter insertado.

Análisis 4. Datos

1. Importe el archivo de datos ASCII en origen o cualquier otro software similar.
2. Relación actual Concentración
   1. Utilice la función de ajuste / extrapolar lineal para construir una concentración lineal (eje x) a la corriente (eje y) la relación de la ATP o H ₂ O ₂ puntos de calibración (Figuras 6 y 7).
      línea de ajuste lineal: y = mx + b
3. Equiparar la corriente y la concentración
4. Restar las huellas medidos del sensor nula de los del sensor de ATP para obtener la corriente real producida por el ATP intracelular.
5. Convertir los valores de ATP en pA obtenidos por amperometría a nM usando la ecuación de calibración se detalla en 4.2.1. Determinar la concentración de la traza de datos resta del sensor de ATP mediante la importación de cada corriente ajustada en el valor de "x" y resolviendo para y (la concentración de analito).
6. Del mismo modo, el cálculo de H _{2 O 2} concentración de su ecuación de calibración si es necesario.

Resultados

El diseño del biosensor microelectrodo enzimática permite la detección en tiempo real de analitos en los riñones enteros. El diseño experimental general para ya sea ex vivo o in vivo estudios se ilustra en la Figura 1 .Los sensores utilizados y los procedimientos quirúrgicos difieren dependiendo de si el estudio es ex vivo o in vivo.

Para obtener resultados reproducibles, pre precisa y calibraciones posteriores son críticos...

Discusión

Los actuales protocolos fueron desarrollados para proporcionar una resolución temporal y espacial mejorada de ATP y H _{2 O 2} de señalización para ex vivo aislados, perfundidos e in vivo riñones perfundidos sangre. Las diferencias entre los protocolos y los sensores utilizados aquí proporcionan la adquisición de datos óptima, ya sea para agentes farmacológicos o estudios fisiológicos. Los protocolos consisten en 1) la calibración del sensor, 2) procedimiento quirúrgico, 3) de config...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensor Kit	Sarissa Biomedical	SBK-ATP-05-125	The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.  Also included with the kit is the user's choice of sensors.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-ATP-05-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold ATP Biosensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-ATP-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe null sensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-NUL-20-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold null sensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-NUL-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe ATP Manual	Sarissa Biomedical		http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage	TMC
Dual channel potentiostat	Digi-Ivy	DY2021	Type II Faraday cage
Data acquisition program	Digi-Ivy	DY2000
Perfusion pump	Razel Scientific Instruments	Model R99E
Fiber optic illuminator	Schott	ACE 1
micromanipulator	Narishige	MM-3
micromanipulator magnetic stand	Narishige	GJ-8
air table	TMC	63-500
isoflurane ventilator	LEI Medical	M2000
3 ml petri dish	Fisher Scientific	S3358OA
needle	Santa Cruz		26-30 G
pins			Standard dissection pins
catheter			Polyethylene tubing (PE50)
catheter tissue glue	Vetbond	1469SB
suture	Look	SP117
rubber bands			any 2-4 mm wide rubber bands
silicone	Momentive	RTV-615 Clear 1#
clamp	Fine Science Tools	18052-03
standard dissection kit			Kit should include scalpel and dissection sissors
Kidney Cup			Of own design
standard chemicals	Sigma-Aldrich
ATP	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO	100 mM ATP solution
hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	216763
glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Apyrase	Sigma-Aldrich	A7646
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
isoflurane	Clipper	10250
inactin	Sigma-Aldrich	T133
ketamine	Clipper	2010012
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco	14025092