שימוש באנזימתי Biosensors לכמת אנדוגני ATP או H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; בכליות

Summary

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H₂O₂ in the kidney.

Abstract

חיישני microelectrode אנזימתי היו בשימוש נרחב כדי למדוד איתות תאית בזמן אמת. רוב השימוש בם הוגבל לפרוסות מוח ותרביות תאים עצביות. לאחרונה, טכנולוגיה זו הוחל על כל האיברים. התקדמות בתכנון חיישן שהתאפשרה המדידה של איתות תא בכליות vivo-perfused דם. הפרוטוקולים הנוכחיים רשימת הצעדים הדרושים כדי למדוד ₂ O ₂ איתות ATP ו- H בinterstitium כליות חולדה. שני עיצובי חיישן נפרדים המשמשים לvivo לשעבר ובפרוטוקולי vivo. שני סוגים של חיישן מצופים בbiolayer האנזימטית דק על גבי שכבת permselectivity לתת חיישנים מהירים להגיב, רגישים וסלקטיבית. שכבת permselectivity מגנה על האות מinterferents ברקמות ביולוגיות, והשכבה האנזימטית מנצלת את תגובת קטליטי רציפה של קינאז גליצרול וגליצרול-3-phosמונואמין phate בנוכחות ATP לייצר H ₂ O _2. הסט של חיישנים המשמשים למחקרי vivo לשעבר זוהה נוסף אנליטי על ידי חמצון של H ₂ O ₂ בפלטינה / אירידיום אלקטרודה חוט (PT-עיר). החיישנים למחקרי in vivo מבוססים במקום על ההפחתה של H ₂ O ₂ באלקטרודה זהב מתווך מצופה מיועדת לרקמה-perfused דם. שינויי ריכוז סופיים מזוהים על ידי amperometry בזמן אמת ואחרי כיול לריכוזים ידועים של אנליטי. בנוסף, את הספציפיות של אות אמפרומטריים יכולות להיות מאושרות על ידי התוספת של אנזימים כגון catalase וapyrase כי לשבור H ₂ O ₂ ו- ATP בהתאמה. חיישנים אלה גם מסתמכים במידה רבה על כיולים מדויקים לפני ואחרי כל ניסוי. שני הפרוטוקולים הבאים להקים המחקר של זיהוי של ה- ATP ו- H ₂ בזמן אמתO ₂ ברקמות כליה, ויכול להיות שונה נוסף להאריך את השיטה המתוארת לשימוש בתכשירים ביולוגיים אחרים או כל איברים.

Introduction

חיישני microelectrode האנזימטית (גם בהפניה כמו חיישנים בכתב היד הנוכחית) היו כלי רב ערך ללימוד תהליכי איתות דינמיים בתאים חיים ורקמות. החיישנים יספקו גדלו רזולוציה של זמן ומרחב של מולקולות איתות תא בריכוזים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. במקום דגימה וניתוח נוזלים תאיים נלקחו במרווחים על פני תקופות זמן ארוכות, חיישנים אלה מגיבים מהר ככל האנזימים שלהם מגיבים לאנליטי, ובכך לייצר מדידות בזמן אמת ^1,2. זיהוי מהיר של ריכוזי ביניים של גורמי autocrine ואוטוקריני, כמו purines או מי חמצן, ואת הדינמיקה של שחרורם ניתן להשתמש כדי להקים פרופיל להשפעות של תרופות בתנאים נורמלים ופתולוגיים ^3. נכון לעכשיו, רוב היישומים באמצעות חיישנים היו בחתכי רקמת מוח ותרביות תאים ^4-10. הפרוטוקולים מפורטים במטרת כתב היד הזה ללהקים את האמצעים כדי למדוד במדויק ריכוזים של analytes בכל כליות בזמן אמת.

הפרוטוקולים הבאים פותחו ללמוד ATP ביניים ו- H ₂ O ₂ איתות בכליות. בסביבה המקורית של הכליות, ATP התאי catabolized במהירות על ידי ectonucleotidases אנדוגני לנגזרותיו (ADP, AMP ואדנוזין). החיישנים המשמשים כאן הם מאוד סלקטיבית לATP על purines אחרת או מוצרים פגומים ATP ^11. זו מציעה יתרון גדול שכן היא מאפשרת ניטור מדויק של ריכוזים קבועים ודינמיים של שחרור ATP ותפקוד האיתות שלה. ריכוז ה- ATP ביניים נמדד באמצעות שילוב של שני microelectrodes, חיישן ה- ATP וחיישן ריק. חיישן ריק בשילוב עם יישומי catalase הוא מסוגל לזהות H ביניים ₂ O ₂ ריכוזים ^12. הפרוטוקולים הבאים משתמשים בשני עיצובים שונים של הצרRS שיש להן מאפיינים אופטימליים לשני vivo לשעבר או ביישומי vivo.

שני העיצובים מבוססים על התגובה קטליטי רציפה של קינאז גליצרול ומונואמין גליצרול-3-פוספט הכלול בשכבה האנזימטית חיישן ומונע על ידי הנוכחות של ה- ATP. בסט של חיישנים המשמשים במחקרי vivo לשעבר, H ₂ O _2, מוצר התגובה האנזימטית הסופי, הוא זוהה על ידי חמצון על פלטינה / אירידיום אלקטרודה חוט (PT-עיר). חיישנים ללימודים בvivo מבוססים במקום על H ₂ O ₂ הפחתה באלקטרודה זהב מתווך מצופה מיועדת לרקמה-perfused דם. שמוצגת באיור 1 היא ערכה של שני הפרוטוקולים שתוארו בכתב היד הזה. חיישן ריק זהה לחיישן ה- ATP המקביל שלה חוץ מזה שחסר את האנזימים מחויבים. לכן, בנוסף לגילוי של H ₂ O ₂ עם אנזים catalase, מאה שהחיישן ריקsures הפרעות ספציפיות. ריכוזי ATP מחושבים על ידי הפחתת ריק זוהה הפרעות ספציפיות וH רקע ₂ O ₂ מאות חיישן ה- ATP. כמה חיישנים גם זמינים מסחרי כדי לזהות analytes האחר כוללים אדנוזין, ionosine, hypoxanthine, אצטילכולין, כולין, גלוטמט, גלוקוז, חומצת החלב, ד-סרין ליישומי vivo לשעבר או אדנוזין, ionosine, וhypoxanthine לin vivo כאשר יחד עם ריק המקביל חיישן.

היכולת של החיישן לזיהוי מדויק analytes תלויה בטרום הנכון וכיולים שלאחר ^13. זה מבטיח שהניתוח מהווה להיסחף ברגישות חיישן המתרחש במהלך שימוש ברקמות ביולוגיות. החיישן מחזיק מחסן של גליצרול המשמש כמגיב בתגובות אנזימטיות החיישן. אם החיישן לא נעשה שימוש בפתרונות אמבטיה המכילים גליצרול, זה יהיה לשטוף החוצה לאורך זמן. r הקצרפעמים ecording אז הם הכרחיים כדי למזער להיסחף החיישן. בנוסף חיישן עכירות על ידי פרוטאזות אנדוגני ושברי חלבון יכול להפחית את הרגישות של החיישנים ¹⁴ מאוד.

כתב היד הנוכחית קובעת את השימוש בחיישני microelectrode האנזימטית לvivo לשעבר ובהכנות כליות vivo. כימות אנליטי בזמן אמת מספקת פירוט חסר תקדים של איתות תאית שעשויות לחשוף תובנות רומן לתוך המנגנונים של מחלות כליה וסוכנים תרופתיים.

Protocol

נהלי החיה הבאים דבקו במדריך NIH לטיפול ושימוש בחי מעבדה. אישור מראש התקבל מהוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC).
הערה: סקירה של הוראות יצרן החיישן צריכה להיעשות בשלבי תכנון הניסוי ולפני השימוש בם. ההנחיות באות יפיק תוצאות אופטימליות בעת שימוש בחיישנים.

1. חיישן כיול

1. הכן פתרונות מניות טריים לפני תחילת הניסוי.
2. צור מאגר המכיל 10 מ"מ חיץ NaPi, 100 מ"מ NaCl, 1 מ"מ MgCl _2, ו -2 גליצרול מ"מ. התאם את ה- pH 7.4 באמצעות NaOH. אחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס.
3. שימוש בריכוז ATP המניות (100 מ"מ) מאוחסן ב -20 ° C, ליצור פתרון כיול טרי 10 מ"מ ATP על ידי הוספת מניית 10 μl 90 μl של א 'המאגר
4. רעננות חיישן ה- ATP על ידי הצבת קצהו (איור 2) לtהוא תא להחזרת נוזלים המכיל מאגר לפחות 10 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס.
   הערה: לאחר התייבשות, לא צריכה להיות חשוף לאוויר החיישנים ליותר מ -20 שניות או רגישות החיישן עשויה להיות מופחתת. אם חשיפות ארוכות לאוויר צפויים, לטבול את החיישן בקצרה לפתרון של גליצרול. החיישנים יכולים לשמש לניסויים מרובים אך אלה חייבים להתרחש באותו היום כמו התייבשות חיישן. ניתן לאחסן את החיישנים בתא להחזרת נוזלים עם הצפת עד 24 שעות.
5. הפעל את potentiostat הערוץ הכפול (איור 3) ולהפעיל את תוכנת מערכת הקלטה.
6. הכן תא כיול עם 3 מיליליטר של חיץ א מקום האלקטרודה ההתייחסות לתא הכיול. קח כל חיישן מהתא להחזרת נוזלים, אז לצרף אותו למניפולטור ולהכניס אותו לתוך תא פתרון כיול.
   הערה: השתמש בצלחת פטרי סיליקון המצופה סטנדרטית כתא כיול. לבצע את כל הכיולים ורחudies בכלוב פאראדיי על שולחן אוויר מעבדה ביצועים גבוהים כדי להפחית את רעש האות במהלך הקלטות amperometry (איור 4). כיולים נעשים הטובים ביותר קרובים לתחילת איסוף הנתונים ככל האפשר. עבור יישומים בvivo הזמן האופטימלי לכיול הוא בתקופת ההתאוששות שלאחר ניתוח בבעלי החיים.
7. Vivo לשעבר כיול
   1. בצע voltammetry המחזורית בתא הכיול ידי רכיבה על אופני החיישנים מ-500 mV ל+500 mV בשיעור של 100 mV / sec במשך 10 מחזורים. זה משפר באופן משמעותי את הרגישות של החיישנים. ראה איור 5 לעקבות שנצפו מ10 המחזורים.
   2. לקטב החיישנים לmV 600 אחרי המחזור האחרון. החיישן הנוכחי ידעכו לאסימפטוטה. קריאה יציבה מושגת לאחר מינימום של 5 דקות. רשום את הקריאה אפס.
8. בכיול חיישן vivo
   1. אל תבצעו את voltammetry המחזורית בin vivo הצרRS. במקום זאת, לקטב את החיישן בתא הכיול במשך 30 שניות ל+500 mV. לאחר מכן קבע את potentiostat ל0 mV ולאפשר הנוכחי החיישן לעלות לאסימפטוטה. החיישן הנוכחי ייקח לפחות 2 דקות לאסימפטוטה. רשום את הקריאה אפס.
9. ברציפות להוסיף כמויות סט של פתרון ה- ATP לתא לייצר קו כיול מקיף טווח גילוי רצוי. פתרון ה- ATP מייצר שיא חד באות החיישן בתחילה, ואחריו ריקבון כATP מפזר באופן אחיד בכל התא. ערכי אות שיא פעם אחת את רמת האות התייצב לאחר כל הוספת ATP. 6A דמויות ועקבות 7 תכנית והציעו ריכוזי ה- ATP לשני vivo לשעבר ובמחקרי vivo, בהתאמה.
   הערה: חשוב כדי לאשר את הסלקטיביות של אלקטרודות באמצעות אוכלי נבלות של analytes. הפרוטוקול הנוכחי משמש apyrase כדי לבדוק את הספציפיות של חיישן ה- ATP וcatalase לH <תת> 2 O ₂ אות (6B דמויות). אם תרופות הן להינתן, מדידות של תגובתיות שלהם עם החיישנים צריכים להיקבע לפני המחקר.
10. הוסף 3 μl של apyrase ממלאי של 2 מ"ג / מיליליטר (89 האו"ם / מ"ג) כדי לבדוק ספציפי של חיישן ה- ATP (הנוכחי מיוצר על ידי יישום ה- ATP צריך להפחית לרמת אפס (איור 7).
11. הוסף 3 μl של catalase ממלאי של 2mg / מיליליטר (100 האו"ם / מ"ג) כדי לבדוק את הספציפיות של חיישן null (הנוכחיות מיוצר על ידי H ₂ O ₂ יישום צריך להפחית לקריאת אפס).

2. ניתוח בעלי חיים לחיישן לימודים

1. ניתוח לvivo לשעבר
   1. להרדים את החיה הניסיונית עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) / O כיתה רפואי ₂ או שיטה שאושרה עוד. ^{15 '12} בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח רמה נאותה של הרדמה. רחובתגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה מסוגלת משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה.
      הערה: להרדים בעלי החיים על פי פרוטוקולים שאושרו IACUC. בסיום כל ההליכים שאינם ההישרדות להרדים בעלי חיים עמוקים מורדמים על ידי פתיחת בית החזה וגורם pneumothorax כדי להבטיח את מותו האנושי של בעלי החיים ^12.
   2. מניחים את החולדה על שולחן ניתוחים בטמפרטורה מבוקרת במצב שכיבה. תוך שמירה על עומק הרדמה מתאים, לעשות חתך קו האמצע של כ 5 סנטימטרים בקו אחד עם הכליה השמאלית ולחשוף את אב העורקים בבטן דיסטלי.
   3. לעטוף מייתר סביב צליאק ועורקי mesenteric מעולים, ואב העורקים בבטן מעל העורקים האלה, אבל לא לקשור. לעטוף שני חיבורי אותיות סביב אב העורקים בבטן מתחת לעורקי הכליה.
   4. הצמד את אב העורקים בבטן מעל חיבורי האותיות. לקשור את המייתר נמוך יותר. קטטר אב העורקים בבטן עם צינורות פוליאתילן (PE50). Secure את הקטטר עם מייתר אב העורקים השני.
   5. הסר את המהדק ולקשור את עורקי mesenteric וצליאק. Perfuse הכליות בשעת 6 מיליליטר / דקה עם הנקס מאוזן תמיסת מלח על RT במשך 2-3 דקות, עד שהכליה החווירה לחלוטין.
   6. בלו הכליות וקטטר, מחוברים חלק של אב העורקים. מניחים את הכליות ל3 מיליליטר צלחת פטרי מלא פתרון אמבטיה.
      הערה: פרוטוקול ניסוי יכול להתבצע על RT. פתרון האמבטיה מכיל במ"מ: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl _2, 1 CaCl _2, 10 HEPES, pH 7.35 מותאמים עם NaOH.
2. ניתוח לin vivo
   1. להרדים את העכברוש תוך שימוש בפרוטוקולי IACUC אושר. לניתוח בvivo להרדים חולדות עם קטמין (20 מ"ג / קילוגרם IM) וinactin (50 מ"ג / IP קילוגרם). בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח רמה נאותה של הרדמה. תגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה יציבה משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה.
   2. לאחר עומק הרדמה נכון הוא לקבלאד, מניח את החולדה במצב שכיבה על משטח מוארק טמפרטורה מבוקרת ממוקם על שולחן האוויר. המשטח צריך להיות שחומם מראש ונשמר על 36 מעלות צלזיוס.
   3. תוך שמירה על עומק הרדמה מתאים, לעשות חתך קו האמצע כ 5 סנטימטרים בקו אחד עם הכליות.
   4. השתמש בתפר להסיט ולעגן את רקמת עור ותת עורי, כך שכל הכליה היא גלויה. מניחים את הכליות בכוס כליות כדי למזער את חפצי תנועה.
   5. השתמש בעירוי של BSA 2%: 0.9% NaCl ב 1 מיליליטר / 100 שעות / g דרך וריד הצוואר לשמור נפח דם. Cannulate שני השופכנים לאיסוף שתן. קשרי מקום סביב עורקי mesenteric וצליאק מעולים וaortal דיסטלי למניפולציה של לחץ פרפוזיה (10A דמויות).
   6. אם היישום של סוכנים תרופתיים נדרש במהלך ניסויי in vivo, החדרת קטטר ביניים מומלצת (10 ב איורים ).

התקנת 3. רכישת נתונים

1. פתח את תכנית רכישת נתונים ולהגדיר הקוטביות שלה לשני vivo לשעבר ובניסויי vivo לאנודית חיובית. הגדר את התכנית כדי לשמור את הנתונים כקוד ASCII.
2. מקם את micromanipulators להחדרה מהירה של החיישנים לכליות.
   הערה: לחלופין, להשתמש בבדיקת דמה שצורפה לmicromanipulator כדי לעזור להשיג את המיקום הרצוי של חיישנים.
3. Vivo לשעבר רכישת נתונים
   1. Perfuse הכליות עם פתרון אמבטיה (מ2.1.6) דרך אב העורקים cannulated בקצב קבוע של 650 μl / דקה. בעזרת מספריים כירורגיות, להסיר בזהירות את הקפסולה הכליות, אשר הכרחית להחדרת חיישן.
   2. אבטח את הכליות עם גומיות קשורות על הכליות ומחוברות לצלחת מצופה סיליקון עם סיכות.
   3. מניחים את האלקטרודה ההתייחסות קרובה לכליה בצלחת פטרי עם הקצה שלה שקוע בפתרון החיץ.
4. ברכישת נתונים vivo
   1. מניחים את הכליות בכוס כליות. בהתאם לזן וגיל של החיה להשתמש בגודל של כוס שמחזיקה את הכליות באופן רופף. איור 8 מראה שני גדלים של כוסות כליות. כוסות דומות משמשות לגישות פיסיולוגיות שונות המתמקדות בניתוח של תפקוד כליות כגון micropuncture וכו ^'16.
      הערה: המיקום של כוס הכליות הוא קריטי כדי להסיר את הרעש המכני המיוצר על ידי הנשימה של בעלי החיים, אבל לא צריך להפריע או לחסום זלוף כליות או זרימת שתן.
   2. לאפשר 45 דקות של זמן התאוששות לפני ביצוע איסוף נתונים.
   3. באמצעות מחט 26-30G, לעשות חור לנקב במיקום והעומק הרצויים של החיישן בכליות. למחוק את חור פני השטח כדי להסיר דם הקרין. להוסיף פתרון גליצרול אל פני השטח של הכליה. זה ימנע את פני השטח בכליות מהתייבשות במהלך הניסוי.
   4. הסר את החיישן הראשון מהתא להחזרת נוזלים ולצרף אותו לmicromanipulator. במהירות, תוך 20 שניות, להכניס את האלקטרודה לתוך החור הטרי שנוצר בכליות. חזור על שלבים 3.5-3.9 לחיישן null.
   5. הכנס את האלקטרודה ההתייחסות לכליות, כ 1 סנטימטר מהחיישנים.
5. הפעל את potentiostat ולהפעיל את תכנית ההקלטה במחשב. איור 9 מציג את ההגדרה הסופית של vivo לשעבר רכישת נתונים הכליות. איור 10 מראה את ההתקנה הסופית של in vivo רכישת נתונים כליות עם קטטר שהוכנס.

ניתוח נתונים 4.

1. לייבא את קובץ נתוני ASCII למקור או כל תוכנה דומה אחרת.
2. ביחס נוכחית ריכוז
   1. השתמש בפונקציה מתאימה / לחיץ ליניארי לבנות ריכוז ליניארי (ציר ה- X) למערכת יחסים הנוכחית (y -axis) ל- ATP או H ₂ נקודות O ₂ כיול (איורים 6 ו -7).
      קו ליניארי בכושר: = MX + b y
3. להשוות הנוכחי לריכוז
4. להפחית את העקבות המדודות של חיישן null מאלה של חיישן ה- ATP להשיג הנוכחי בפועל מיוצר על ידי ATP תאיים.
5. להמיר את ערכי ה- ATP ברשות הפלסטינית מתקבלים על ידי amperometry לננומטר באמצעות משוואת הכיול מפורטת ב4.2.1. קבע את הריכוז של עקבות נתונים מופחתים של חיישן ה- ATP על ידי יבוא כל נוכחית מותאמת לערך "x" ופתרון לy (ריכוז אנליטי).
6. באופן דומה, לחשב H ₂ O ₂ ריכוז מהמשוואה כיולה במידת צורך.

תוצאות

העיצוב של biosensor microelectrode האנזימטית מאפשר זיהוי של analytes בכל כליות בזמן אמת. עיצוב הניסוי הכללי לאו vivo לשעבר או במחקרי vivo מודגם באיור 1 חיישני .the משמשים והניתוחים שונים בהתאם אם המחקר הוא vivo לשעבר או in vivo.

Discussion

הפרוטוקולים הנוכחיים פותחו כדי לספק רזולוציה של זמן ומרחב משופר של ה- ATP _{ו- 2} O ₂ H איתות לכליות-perfused דם מבודדים vivo לשעבר, perfused וin vivo. ההבדלים בין הפרוטוקולים והחיישנים המשמשים כאן לספק נתונים רכישה אופטימלית לשני סוכנים תרופתיים או מחקרים פיסיולוג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensor Kit	Sarissa Biomedical	SBK-ATP-05-125	The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.  Also included with the kit is the user's choice of sensors.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-ATP-05-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold ATP Biosensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-ATP-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe null sensor 125 μm	Sarissa Biomedical	SBS-NUL-20-125	store at 2-8 oC before use
Sarissagold null sensor 50 μm	Sarissa Biomedical	SGS-NUL-10-50	store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe ATP Manual	Sarissa Biomedical		http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage	TMC
Dual channel potentiostat	Digi-Ivy	DY2021	Type II Faraday cage
Data acquisition program	Digi-Ivy	DY2000
Perfusion pump	Razel Scientific Instruments	Model R99E
Fiber optic illuminator	Schott	ACE 1
micromanipulator	Narishige	MM-3
micromanipulator magnetic stand	Narishige	GJ-8
air table	TMC	63-500
isoflurane ventilator	LEI Medical	M2000
3 ml petri dish	Fisher Scientific	S3358OA
needle	Santa Cruz		26-30 G
pins			Standard dissection pins
catheter			Polyethylene tubing (PE50)
catheter tissue glue	Vetbond	1469SB
suture	Look	SP117
rubber bands			any 2-4 mm wide rubber bands
silicone	Momentive	RTV-615 Clear 1#
clamp	Fine Science Tools	18052-03
standard dissection kit			Kit should include scalpel and dissection sissors
Kidney Cup			Of own design
standard chemicals	Sigma-Aldrich
ATP	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO	100 mM ATP solution
hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	216763
glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Apyrase	Sigma-Aldrich	A7646
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
isoflurane	Clipper	10250
inactin	Sigma-Aldrich	T133
ketamine	Clipper	2010012
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco	14025092