효소 바이오 센서의 사용은 내인성 ATP 또는 H를 정량화하기<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; 신장에

요약

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H₂O₂ in the kidney.

초록

효소 미세 바이오 센서가 널리 실시간으로 세포 외 시그널링을 측정하는 데 사용되어왔다. 그 사용의 대부분은 뇌 조각 및 신경 세포 배양에 국한되고있다. 최근에,이 기술은 전체 기관에 적용되었다. 센서 설계의 발전은 혈액 관류 생체 신장에서의 세포 신호의 측정을 가능하게했다. 본 프로토콜은 쥐의 신장 간질의 ATP와 H ₂ O ₂ 신호를 측정하는 데 필요한 단계를 나열합니다. 두 개의 개별 센서 디자인에 대한 생체 외 및 생체 내 프로토콜을 사용한다. 센서의 두 가지 유형은 빠른 응답, 민감하고 선택적 바이오 센서를 제공하기 위해 침투 선택성 층 위에 얇은 효소 biolayer로 코팅되어있다. 침투 선택성 층은 생체 조직 내의 간섭 물질로부터의 신호를 보호하고, 효소 층은 글리세롤 키나제 및 글리세롤 -3- 진료 기관 연합의 연속 촉매 반응을 이용하는ATP의 존재 phate 다제는 H ₂ O _2를 생성한다. 생체 연구에 사용되는 센서의 세트는 더 백금 / 이리듐 (PT-IR) 와이어 전극에 H ₂ O _2의 산화에 의한 분석을 감지했습니다. 생체 내 연구 센서 대신 혈액 관류 조직을 위해 설계 매개 코팅 금 전극 상 H ₂ O _(2)의 감소에 기초한다. 최종 농도 변화를 분석 알려진 농도로 보정 한 다음 실시간 amperometry에 의해 감지됩니다. 또한, 전류 측정 신호의 특이성은 O _2와 H ₂ ATP 대응 분해 같은 카탈라제 등의 효소와 apyrase의 첨가에 의해 확인 될 수있다. 이 센서는 이전과 각 실험 후 정확한 교정에 크게 의존하고있다. 다음 두 프로토콜은 ATP와 H _2의 실시간 검출에 대한 연구를 확립신장 조직에서의 O _2를, 또한 다른 생물학적 제제 또는 전체 기관에서 사용하기위한 상술 한 방법을 확장하도록 변형 될 수있다.

서문

(또한 본 원고에서 센서로 참조) 효소 미세 바이오 센서는 세포와 조직 생활에 동적 신호 전달 과정을 연구하기위한 유용한 도구가되고있다. 센서는 생물학적으로 관련 농도에서 세포 신호 분자의 시공간적 해상도를 증가 제공합니다. 대신 샘플링하고 장시간 간격에서 찍은 세포 외 체액을 분석하는 그들의 효소 분석 물에 반응으로, 이들 센서하여 실시간 측정 ^{1,2- 제조,} 빠르게 반응한다. 퓨린 또는 과산화수소 및 그들의 방출 역학 같은자가 분비 및 주변 분비 인자의 농도의 격자 간 고속 검출은 정상 및 병리학 적 상태 ^(3)에 약물의 효과에 대한 프로파일을 구축하는 데 사용될 수있다. 현재의 센서를 사용하는 애플리케이션의 대부분은 뇌 조직 슬라이스 및 세포 배양 ^{4-10에왔다.} 이 논문의 목적에 자세히 프로토콜정확하게 전체 신장의 분석을 실시간으로 농도를 측정하는 수단을 설치한다.

다음 프로토콜은 간질 ATP와 H 신장 ₂ O ₂ 신호를 연구하기 위해 개발되었다. 신장의 네이티브 환경에서 세포 외 ATP 빠르게 그 유도체 (ADP, AMP 및 아데노신)로 내인성 ectonucleotidases에 의해 이화됩니다. 여기에 사용 된 센서는 다른 퓨린 또는 ATP 분해물 ¹¹ 위에 ATP에 매우 선택적이다. 이 ATP 릴리스 및 신호 함수의 상수 및 동적 농도를 정확하게 모니터링 할 수 이것은 큰 장점을 제공합니다. 간질 ATP 농도는 두 개의 마이크로 전극의 조합, ATP 센서 및 null 센서를 사용하여 측정된다. 카탈라제 애플리케이션과 함께 널 센서 간질 H ₂ O ₂ 농도 ^12을 검출 할 수있다. 다음 프로토콜은 열차의 두 개의 서로 다른 디자인을 사용하여중 생체 또는 생체 내 응용 프로그램에서 최적의 특성을 가지고 RS.

두 가지 설계는 효소 센서 층에 함유 글리세롤 키나제 및 글리세롤 -3- 인산 옥시 다제의 연속 촉매 반응에 기초하고 있으며 ATP의 존재에 의해 구동된다. 생체 외 연구에 사용 된 센서의 세트, H ₂ O _2, 최종 효소 반응 생성물에서, 백금 / 이리듐 (PT-IR), 와이어 전극의 산화에 의해 검출된다. 생체 내 연구를위한 센서 대신에 혈액 관류 조직을 위해 설계 중재자 코팅 된 금 전극에 ₂ O _2의 감소 (H)을 기반으로합니다. 이 논문에 기술 된 두 프로토콜의 방식은 그림 1에서 보여진다. 이 효소 결합 결여 제외 널 센서는 해당 센서 ATP와 동일하다. 따라서, 카탈라제 효소로 H ₂ O _(2)의 검출에 더하여, 널 센서 MEAsures 비특이적 간섭. ATP 농도는 널이 비특이적 간섭과 ATP 센서 신호로부터 배경 H ₂ O _2를 감지 빼서 계산한다. 여러 센서는 해당 널 (null)와 결합 할 때 생체에 대한 아데노신, ionosine, 하이포크 산틴, 아세틸 콜린, 콜린, 글루타민산, 포도당, 젖산, 생체 응용 프로그램이나 아데노신, ionosine을위한 D- 세린 및 하이포크 산틴을 포함하여 다른 분석을 감지 상업적으로 이용 가능하다 센서.

정확하게 분석 물을 검출하는 센서의 기능은 적절한 교정 전후 ^13에 의존한다. 이 분석은 생물학적 조직의 사용 중에 발생하는 센서의 감도의 편차를 차지하는 것을 보장한다. 센서는 센서 효소 반응에서 시약으로서 사용되는 글리세롤의 저장소를 보유하고있다. 센서를 포함하는 조 글리세롤 용액에 사용되지 않는 경우, 시간이 지남에 따라 세척한다. 짧은 Recording 시간은 센서 드리프트를 최소화 할 필요가있다. 또한 크게 센서 ^(14)의 감도를 감소시킬 수있는 내인성 단백질 분해 효소 및 단백질 절편으로 오염 센서.

본 원고는 생체 외 및 생체 신장에 효소 제제 미세 바이오 센서의 사용을 설정한다. 실시간 분석 정량 신장 질환 및 약리 에이전트의 메커니즘에 새로운 통찰력을 공개 할 수 세포 신호 전달의 전례가없는 세부 사항을 제공합니다.

프로토콜

실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 부착 된 다음 동물 절차. 이전 승인 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)로부터 얻은 것입니다.
참고 : 센서 제조업체 지침의 검토는 실험 설계 및 사용 전에 동안 수행해야합니다. 센서를 사용하는 경우이 지침을 따르는 것은 최적의 결과를 생성합니다.

1. 센서 교정

1. 실험 시작 전에 신선한 원액을 준비한다.
2. 10 mM의 NAPI 버퍼, 100 mM의 NaCl을, 1 밀리미터의 MgCl _{2, 2} mM의 글리세롤을 포함하는 버퍼를 작성합니다. NaOH를 사용하여 7.4으로 산도를 조정합니다. 2-8 ℃에서 보관하십시오.
3. -20 ℃에서 보관 콘텐츠 ATP 농도 (100 mm)를 사용하여, 버퍼 A. 90 μL에 10 μL 스톡을 첨가하여 10 mM의 ATP 신선한 교정 액을 만들
4. T에의 팁 (그림 2)을 배치하여 ATP 센서를 재수2-8 ℃에서 적어도 10 분 동안 버퍼를 포함하는 그 재수 챔버.
   주 : 재수 후, 센서는 20 초 동안 공기에 노출되지 않아야하거나, 센서의 감도가 감소 될 수있다. 공기에 장시간 노출이 예상되는 경우, 글리세롤의 솔루션으로 간단히 센서를 찍어. 센서는 여러 실험을 위해 사용될 수 있지만, 이들은 센서 재수 같은 날에 발생한다. 센서는 최대 24 시간 동안 완충액 A와 재수 화 챔버 내에 저장 될 수있다.
5. 듀얼 채널 텐쇼 (그림 3)의 전원을 켜고 녹화 시스템 소프트웨어를 시작합니다.
6. 버퍼 A. 찾는 3 ㎖ 교정 챔버로 기준 전극과 교정 챔버를 준비한다. 다음, 재수 실에서 각 센서를 가지고 조작에 부착하고 교정 실 솔루션에 삽입합니다.
   참고 : 교정 실 같은 표준 실리콘 코팅 된 배양 접시를 사용합니다. 모든 교정과 일을 수행고성능 실험실 공기 테이블에 패러데이 케이지 udies는 amperometry 녹음 (그림 4) 동안 신호의 노이즈를 줄일 수 있습니다. 교정은 가장 가능한 데이터 수집의 시작에 가깝게 수행됩니다. 생체 내 응용을 위해 교정을위한 최적의 시간은 동물의 수술 후 회복 기간이다.
7. 예 생체 내 교정
   1. 10 사이클 100 mV / 초의 속도에서 +500 MV에 -500 mV 이상 센서를 순환시킴으로써 교정 챔버 내의 순환 전압 전류 법을 수행한다. 이것은 크게 센서의 감도를 향상시킨다. 10 사이클에서 관찰 된 흔적은 그림 5를 참조하십시오.
   2. 마지막주기 후 600 MV에 센서를 극화. 센서 전류 점근선에 소멸한다. 꾸준한 독서는 최소 5 분 후에 얻을 수있다. 제로 값을 기록한다.
8. 생체 센서 교정
   1. 생체 열차에 순환 전압 전류를 수행하지 마십시오RS. 대신, MV +500 30 초 동안 챔버 내의 교정을 편광 센서. 그 다음에 0 MV 텐쇼를 설정하고, 센서 전류 점근선까지 상승 할 수있다. 센서 전류는 점근선에 적어도 2 분 소요됩니다. 제로 값을 기록한다.
9. 연속적으로 원하는 검출 범위를 포괄 검량선을 제조 챔버로 ATP 용액의 양 세트를 추가한다. ATP가 챔버 전체에 고르게 확산로서 ATP 용액 붕괴 뒤에 처음 센서 신호에서 날카로운 피크를 생성한다. 기록 신호 값은 신호 레벨이되면. 각 ATP 첨가 후도 6a 및도 7 트레이스 안정화 각각 생체 내 연구 모두에 대한 생체 외 및 ATP의 농도를 제안했다.
   주 : 분석 물 거제를 사용하여 전극의 선택성을 확인하는 것이 중요하다. 본 프로토콜은 H <대한 ATP 센서와 카탈라아제의 특이성을 테스트 apyrase 사용서브> ₂ O 2 신호 (도 6B). 약물이 투여되는 경우, 센서와의 반응성 측정을 연구하기 전에 결정되어야한다.
10. ATP 센서 (제로 수준 (그림 7)로 감소한다 ATP 응용 프로그램에 의해 생성 된 전류의 특이성을 테스트하기 위해 2 ㎎ / ㎖ (89 UN / mg)의 재고에서 apyrase의 3 μl를 추가합니다.
11. ₍₂ O ₂ 응용 프로그램이 제로 독서로 감소한다 (H)에 의해 생성 된 전류) ​​널 센서의 특이성을 테스트하기 위해 2 ㎎ / ㎖의 재고 (100 UN / mg)을에서 카탈라아제의 3 μl를 추가합니다.

센서 연구 2. 동물 수술

1. 생체 수술
   1. 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지) / 의료용 O ₂ 또는 다른 승인 된 방법으로 실험 동물을 마취. ⁽¹²⁾ 동물이 지속적으로 마취의 적절한 수준을 보장하기 위해 모니터링해야합니다 ^(15)를 제공합니다. 세인트수 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다.
      승인 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 안락사 :합니다. 모든 비 생존 절차의 완료시 동물 ^(12)의 인간적인 소멸을 위해 기흉 개흉술을 유도하여 깊게 마취 동물을 안락사.
   2. 앙와위에서 온도 조절 수술대에 쥐를 놓습니다. 적절한 마취 깊이를 유지하면서, 왼쪽 신장에 부합하는 약 5cm의 정중선을 절개하고 원위 복부 대동맥을 노출.
   3. 복강 및 상 장간막 동맥, 이러한 동맥 위의 복부 대동맥 주위에 끈을 감싸하지만 결찰하지 않습니다. 신장 동맥 아래 복부 대동맥 주위에 두 개의 합자를 감싸.
   4. 합자 위의 복부 대동맥을 클램프. 낮은 합자 넥타이. 폴리에틸렌 관 (PE50)와 복부 대동맥을 카테 테르를 꽂다. 두 번째 대동맥 결찰로 카테터를 고정.
   5. 클램프를 제거하고 장간막과 복강 동맥을 결찰. 신장이 완전히 희게 때까지 2-3 분 동안 실온에서 행크스 균형 염 용액 6 ml / 분으로 신장을 관류.
   6. 대동맥의 일부를 접속 신장 및 카테터를, 절제. 목욕 솔루션으로 가득 3 ㎖ 페트리 접시에 신장을 놓습니다.
      주 : 실험 프로토콜은 RT에서 수행 될 수있다. (145)의 NaCl, 4.5의 KCl, 2의 MgCl _2, 1 염화칼슘 _2, 10 HEPES, NaOH로 pH를 조정 7.35 : 목욕 솔루션은 mm 단위가 포함되어 있습니다.
2. 생체 수술
   1. 승인 IACUC 프로토콜을 사용하여 랫트를 마취. 생체 분석을 위해 케타민와 쥐 (20 ㎎ / ㎏ 임) 및 inactin (50 ㎎ / ㎏ IP)을 마취. 동물은 계속적으로 마취 적절한 수준을 보장하기 위해 모니터링되어야한다. 안정된 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다.
   2. 적절한 마취 깊이는 취득 후에드, 공기 테이블에있는 온도 조절 접지면에 앙와위에서 쥐를 놓습니다. 표면을 예열하고 36 ℃로 유지되어야한다.
   3. 적절한 마취 깊이를 유지하면서, 신장에 맞춰 중간 선 절개를 약 5cm합니다.
   4. 편향 및 전체 신장이 보이도록 피부와 피하 조직을 고정하는 봉합사를 사용한다. 움직임 아티팩트를 최소화하기 위해 신장 컵에서 신장을 놓습니다.
   5. 혈액량을 유지 경정맥을 통하여 1 ㎖ / 100g의 / hr이고 0.9 %의 NaCl : 2 % BSA의 IV 주입을 사용한다. 소변 수집을위한 두 요관을 Cannulate. 장소 장간막과 복강 동맥 주변의 관계 및 신장 관류 압 (도 10a)의 조작을위한 원심 aortal.
   6. 약학 제제의 적용은 생체 내 실험을하는 동안 필요하다면, 간질 카테터 삽입 (도 10B 추천 ).

3. 데이터 수집 설정

1. 데이터 수집 프로그램을 열고 모두 생체과 양극 긍정적으로 생체 실험에서 극성을 설정합니다. ASCII 코드로 데이터를 저장하는 프로그램을 설정합니다.
2. 신장에 센서의 빠른 삽입을위한 미세 조작기를 놓습니다.
   참고 : 또는 센서의 원하는 위치를 달성 할 수 있도록 미세 조작기에 부착 된 더미 프로브를 사용합니다.
3. 생체 데이터 취득
   1. / 분으로 650 μL의 일정한 속도로 대동맥을 통해 캐 뉼러 (2.1.6)에서 욕조 용액 신장을 관류. 수술 가위를 사용하여 조심스럽게 센서 삽입에 필요한 신장 캡슐을 제거합니다.
   2. 고무 밴드 신장을 통해 묶여 핀과 실리콘 코팅 접시에 부착와 신장을 고정합니다.
   3. 그 팁에 빠져들와 페트리 접시에 신장에 가까운 기준 전극을 배치완충 용액.
4. 생체 데이터 취득에
   1. 신장 컵에서 신장을 놓습니다. 동물의 변형 및 연령에 따라. 느슨하게 신장 보유 컵의 크기를도 8을 사용하여 신장 컵의 크기를 두 도표. 유사 컵 그러한 micropuncture 등 ¹⁶ 신장 기능의 분석에 집중 다른 생리적 접근을 위해 사용된다.
      신장 컵의 위치는 동물의 호흡에 의해 생성 된 기계적인 노이즈를 제거하는 것이 중요하지만, 방해 또는 신장 관류 또는 소변의 흐름을 차단하지 않아야합니다.
   2. 데이터 수집을 수행하기 전에 복구 시간이 45 분을 허용한다.
   3. 26-30G 바늘을 사용하여, 신장에서 센서의 위치 및 소정의 깊이에 천공 구멍을 만든다. 스며 혈액을 제거하기 위해 표면에 구멍을시킨다. 신장의 표면에 글리세롤 솔루션을 추가합니다. 이 실험 기간 동안 마르지 신장 표면을 방지 할 수 있습니다.
   4. 재수 실에서 제 1 센서를 제거하고는 미세 조작기에 연결합니다. 신속, 20 초 이내에, 신장에서 갓 만든 구멍에 전극을 삽입합니다. 반복 널 센서 3.5-3.9 단계를 반복합니다.
   5. 센서에서, 신장에 약 1cm를 기준 전극을 삽입합니다.
5. 텐쇼의 전원을 켜고 컴퓨터에 기록 프로그램을 활성화합니다. (9) 생체 신장 데이터 수집의 마지막 설정을 보여줍니다. (10)가 삽입 된 카테터와 생체 신장 데이터 수집의 마지막 설정을 보여줍니다.

4. 데이터 분석

1. 기원 또는 임의의 다른 유사한 소프트웨어에 ASCII 데이터 파일을 가져.
2. 농도 현재 관계
   1. 전류에 선형 농도 (X- 축)을 구축하기 위해 ATP 또는 H ₂ (Y시킴으로써 행한다)의 관계를 선형 피팅 / 외삽 기능을 사용하여 O ₂ 교정 점 (도 6 및도 7).
      선형 피팅 라인 : Y = MX + B
3. 농도 전류 동일시
4. 세포 내 ATP에 의해 생성 된 실제 전류를 얻기 위해 ATP 센서들로부터 널 센서의 측정 흔적을 뺀다.
5. 4.2.1에 설명 된 교정 방정식을 사용하여 nm의 amperometry에 의해 얻어진 포장 된 ATP 값을 변환합니다. "X"값으로 각각 조정 전류를 가져 오기 및 Y (분석의 농도)에 대한 해결하여 ATP 센서의 감산 데이터 트레이스의 농도를 결정합니다.
6. 필요한 경우 유사하게, 그것의 교정 식 H ₂ O ₂ 농도를 계산한다.

결과

효소 미세 바이오 센서의 설계는 전체 신장의 분석 물질의 실시간 검출 할 수있다. 어느 생체 외 또는 생체 내 연구에서 일반적인 실험 디자인이 사용될도 1 국지적 센서에 도시되고, 수술 절차는 연구 하는가에 따라 달라 생체 외 또는 생체 내에서이다.

재현 가능한 결과, 정확한 사전 및 사후 교정을 얻으려면입니다 중요....

토론

본 프로토콜은 ATP의 향상된 시간과 공간 분해능을 제공하기 위해 개발 된 생체 관류, 격리 및 생체 내에서 혈액 관류 신장을위한 H ₂ O ₂ 신호가. 여기에 사용되는 프로토콜과 센서 간의 차이는 약리학 적 또는 생리 학적 연구 제제 중 최적 데이터 수집을 제공한다. 프로토콜 1) 센서 교정, 2) 외과 적 절차, 3) 데이터 획득 설정, 4) 데이터 분석 이루어져있다. 이들은 수많?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensor Kit	Sarissa Biomedical	SBK-ATP-05-125	The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.  Also included with the kit is the user's choice of sensors.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-ATP-05-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold ATP Biosensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-ATP-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe null sensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-NUL-20-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold null sensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-NUL-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe ATP Manual	Sarissa Biomedical		http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage	TMC
Dual channel potentiostat	Digi-Ivy	DY2021	Type II Faraday cage
Data acquisition program	Digi-Ivy	DY2000
Perfusion pump	Razel Scientific Instruments	Model R99E
Fiber optic illuminator	Schott	ACE 1
micromanipulator	Narishige	MM-3
micromanipulator magnetic stand	Narishige	GJ-8
air table	TMC	63-500
isoflurane ventilator	LEI Medical	M2000
3 ml petri dish	Fisher Scientific	S3358OA
needle	Santa Cruz		26-30 G
pins			Standard dissection pins
catheter			Polyethylene tubing (PE50)
catheter tissue glue	Vetbond	1469SB
suture	Look	SP117
rubber bands			any 2-4 mm wide rubber bands
silicone	Momentive	RTV-615 Clear 1#
clamp	Fine Science Tools	18052-03
standard dissection kit			Kit should include scalpel and dissection sissors
Kidney Cup			Of own design
standard chemicals	Sigma-Aldrich
ATP	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO	100 mM ATP solution
hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	216763
glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Apyrase	Sigma-Aldrich	A7646
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
isoflurane	Clipper	10250
inactin	Sigma-Aldrich	T133
ketamine	Clipper	2010012
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco	14025092