Utilisation des Biocapteurs pour quantifier enzymatique endogène ATP ou H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; Dans le rein

Résumé

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H₂O₂ in the kidney.

Résumé

Biocapteurs de microélectrodes enzymatiques ont été largement utilisés pour mesurer la signalisation extracellulaire en temps réel. La plupart de leur utilisation a été limitée à des tranches de cerveau et cultures de cellules neuronales. Récemment, cette technologie a été appliquée à l'ensemble des organes. Les progrès dans la conception de capteurs ont rendu possible la mesure de la signalisation cellulaire dans le sang perfusé dans les reins vivo. Les présents protocoles énumèrent les étapes nécessaires pour mesurer l'ATP et _H 2 O 2 signalisation dans le tissu interstitiel du rein de rat. Deux conceptions de capteurs séparés sont utilisés pour l'ex vivo et in vivo dans des protocoles de. Les deux types de capteurs sont revêtus d'une couche biologique enzymatique mince sur le dessus d'une couche de permsélectivité pour donner réponse rapide, les biocapteurs sensibles et sélectives. La couche de perméabilité sélective protégeant le signal des substances interférentes dans le tissu biologique, et la couche enzymatique utilise la réaction catalytique séquentiel de la glycérol kinase et glycérol-3-phosphate-oxydase en présence d'ATP pour produire _H 2 O _2. L'ensemble de capteurs utilisés pour les études ex vivo en outre analyte détecté par oxydation de l'H ₂ O ₂ sur une platine / iridium (Pt-Ir) fil-électrode. Les capteurs pour les études in vivo sont plutôt basée sur la réduction de _H 2 O 2 sur une électrode d'or revêtu de médiateur conçu pour tissu perfusé de sang. Les changements de concentration finale est détecté par ampérométrie en temps réel suivie d'étalonnage de concentrations connues d'analyte. En outre, la spécificité du signal ampérométrique peut être confirmée par l'addition d'enzymes telles que la catalase et apyrase qui décomposent _H 2 O 2 et de l'ATP de façon correspondante. Ces capteurs comptent aussi beaucoup sur les étalonnages précis avant et après chaque expérience. Les deux protocoles suivants établissent l'étude de la détection en temps réel de l'ATP et H ₂O ₂ dans des tissus de rein, et peut être en outre modifié de manière à étendre la méthode décrite pour une utilisation dans d'autres préparations biologiques ou d'organes entiers.

Introduction

Biocapteurs de microélectrodes enzymatique (également mentionnés comme des capteurs dans le présent manuscrit) ont été un outil précieux pour l'étude des processus de signalisation dynamiques dans les cellules et les tissus vivants. Les capteurs permettent d'augmenter la résolution temporelle et spatiale des molécules de signalisation cellulaire dans des concentrations biologiquement pertinentes. Au lieu de l'échantillonnage et l'analyse de fluides extracellulaires prélevés à des intervalles de plus longues périodes de temps, ces capteurs réagissent aussi vite que leurs enzymes réagissent à l'analyte, produisant ainsi des mesures en temps réel ^{de 1,2.} Détection rapide des concentrations interstitielles de facteurs autocrine et paracrine, comme purines ou le peroxyde d'hydrogène, et la dynamique de leur libération peut être utilisé pour établir un profil pour les effets des médicaments dans des conditions normales et pathologiques ^3. Actuellement, la plupart des applications utilisant des capteurs ont été dans des coupes de tissu de cerveau et de cultures de cellules ^4-10. Les protocoles détaillés dans ce but manuscritétablir les moyens de mesurer avec précision les concentrations en temps réel des analytes dans les reins entiers.

Les protocoles suivants ont été développés pour étudier l'ATP interstitiel et _H 2 O 2 dans les reins signalisation. Dans l'environnement natif du rein, l'ATP extracellulaire est rapidement catabolisée par ectonucléotidases endogènes dans ses dérivés (ADP, AMP et de l'adénosine). Les capteurs utilisés ici sont très sélectifs à l'ATP par rapport aux autres purines ou des produits de dégradation de l'ATP ^11. Cela offre un grand avantage, car elle permet un suivi précis des concentrations constantes et dynamiques de la libération d'ATP et sa fonction de signalisation. Concentration interstitielle ATP est mesurée en utilisant la combinaison de deux microélectrodes, un capteur et un capteur ATP Null. Le capteur Null en combinaison avec des applications de la catalase est capable de détecter H ₂ O ₂ interstitiel ¹² concentrations. Les protocoles suivants utilisent deux modèles différents de sensors qui ont des caractéristiques optimales pour soit ex vivo ou in vivo. applications

Les deux modèles sont basés sur la réaction catalytique séquentiel de la glycérol kinase et glycérol-3-phosphate oxydase contenue dans une couche de capteur enzymatique et est entraîné par la présence d'ATP. Dans l'ensemble des capteurs utilisés dans les études ex vivo, _H 2 O 2, le produit enzymatique finale de la réaction, est détectée par oxydation sur une platine / iridium (Pt-Ir) fil-électrode. Capteurs pour des études in vivo sont basés sur la place H _{2 O 2} de réduction sur une électrode d'or revêtu de médiateur conçu pour tissu perfusé de sang. Illustrée à la figure 1 est un schéma de deux protocoles décrits dans ce manuscrit. Le capteur Null est identique à son capteur de l'ATP correspondante, sauf qu'il n'a pas les enzymes liées. Par conséquent, en plus de la détection de _H 2 O 2 avec la catalase enzyme, le capteur de mea NullSures interférences non spécifiques. Concentrations d'ATP sont calculées en soustrayant la détection des interférences non spécifiques Null fond et _H 2 O 2 à partir du signal de détection de l'ATP. Plusieurs capteurs sont également disponibles dans le commerce pour détecter d'autres analytes, y compris l'adénosine, ionosine, hypoxanthine, l'acétylcholine, choline, le glutamate, le glucose, le lactate, la D-sérine des applications Ex vivo ou adénosine, ionosine et hypoxanthine pour in vivo quand il est associé avec le Null correspondant capteur.

La capacité du capteur pour détecter les analytes avec précision dépend de la pré- approprié et étalonnages ^post-13. Cela garantit que représente l'analyse de la dérive de la sensibilité du capteur qui se produit lors de l'utilisation dans les tissus biologiques. Le capteur est titulaire d'un dépôt de glycerol qui est utilisée comme réactif dans les réactions enzymatiques capteurs. Si le capteur est pas utilisé dans les solutions de bain contenant du glycerol, il laver dans le temps. Shorter rent reprises sont alors nécessaires pour minimiser la dérive de la sonde. En outre capteur d'encrassement par des proteases endogènes et les fragments de protéines peut grandement diminuer la sensibilité des ^capteurs 14.

La présente manuscrit établit l'utilisation de biocapteurs de microélectrodes enzymatiques pour ex vivo et in vivo des préparations de rein. En temps réel analyte quantification fournit des détails sans précédent de la signalisation cellulaire qui peut révéler de nouvelles perspectives sur les mécanismes de maladies du rein et des agents pharmacologiques.

Protocole

Les procédures sur les animaux suivants ont adhéré à la NIH Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. L'approbation préalable a été obtenue à partir du Comité des soins et de l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC).
REMARQUE: Examen des instructions du fabricant du capteur doit être fait lors de la conception de l'expérience et avant leur utilisation. Suite à ces instructions produire des résultats optimaux lorsque vous utilisez les capteurs.

1. Calibrage du capteur

1. Préparer des solutions de base fraîches avant le début de l'expérience.
2. Insérer le tampon A contenant 10 mM de tampon NaPi, 100 mM de NaCl, 1 _mM de MgCl2, et 2 mM de glycerol. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH. Stocker à 2-8 ° C.
3. En utilisant une concentration stock ATP (100 mM) stocké à -20 ° C, de créer une nouvelle solution ATP 10 mM d'étalonnage en ajoutant 10 pi de stock à 90 pi de tampon A.
4. Réhydrater le capteur ATP en plaçant sa pointe (Figure 2) dans til chambre de réhydratation contenant tampon A pendant au moins 10 min à 2-8 ° C.
   NOTE: Après réhydratation, les capteurs ne doit pas être exposé à l'air pendant plus de 20 secondes ou de la sensibilité du capteur peut être réduite. Si les longues expositions à l'air sont prévus, plonger le capteur brièvement dans une solution de glycérol. Les capteurs peuvent être utilisés pour des expériences multiples, mais ceux-ci doivent se produire sur le même jour que la réhydratation capteur. Les capteurs peuvent être stockés dans la chambre de réhydratation avec du tampon A jusqu'à 24 heures.
5. Tournez sur le canal potentiostat double (Figure 3) et démarrer le logiciel de système d'enregistrement.
6. Préparer une chambre d'étalonnage avec 3 ml de tampon A. La place de l'électrode de référence dans la chambre de calibrage. Prenez chaque capteur de la chambre de réhydratation, puis attachez-le au manipulateur et l'insérer dans la solution de la chambre d'étalonnage.
   REMARQUE: Utilisez une boîte de Pétri enduit de silicone standard en tant que chambre de calibrage. Effectuer tous les étalonnages et studies dans une cage de Faraday sur un laboratoire de table d'air haute performance pour réduire le bruit du signal pendant les enregistrements ampérométrie (figure 4). Étalonnages sont mieux fait au plus près du début de la collecte de données que possible. Pour des applications in vivo le moment optimal pour le calibrage est au cours de la période de récupération post-chirurgie des animaux.
7. Ex vivo étalonnage
   1. Effectuer voltamétrie cyclique dans la chambre de calibrage par le vélo les capteurs de -500 mV à 500 mV à un taux de 100 mV / s pour 10 cycles. Cela améliore considérablement la sensibilité des capteurs. Voir Figure 5 pour les traces observées à partir des 10 cycles.
   2. Polariser les capteurs à 600 mV après le dernier cycle. Le courant de la sonde se désintègre à une asymptote. Une lecture d'équilibre est atteint après un minimum de 5 min. Enregistrez la lecture zéro.
8. Dans étalonnage de capteur in vivo
   1. Ne pas effectuer la voltamétrie cyclique sur le in vivo sensors. Au lieu de cela, polariser le capteur dans la chambre de calibrage pendant 30 s à 500 mV. Réglez ensuite le potentiostat à 0 mV et laisser le courant du capteur remonter à une asymptote. Le courant du capteur prendra au moins 2 min à asymptote. Enregistrez la lecture zéro.
9. Consécutivement ajouter des quantités fixes de solution ATP dans la chambre pour produire une ligne de calibrage englobant une gamme de détection souhaitée. La solution ATP produit un pic aigu dans le signal du capteur d'abord, suivie d'une décroissance de l'ATP diffuse uniformément dans la chambre. Valeurs de signal d'enregistrement une fois que le niveau de signal est stabilisé après chaque addition ATP. Figures 6A et 7 montrent des traces et a suggéré concentrations d'ATP à la fois ex vivo et des études in vivo, respectivement.
   NOTE: Il est important de confirmer la sélectivité des électrodes en utilisant des charognards des analytes. La présente protocole utilisé apyrase pour tester la spécificité de la détection de l'ATP et de la catalase pour la H _{2 O 2 signal (figures 6B). Si les médicaments doivent être administrés, les mesures de réactivité avec les leurs capteurs doivent être déterminés avant l'étude.}
10. Ajouter 3 pi de apyrase partir d'un stock de 2 mg / ml (89 ONU / mg) pour tester la spécificité du capteur de l'ATP (le courant produit par l'application de l'ATP devrait réduire au niveau zéro (figure 7).
11. Ajouter 3 pi de la catalase à partir d'un stock de 2 mg / ml (100 UN / mg) pour tester la spécificité du capteur null (le courant produit par _H 2 O 2 demande devrait réduire à la lecture de zéro).

2. chirurgie des animaux pour les études de capteurs

1. Chirurgie ex vivo
   1. Anesthésier l'animal expérimental avec l'isoflurane (5% induction, de 1,5 à 2,5% maintenance) / grade médical O ₂ ou d'une autre méthode approuvée. ^{15 '12} animaux doivent être surveillés en permanence pour assurer un niveau adéquat d'anesthésie. Strespiratoires vitesse de réaction et de pincement de l'orteil mesure sont utilisés pour confirmer l'anesthésie appropriée.
      Remarque: Euthanasier l'animal selon des protocoles approuvés IACUC. À la fin de toutes les procédures non-survie euthanasier les animaux profondément anesthésiés par thoracotomie induire pneumothorax pour assurer la disparition de l'animal humain ^12.
   2. Placez le rat sur une table d'opération à température contrôlée dans une position couchée. Tout en maintenant une profondeur de l'anesthésie adéquate, faire une incision médiane d'environ 5 cm en ligne avec le rein gauche et d'exposer l'aorte abdominale distale.
   3. Enveloppez une ligature autour de la maladie coeliaque et les artères mésentériques supérieure et l'aorte abdominale au-dessus de ces artères, mais ne pas ligaturer. Envelopper deux ligatures autour de l'aorte abdominale en dessous des artères rénales.
   4. Fixer l'aorte abdominale au-dessus des ligatures. Attachez la ligature inférieure. Sonder l'aorte abdominale avec des tubes en polyéthylène (PE50). Fixez le cathéter avec la deuxième ligature de l'aorte.
   5. Retirer la pince et ligaturer les artères mésentériques et la maladie cœliaque. Perfuser le rein à 6 ml / min avec une solution de sel équilibrée de Hanks à température ambiante pendant 2-3 min jusqu'à ce que le rein est complètement blanchi.
   6. Exciser le rein et le cathéter, la partie de l'aorte connecté. Placez le rein dans une boîte de Petri 3 ml rempli de solution de bain.
      Remarque: protocole d'essai peut être effectué à température ambiante. La solution de bain contient en mM: NaCl 145, KCl 4,5, _MgCl2 2, _CaCl2 1, 10 HEPES, pH ajusté avec du NaOH à 7,35.
2. Chirurgie pour in vivo
   1. Anesthésier le rat en utilisant des protocoles approuvés IACUC. Pour l'analyse in vivo anesthésier les rats avec de la kétamine (20 mg / kg IM) et Inactin (50 mg / kg ip). Les animaux doivent être surveillés en permanence pour assurer un niveau adéquat d'anesthésie. A la vitesse de réaction respiratoire et pincement de l'orteil stables sont utilisés pour confirmer l'anesthésie appropriée.
   2. Après la profondeur de l'anesthésie appropriée est d'obtenired, placer le rat en décubitus dorsal sur une surface à température contrôlée est échoué situé sur la table pneumatique. La surface doit être préchauffé et maintenu à 36 ° C.
   3. Tout en maintenant la profondeur de l'anesthésie adéquate, faire une incision médiane d'environ 5 cm en ligne avec le rein.
   4. Utiliser un fil de suture pour dévier et ancrer le tissu cutané et sous-cutané de façon que l'ensemble du rein est visible. Placez le rein dans une tasse de rein de minimiser les artéfacts de mouvement.
   5. Utilisation d'une perfusion intraveineuse de 2% de BSA: 0,9% de NaCl à 1 ml / 100 g / h par la veine jugulaire pour maintenir le volume du sang. Cathétériser deux uretères pour la collecte d'urine. La place des liens autour des artères mésentériques et coeliaques supérieures et l'aorte distale pour la manipulation de la pression de perfusion rénale (figures 10A).
   6. Si l'application d'agents pharmacologiques est nécessaire pendant les expériences in vivo, l'insertion d'un cathéter interstitiel est recommandé (figures 10B ).

Configuration 3. Acquisition de données

1. Ouvrez le programme d'acquisition de données et de définir sa polarité à la fois ex vivo et in vivo à des expériences anodique positive. Réglez le programme pour enregistrer les données sous forme de code ASCII.
2. Placez les micromanipulateurs pour l'insertion rapide des capteurs dans les reins.
   NOTE: Vous pouvez également utiliser une sonde fictive attaché à la micromanipulateur pour aider à atteindre le positionnement souhaité de capteurs.
3. Ex acquisition de données in vivo
   1. Perfuser le rein avec une solution de bain (de 2.1.6) par l'intermédiaire d'une canule de l'aorte à une vitesse constante de 650 ul / min. Avec des ciseaux chirurgicaux, retirez soigneusement la capsule rénale, qui est nécessaire pour l'insertion de la sonde.
   2. Fixez le rein avec des bandes de caoutchouc attachés sur le rein et attachés au plat enduit de silicone avec des épingles.
   3. Placez l'électrode de référence près de rein dans la boîte de Pétri avec sa pointe immergée dansla solution tampon.
4. Dans l'acquisition de données in vivo
   1. Placez le rein dans une tasse de rein. Selon la souche et l'âge de l'animal utiliser une taille de tasse qui détient le rein lâche. La figure 8 montre deux tailles de tasses rénaux. Tasses similaires sont utilisés pour différentes approches physiologiques ont porté sur l'analyse de la fonction rénale, tels que microponction etc ^16.
      Remarque: La position de la coupe du rein est essentiel pour éliminer le bruit mécanique produite par la respiration des animaux, mais ne devrait pas interférer avec ou bloquer la perfusion rénale ou l'écoulement d'urine.
   2. Comptez 45 min de temps de récupération avant d'effectuer la collecte de données.
   3. En utilisant une aiguille 26-30G, faire un trou de perforation à l'endroit désiré et la profondeur de la sonde dans le rein. Éponger le trou de surface pour enlever le sang exsudation. Ajouter une solution de glycerol à la surface du rein. Cela permettra d'éviter la surface de rein de sécher pendant l'expérience.
   4. Retirer le premier capteur de la chambre de réhydratation et l'attacher à la micromanipulateur. Rapidement, dans les 20 secondes, insérer l'électrode dans le trou fraîchement créé dans le rein. Répétez les étapes 3.5 à 3.9 pour le capteur nulle.
   5. Insérez l'électrode de référence dans le rein, d'environ 1 cm à partir des capteurs.
5. Tournez sur le potentiostat et activer le programme d'enregistrement de l'ordinateur. La figure 9 montre la configuration finale de l'acquisition de données de rein ex vivo. La figure 10 montre la configuration finale de l'acquisition des données in vivo du rein avec un cathéter inséré.

Analyse des données 4.

1. Importer le fichier de données ASCII dans origine ou de tout autre logiciel similaire.
2. Concentration relation actuelle
   1. Utilisez la fonction ajustement linéaire / extrapoler pour construire une concentration linéaire (axe des x) en courant (axe des y) relation pour l'ATP ou H ₂ points O ₂ d'étalonnage (Figures 6 et 7).
      linéaire ligne d'ajustement: y = mx + b
3. Equate le courant de la concentration
4. Soustraire les traces de mesure du capteur de zéro à partir de ceux de la sonde de l'ATP pour obtenir le courant réel produite par l'ATP intracellulaire.
5. Convertir les valeurs de l'ATP en Pa obtenus par ampérométrie à nm en utilisant l'équation de calibrage décrite en 4.2.1. Déterminer la concentration de la trace de données soustrait du capteur ATP en important chaque courant ajusté dans la valeur "x" et de résolution pour y (la concentration de substance à analyser).
6. De même, le calcul de la concentration _de H 2 O ₂ à partir de son équation d'étalonnage, si nécessaire.

Résultats

La conception de la microélectrode biocapteur enzymatique permet la détection en temps réel des analytes dans les reins entiers. La conception de l'expérience générale pour les ex vivo ou in vivo est illustrée à la figure 1 capteurs .Les utilisés et les procédures chirurgicales diffèrent selon que l'étude est ex vivo ou in vivo.

Pour obtenir des résultats reproductibles, précise pré et post étalonnages sont...

Discussion

Les présents protocoles ont été développés pour fournir une meilleure résolution temporelle et spatiale de l'ATP et de _H 2 O 2 pour la signalisation des reins perfusés par le sang isolés ex vivo, et in vivo perfusé. Les différences entre les protocoles et les capteurs utilisés ici fournissent acquisition de données optimale pour soit des agents pharmacologiques ou des études physiologiques. Les protocoles sont constitués d'une) capteur étalonnage, 2) intervention chirurgicale, ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensor Kit	Sarissa Biomedical	SBK-ATP-05-125	The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.  Also included with the kit is the user's choice of sensors.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-ATP-05-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold ATP Biosensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-ATP-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe null sensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-NUL-20-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold null sensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-NUL-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe ATP Manual	Sarissa Biomedical		http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage	TMC
Dual channel potentiostat	Digi-Ivy	DY2021	Type II Faraday cage
Data acquisition program	Digi-Ivy	DY2000
Perfusion pump	Razel Scientific Instruments	Model R99E
Fiber optic illuminator	Schott	ACE 1
micromanipulator	Narishige	MM-3
micromanipulator magnetic stand	Narishige	GJ-8
air table	TMC	63-500
isoflurane ventilator	LEI Medical	M2000
3 ml petri dish	Fisher Scientific	S3358OA
needle	Santa Cruz		26-30 G
pins			Standard dissection pins
catheter			Polyethylene tubing (PE50)
catheter tissue glue	Vetbond	1469SB
suture	Look	SP117
rubber bands			any 2-4 mm wide rubber bands
silicone	Momentive	RTV-615 Clear 1#
clamp	Fine Science Tools	18052-03
standard dissection kit			Kit should include scalpel and dissection sissors
Kidney Cup			Of own design
standard chemicals	Sigma-Aldrich
ATP	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO	100 mM ATP solution
hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	216763
glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Apyrase	Sigma-Aldrich	A7646
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
isoflurane	Clipper	10250
inactin	Sigma-Aldrich	T133
ketamine	Clipper	2010012
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco	14025092