تحليل وضع الأسنان جرثومة تعصيب استخدام أجهزة ميكروفلويديك المشارك الثقافة

Summary

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Abstract

تعصيب يلعب دورا رئيسيا في تطوير والتوازن وتجديد الأعضاء والأنسجة. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء هذه الظواهر ليست مفهومة جيدا حتى الآن. على وجه الخصوص، وإهمال دور تعصيب في نمو الأسنان والتجدد.

قدمت عدة الدراسات المجراة على معلومات هامة حول أنماط تعصيب من أنسجة الأسنان خلال عمليات التنمية وإصلاح مختلف النماذج الحيوانية. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب ليست الأمثل لتسليط الضوء على الأساس الجزيئي للتفاعلات بين الألياف العصبية والأجهزة المستهدفة والأنسجة.

المشترك الثقافات تشكل وسيلة قيمة للتحقيق والتعامل مع التفاعلات بين الألياف العصبية والأسنان في بيئة تسيطر عليها والمعزولة. في العقود الأخيرة، وقد أجريت التقليدية المشترك الثقافات باستخدام نفس مستنبت لفترات قصيرة جدا (على سبيل المثال، يومين)للتحقيق في الآثار جذابة أو مثيرة للاشمئزاز لتطوير أنسجة الفم والأسنان على الألياف العصبية الحسية. ومع ذلك، لا بد من تمديد فترة ثقافة للتحقيق في آثار تعصيب على التشكل الأسنان وتمايز خلوي.

نظم على microfluidics تسمح المشترك الثقافات من الخلايا العصبية وأنواع مختلفة من الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة المناسب لها. لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن العقد الثلاثي التوائم (TG) والأسنان قادرين على البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة من الزمن عندما شارك في تربيتها في أجهزة ميكروفلويديك، وأنها تحافظ في هذه الظروف نمط تعصيب نفسه أنها تظهر في الجسم الحي.

على هذا الأساس، نحن تصف كيفية عزل ويصف التعاون ثقافة تطوير مثلث التوائم العقد والأسنان الجراثيم في البروتوكول ميكروفلويديك شارك في الثقافة system.This وسيلة بسيطة ومرنة للمشاركة في ثقافة العقد / الأعصاب والأنسجة المستهدفة ودراسة الأدوار من جزيئات محددة بشأن هذه التفاعلات في مقاولاتolled وبيئة معزولة.

Introduction

تعصيب يلعب دورا رئيسيا في تطوير والتوازن وتجديد الأعضاء والأنسجة ^1،2. وعلاوة على ذلك، تشارك تعصيب في تنظيم تكاثر الخلايا الجذعية، وتعبئة والتمايز ^3-5. في الواقع، أظهرت الدراسات الأخيرة التي تحققت في أنسجة مجمع فموي وجهي أن الأعصاب الحركية ضرورية لالظهارية وظيفة الخلايا الاصلية خلال تطوير وتجديد اللعابية الغدد ^6،7. وبالمثل، فقد ثبت أن تعصيب ضروري لتطوير وصيانة براعم الذوق ^8-11. وبالتالي، فمن المهم تحليل الأدوار إلا أنها مهملة من تعصيب في تطوير أجهزة فموي وجهي الهامة الأخرى والأنسجة مثل الأسنان.

على الرغم من تعصيب غنية من أسنان الكبار، وعلى النقيض من جميع الأعضاء والأنسجة الأخرى في الجسم، develoالأسنان بينغ تبدأ في أن معصب في المراحل الأولى بعد الولادة. تنشأ الأسنان نتيجة للتفاعلات متسلسلة ومتبادلة بين الأديم الظاهر عن طريق الفم والجمجمة العصبية المشتقة من قمة اللحمة المتوسطة. هذه التفاعلات تؤدي إلى خلايا تكوين المينا المستمدة الظهارية والخلايا المولدة للعاج المستمدة من اللحمة المتوسطة التي هي المسؤولة عن تشكيل المينا وعاج الأسنان، على التوالي ^12. الأعصاب الحسية من العقد مثلث التوائم والأعصاب متعاطفة من العقد عنق الرحم متفوقة يعصب أسنان البالغين ^13-15. خلال مرحلة التطور الجنيني، الألياف العصبية المنبثقة عن مشروع العقد الثلاثي التوائم نحو جراثيم الأسنان النامية وتدريجيا تحيط بهم ولكنها لا تخترق حليمة اللحمة المتوسطة طب الأسنان ^(13). الألياف العصبية تدخل اللب اللحمة المتوسطة الأسنان في مراحل نمو أكثر تقدما التي ترتبط مع التمايز مصورات العاج وعاج مصفوفة ترسب ^16. لب الأسنان تعصيب هو COMPLeted قريبا بعد بزوغ الأسنان في تجويف الفم ^(13). وقد كشفت الدراسات السابقة بأن مختلف semaphorins وneurotrophins يشاركون في تنظيم تعصيب أثناء تكون السن ^16-19. وقد أثبتت دراسات سابقة بوضوح أن تعصيب هو شرط أساسي لتكوين الأسنان في الأسماك ^20. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن توازن الخلايا الجذعية اللحمة المتوسطة الأسنان في القواطع الماوس ينظمه الأعصاب الحسية عن طريق إفراز القنفذ سونيك (SHH) ^21. ومع ذلك، فإن دور تعصيب في السن بدء وتطوير وتجديد لا يزال مثيرا للجدل في الثدييات ^22-24.

وقد قدم عدد كبير من الدراسات المجراة على معلومات هامة حول أنماط تعصيب من أنسجة الأسنان خلال عمليات التنمية وإصلاح مختلف النماذج الحيوانية ^13،25،26. ومع ذلك، فإن معظم هذه APPROأوجاع ليست الأمثل لتسليط الضوء على الأساس الجزيئي للتفاعلات بين الألياف العصبية والأجهزة المستهدفة والأنسجة. المشترك الثقافات تشكل وسيلة قيمة للتحقيق والتعامل مع التفاعلات بين الألياف العصبية والأسنان في بيئة تسيطر عليها والمعزولة ^26-29. في الوقت نفسه، وشارك في زراعة تخضع لتعديلات فنية مختلفة. على سبيل المثال، الأعصاب والأنسجة الأسنان محددة (على سبيل المثال، لب الأسنان، جريب الأسنان، طب الأسنان ظهارة) غالبا ما تتطلب ثقافة وسائل الإعلام المختلفة من أجل ضمان بقاء الأنسجة لفترات طويلة من الزمن ^30-32.

في العقود الأخيرة، وقد أجريت التقليدية المشترك الثقافات باستخدام نفس مستنبت لفترات قصيرة جدا (على سبيل المثال، يومين) للتحقيق في الآثار جذابة أو مثيرة للاشمئزاز لتطوير أنسجة الفم والأسنان على الألياف العصبية الحسية ^27-29.ومع ذلك، لا بد من تمديد فترة ثقافة للتحقيق في آثار تعصيب على التشكل الأسنان وتمايز خلوي، ودراسة ديناميات الألياف العصبية المتفرعة داخل الأجهزة المستهدفة. ولذلك، فإن غير متجاورة المشترك الثقافات يكون أكثر ملاءمة لإجراء دراسات على الخلايا العصبية الأسنان الأنسجة التفاعلات.

نظم على microfluidics تسمح المشترك الثقافات من الخلايا العصبية وأنواع مختلفة من الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة المناسب لها. في هذه الأجهزة، يتم فصل الأنسجة الأسنان والخلايا العصبية في أماكن مختلفة، بينما يسمح للنمو من المحاور من أجسام الخلايا العصبية من خلال microchannels نحو مقصورة تحتوي على الأنسجة المستهدفة ^33. تم الأجهزة ميكروفلويديك تستخدم بالفعل لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة ^34،35، فضلا عن الخلية إلى التفاعلات الخلية في سرطان واتساع الأوعية الدموية ^35. وعلاوة على ذلك، وقد استخدمت هذه الأنظمة لدراسة التفاعلات بين DORSآل العقد الجذرية وبانيات ^36.

لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن العقد الثلاثي التوائم (TG) والأسنان قادرين على البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة من الزمن عندما شارك في تربيتها في أجهزة ميكروفلويديك ^37. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن الأسنان من مراحل تنموية مختلفة الحفاظ في هذه الظروف في المختبر نفس الآثار مثير للاشمئزاز أو جذابة على تعصيب مثلث التوائم أنها تظهر في الجسم الحي ^37. وينص هذا البروتوكول على معلومات حول طريقة بسيطة وقوية ومرنة للمشاركة في ثقافة العقد / الأعصاب والأنسجة المستهدفة ودراسة دور جزيئات محددة بشأن هذه التفاعلات في بيئة تسيطر عليها والمعزولة.

Protocol

واستمرت كل الفئران والتعامل معها وفقا لقانون رعاية الحيوان السويسري وامتثالا لتعليمات مكتب كانتون البيطرية، زيورخ.

1. إعداد تشريح المواد، الثقافة وسائل الإعلام، أجهزة ميكروفلويديك

1. الأوتوكلاف ملقط تشريح الصغرى والمقص (121 ° C، التعقيم الوقت: 20 دقيقة) وتخزينها في حاوية معقمة.
2. تعقيم coverslips الزجاج (24 ملم × 24 ملم) التي يحتضنها منهم في 1 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 24 ساعة على شاكر المداري عند 37 درجة مئوية. غسلها ثلاث مرات مع معقم، المقطر H ₂ O وثلاث مرات مع الإيثانول 99٪. جاف ثم لل coverslips عند 37 درجة مئوية أو تحت غطاء تدفق العقيمة. أخيرا، الأوتوكلاف أو فضح لل coverslips للأشعة فوق البنفسجية (30 دقيقة) لإتمام عملية التعقيم. ويمكن بعد ذلك أن يتم تخزين Coverslips في الايثانول 70٪.
3. إزالة بعناية الأجهزة عزل AXIS أكسون من الحزمة باستخدام ملقط معقم ووضعها في طبق بتري معقمة.
4. عن طريق خزعة لكمة معقمة (ø: 1MM) خلق ثقب واحد لكل عينة من زراعتها (الشكل 1) في المراسلات الدوائر الثقافة.
   ملاحظة: لا لكمة قريبة جدا من microgrooves، لأنها قد تكون تضررت من الضغوط التي مورست.
5. تعقيم الأجهزة عزل AXIS أكسون التي كتبها immerging لهم في الايثانول 70٪. ثم الجافة الأجهزة عزل AXIS أكسون وcoverslips تماما تحت غطاء تدفق العقيمة. الانتظار لمدة لا تقل عن 3 ساعات قبل المتابعة.
   ملاحظة: تجفيف ناقصة ستؤدي إلى التجمع على عيب من الأجهزة ميكروفلويديك.
6. وضع كل ساترة إلى 35 مم طبق بتري أو في بئر داخل لوحة 6 آبار.
7. وضع AXIS أكسون عزل الأجهزة على ساترة واضغط بلطف ولكن بحزم مع ملقط مع نهايات عازمة من أجل السماح للالتصاق كامل بين الجهاز العزلة وساترة الزجاج.
8. في كل غرفة الثقافة، ماصة 150 ميكرولتر من بولي-D-ليسين (0.1 ملغ / مل في العقيمة، المقطر H ₂O). وضع أجهزة ميكروفلويديك في ظل فراغ لمدة 5 دقائق، وذلك لإزالة كل الهواء من غرف الثقافة.
9. ما إذا كان يمكن النظر إلى الهواء داخل الغرف وإعادة ماصة الحل بولي-D-يسين في غرف.
10. احتضان الأجهزة مع O بولي-D-يسين / N عند 37 درجة مئوية.
11. غسل غرف ثلاث مرات مع معقم، H المقطر ₂ O.
12. ملء الغرف مع 150 ميكرولتر حل العاملة laminin (سيغما الدريتش، 5 ميكروغرام / مل، في برنامج تلفزيوني أو المصل خالية المتوسطة)، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
13. تجهيز 50 مل من المتوسط ​​للثقافات العقد مثلث التوائم ^37، تتألف على النحو التالي: 48 مل Neurobasal المتوسطة، 1 مل B-27، و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، 5 نانوغرام / مل عامل نمو الأعصاب (NGF) ، 12:25 السيتوزين الأرابينوزيد.
14. تجهيز 50 مل من المتوسط ​​للثقافات الجرثومية الأسنان ^37، تتألف على النحو التالي: 40 مل DMEM-F12، 10 مل مصل بقري جنيني (FBS، التركيز النهائي: 20٪)، و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، 150 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك.

2. ماوس الجيل الأجنة والتشريح

1. تحديد العمر الجنيني وفقا للسد عن طريق المهبل (المكونات المهبلية: يوم الجنينية للتنمية 0.5، E0.5) وتأكيد ذلك من خلال معايير شكلية. لهذا البروتوكول، ونحن عادة استخدام أجنة الفئران E14.5-E17.5.
2. تنظيف المنطقة تشريح والمجسام مع الايثانول 70٪.
3. تضحية الأم الحامل عبر خلع عنق الرحم. منع رقبة الفأر مع الإصبع الأول والثاني على الشبكة، وسحب لقرار الذيل.
4. تشريح الجلد حول الجزء الأسفل من البطن، وفتح البطن باستخدام مقص. تحديد الرحم: خلال هذه المراحل المتأخرة من الحمل، والرحم تملأ تماما تجويف البطن.
5. تشريح خارج الرحم ووضعه في أنبوب مملوء PBS على الجليد. عندما على الجليد، والأنسجة يمكن أن تترك لعدة ساعة. تجاهل جثة الأم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية
<لى> تشريح خارج الأجنة من الرحم وتحريرهم من أنسجتها خارج الجنين. وضع الأجنة في برنامج تلفزيوني على الجليد.
6. قطع رأس الأجنة باستخدام مقص، وفصل الفك السفلي عن بقية الرأس باستخدام مقص تشريح الصغيرة (الشكل 2A). إزالة بالضبط الفك السفلي، دون الإضرار العقد مثلث التوائم. كما يتم ترجمة هذا الأخير على مقربة من الفك السفلي، والضرر العرضي هو ممكن. الحفاظ على الفك السفلي وبقية الرأس في برنامج تلفزيوني الباردة، على الجليد.
7. لتشريح TG، واتخاذ الرأس وضعه على طبق بتري الزجاج تشريح، وشغل سابقا مع PBS الباردة. باستخدام ملقط، إزالة الجلد والجمجمة. إزالة ثم الدماغ الانتهائي والمخيخ عن طريق وضع ملقط تحت الدماغ الانتهائي ورفع. فإن الدماغ الانتهائي والمخيخ الوجه معا، وترك الجزء السفلي من الجمجمة المكشوفة.
8. توطين العقد الثلاثي التوائم (كما هو موضح في الشكل 2B). استخدام ملقطلفصل TG من الأعصاب مثلث التوائم. القضاء على ما تبقى من التوقعات مثلث التوائم باستخدام الإبر تشريح كما السكاكين. وضع TG تشريح في طبق بتري مليئة PBS الباردة والاحتفاظ بها على الجليد.
9. لتشريح الأسنان الجنينية، ووضع الفك السفلي، وفصلها في السابق من الجمجمة، وعلى الزجاج تشريح طبق بتري، مليئة PBS الباردة. استخدام الإبر تشريح كما السكاكين، وإزالة اللسان والجلد المحيط بها الفك. فصل اليسار واليمين بين فكي هيمي عن طريق قطع على طول خط الوسط من الفك. جراثيم الأسنان مرئية بسهولة، كما هو مبين في الشكل 1C. عزل جراثيم الأسنان باستخدام الإبر تشريح وإزالة الزائد من الأنسجة غير الأسنان. وضع جراثيم الأسنان تشريح في طبق بتري مليئة PBS الباردة والاحتفاظ بها على الجليد.

3. ميكروفلويديك المشارك الثقافات

1. بعد التشريح، وإزالة laminin من الأجهزة ميكروفلويديك. ملء الغرف مع 200 ميكرولتر من respectiلقد سائل الإعلام.
2. بالملقط، ونقل بلطف تشريح TG والأسنان الجراثيم في الثقوب التي أنشأتها اللكم (1D الشكل). تأكد من أن الجراثيم الأسنان لا تطفو وأنها تغرق حتى الاتصال لل coverslips.
3. ثقافة العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
4. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل 48 ساعة. لا إفراغ غرف تماما، ولا ماصة مباشرة إلى غرف الثقافة. تفريغ كامل للغرف شأنه أن يؤدي إلى تشكيل فقاعات الهواء داخل غرف. سوف pipetting لمباشرة الى غرفة يؤدي إلى تلف المحاور. لتجنب هذه المشاكل، وإزالة المتوسطة مشيرا ماصة نحو الجانب الخارجي من الآبار. وبالمثل، ماصة متوسطة جديدة إلى جانب الآبار الواقعة قبالة الدوائر.
5. خلال الفترة الثقافة والثقافات شارك ويمكن تصويرها بسهولة عن طريق الوقت الفاصل بين المجهري. يمكن الحفاظ المشترك الثقافات لأكثر من 10 يوما.
6. بعد اللثة الثقافةد، وغسل الدوائر من قبل pipetting 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في بئر واحدة لكل غرفة، والسماح PBS تتدفق من خلال الدوائر الثلاث مرات.
7. إزالة برنامج تلفزيوني وإصلاح عينات من قبل pipetting 150 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (في برنامج تلفزيوني) في بئر واحدة لكل غرفة. في احتضان RT لمدة 15 دقيقة.
8. غسل الدوائر مرتين مع PBS كما هو موضح في 3.6.
9. المضي قدما في مزيد من التحليل.

النتائج

وتشير هذه النتائج إلى أن العقد الثلاثي التوائم معزولة يمكن أن تنمو في حجرة واحدة من الجهاز ميكروفلويديك وبالإضافة إلى ذلك، أن تطور جراثيم الأسنان معزولة وتدوم لفترة طويلة من الوقت في حجرة أخرى من الجهاز ميكروفلويديك. وتستخدم وسائل الإعلام ثقافة مختلفة في القسمين، و...

Discussion

سابقة في الدراسات المختبرية من تعصيب الأسنان استندت شارك الثقافات التقليدية من العقد مثلث التوائم وأنسجة الأسنان أو خلايا ^26،28،29. وأجريت هذه الدراسات للتحقيق أساسا الآثار جذابة من هذه الخلايا أو الأنسجة على محاور الحسية ^38. على الرغم من تحقيق تق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033