Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura

Riepilogo

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Abstract

Innervazione svolge un ruolo chiave nello sviluppo, omeostasi e la rigenerazione di organi e tessuti. Tuttavia, i meccanismi alla base di questi fenomeni non sono ancora ben compresi. In particolare, il ruolo di innervazione in sviluppo dentale e rigenerazione è trascurato.

Diversi studi in vivo hanno fornito importanti informazioni sui modelli di innervazione di tessuti dentali durante lo sviluppo e riparazione processi di vari modelli animali. Tuttavia, la maggior parte di questi approcci non sono ottimali per evidenziare le basi molecolari delle interazioni tra le fibre nervose e organi bersaglio e dei tessuti.

Co-culture costituiscono un valido metodo per indagare e manipolare le interazioni tra le fibre nervose e denti in un ambiente controllato e isolato. Negli ultimi decenni, co-colture convenzionali utilizzando lo stesso terreno di coltura sono stati effettuati per periodi molto brevi (ad esempio, due giorni)per studiare gli effetti di attrazione o repulsione di sviluppare tessuti orali e dentali su fibre nervose sensoriali. Tuttavia, l'estensione del periodo di coltura è necessario per studiare gli effetti del innervazione sul dente morfogenesi e citodifferenziazione.

Sistemi di microfluidica permettono co-colture di neuroni e diversi tipi di cellule nella loro terreni di coltura appropriati. Abbiamo recentemente dimostrato che gangli del trigemino (TG) ed i denti sono in grado di sopravvivere per un lungo periodo di tempo in cui co-coltivate in dispositivi microfluidici, e che mantengono in queste condizioni lo stesso modello innervazione che mostrano in vivo.

Su questa base, si descrive come isolare e co-coltura di sviluppo del trigemino gangli e dei denti germi in un protocollo di co-coltura microfluidica system.This descrive un modo semplice e flessibile di co-coltura gangli / nervi e tessuti bersaglio e per studiare i ruoli di molecole specifiche su tali interazioni in un controlled e ambiente isolato.

Introduzione

Innervazione svolge un ruolo chiave nello sviluppo, omeostasi e la rigenerazione di organi e tessuti ^1,2. Inoltre, innervazione è coinvolto nella regolazione della proliferazione delle cellule staminali, la mobilitazione e la differenziazione ^3-5. Infatti, recenti studi realizzati in tessuti del complesso orofacciale hanno dimostrato che i nervi parasimpatici sono necessari per la funzione epiteliali cellule progenitrici durante lo sviluppo e la rigenerazione delle ghiandole salivari ^6,7. Analogamente, è stato dimostrato che innervazione è necessario per lo sviluppo e il mantenimento delle papille gustative ^{8 - 11.} Pertanto, è importante analizzare i ruoli ancora trascurati innervazione nello sviluppo di altri importanti organi e tessuti orofacciali come i denti.

Nonostante la ricca innervazione dei denti adulti, e in contrasto con tutti gli altri organi e tessuti del corpo, svidenti ping cominciano ad essere innervato nelle fasi postnatali prime. Denti si sviluppano a causa di interazioni sequenziali e reciproche tra l'ectoderma orale e cranio neurale mesenchima crest-derivati. Queste interazioni danno luogo a ameloblasts epiteliali derivate e odontoblasti mesenchima-derivati ​​che sono responsabili della formazione di smalto e dentina, rispettivamente ^12. Nervi sensoriali del gangli trigeminali e nervi simpatici dai gangli cervicale superiore innervano i denti adulti ^{13 - 15.} Durante l'embriogenesi, fibre nervose che emana dal progetto gangli trigeminali verso i germi di sviluppo dei denti e progressivamente li circondano, ma non penetrare nel dentale papilla mesenchima ^13. Fibre nervose entrano la polpa dentale mesenchima a stadi di sviluppo più avanzati che correlano con la differenziazione odontoblast e matrice dentina deposizione ^16. Dental polpa innervazione è completed subito dopo l'eruzione dei denti nel cavo orale ^13. Studi precedenti hanno rivelato che diversi semaforine e neurotrofine sono coinvolti nella regolazione della innervazione durante l'odontogenesi ^16-19. Studi precedenti hanno chiaramente dimostrato che innervazione è un prerequisito per la formazione dei denti nei pesci ^20. Studi più recenti hanno dimostrato che l'omeostasi delle cellule staminali mesenchima dentale in incisivi mouse è regolata da nervi sensoriali attraverso la secrezione di sonic hedgehog (Shh) ^21. Tuttavia, il ruolo di innervazione in dente iniziazione, lo sviluppo e la rigenerazione è ancora molto controversa nei mammiferi ^{22 - 24.}

Una pletora di studi in vivo hanno fornito importanti informazioni sui modelli di innervazione di tessuti dentali durante lo sviluppo e riparazione processi di vari modelli animali ^13,25,26. Tuttavia, la maggior parte di questi Approdolori non sono ottimali per evidenziare le basi molecolari delle interazioni tra le fibre nervose e organi bersaglio e dei tessuti. Co-culture costituiscono un valido metodo per indagare e manipolare le interazioni tra le fibre nervose e denti in un ambiente controllato e isolato ^{26 a 29 -.} Allo stesso tempo, co-coltura è soggetta a varie regolazioni tecniche. Ad esempio, nervi e tessuti dentali specifici (ad esempio, pasta dentale, follicolo dentale, epitelio dentale) spesso richiedono terreni di coltura diversa per garantire la sopravvivenza del tessuto per lunghi periodi di tempo ^30-32.

Negli ultimi decenni, co-colture convenzionali che utilizzano lo stesso mezzo di coltura sono stati effettuati per periodi molto brevi (ad esempio, due giorni) per studiare gli effetti di attrazione o repulsione di sviluppare tessuti orali e dentali sulle fibre nervose sensoriali ^27-29.Tuttavia, l'estensione del periodo di coltura è necessario per studiare gli effetti di innervazione sul dente morfogenesi e citodifferenziazione, e per studiare le dinamiche di fibre nervose si diramano all'interno organi bersaglio. Pertanto, co-colture non contigui sarebbe più adatto per realizzare studi su tessuti interazioni neuronali-dentale.

Sistemi di microfluidica permettono co-colture di neuroni e diversi tipi di cellule nella loro terreni di coltura appropriati. In questi dispositivi, tessuti dentali e neuroni sono separati in differenti compartimenti, pur consentendo la crescita degli assoni dai corpi cellulari neuronali attraverso microcanali verso il compartimento contenente il tessuto bersaglio ^33. Dispositivi microfluidici sono già stati utilizzati per studiare le interazioni tra neuroni e microglia ^34,35, così come cellule alle interazioni cellulari nel cancro e neovascolarizzazione ^35. Inoltre, questi sistemi sono stati utilizzati per studiare le interazioni tra dorsal gangli e osteoblasti ^36.

Abbiamo recentemente dimostrato che gangli del trigemino (TG) ed i denti sono in grado di sopravvivere per lunghi periodi di tempo quando co-coltivate in dispositivi microfluidici ^37. Inoltre, abbiamo dimostrato che i denti da diverse fasi di sviluppo di mantenere in queste condizioni in vitro gli stessi effetti ripugnanti o attraenti innervazione del trigemino che mostrano in vivo ^37. Questo protocollo fornisce informazioni su un modo semplice, potente e flessibile di co-coltura gangli / nervi e tessuti bersaglio e per studiare il ruolo di molecole specifiche su tali interazioni in un ambiente controllato e isolato.

Protocollo

Tutti i topi sono stati mantenuti e gestiti secondo la Legge benessere degli animali svizzera e nel rispetto delle norme del ufficio cantonale di veterinaria, Zurigo.

1. Preparazione di dissezione Materiale, Cultura Media, dispositivi microfluidici

1. Autoclave pinze micro-dissezione e forbici (121 ° C, tempo di sterilizzazione: 20 min) e conservarle in un contenitore sterile.
2. Sterilizzare coprioggetto di vetro (24 mm x 24 mm) da loro incubazione in 1 M HCl per 24 ore in un agitatore orbitale a 37 ° C. Lavare per tre volte con una soluzione sterile, H ₂ O distillata e tre volte con etanolo 99%. Secco poi i coprioggetti a 37 ° C o sotto cappa a flusso sterile. Infine, autoclave o esporre i coprioggetti alla luce UV (30 min) per completare la sterilizzazione. Coprioggetto possono essere conservati in etanolo al 70%.
3. Rimuovere accuratamente i dispositivi di isolamento AXIS Axon dal pacchetto con pinza sterile e metterli in una piastra di Petri sterile.
4. Utilizzando una biopsia sterile (ø: 1mm) creare un foro per ogni campione da coltivate (figura 1) in corrispondenza delle camere di coltura.
   NOTA: Non pugno troppo vicino alle microscanalature, in quanto potrebbero essere danneggiati dalla pressione applicata.
5. Sterilizzare i dispositivi di isolamento AXIS Axon da loro immergendo in etanolo al 70%. Asciutto, quindi AXIS Axon dispositivi di isolamento e coprioggetti completamente sotto una cappa a flusso sterili. Attendere almeno 3 ore prima di procedere.
   NOTA: essiccazione incompleta provocherà assemblaggio difettoso dei dispositivi microfluidici.
6. Posizionare ogni vetrino in una capsula di Petri da 35 mm o in un pozzo all'interno di un 6-pozzetti.
7. Posizionare il dispositivo di isolamento AXIS Axon sul vetrino e premere delicatamente ma con fermezza, con una pinza con estremità piegate in modo da consentire la piena adesione tra il dispositivo di isolamento e il vetrino di vetro.
8. In ciascuna camera di coltura, pipetta 150 ml di poli-D-lisina (0,1 mg / ml in sterile, distillata H ₂O). Posizionare i dispositivi microfluidici sotto vuoto per 5 minuti, per eliminare tutta l'aria dalle camere di coltura.
9. Se l'aria è ancora visibile all'interno delle camere, ri-pipetta la soluzione poli-D-lisina nelle camere.
10. Incubare i dispositivi con poli-D-lisina O / N a 37 ° C.
11. Lavare camere tre volte con sterili, H ₂ O. distillata
12. Riempire camere con 150 microlitri soluzione laminina lavoro (Sigma-Aldrich, 5 mcg / ml, in PBS o terreno privo di siero), e incubare O / N a 37 ° C.
13. Preparare 50 ml di terreno per le colture gangli trigeminali ^37, così composto: 48 ml Neurobasal medio, 1 ml di B-27, 100 U / ml di penicillina / streptomicina, 2 mM L-glutammina, 5 ng / ml fattore di crescita nervoso (NGF) , 12:25 citosina arabinoside.
14. Preparare 50 ml di mezzo di crescita per dente germinali ^37, così composto: 40 ml DMEM-F12, 10 ml di siero bovino fetale (FBS, concentrazione finale: 20%), 100 U / ml di penicillina / streptomicina, 2 mM L-glutammina, 150 mg / ml di acido ascorbico.

Embrione Generazione ed Dissection 2. mouse

1. Determinare l'età embrionale secondo tappo vaginale (spina vaginale: embrionale giorno di sviluppo 0.5, E0.5) e confermare tramite criteri morfologici. Per questo protocollo, generalmente usiamo gli embrioni E14.5 E17.5-mouse.
2. Pulire l'area dissezione e lo stereoscopio con etanolo al 70%.
3. Sacrifica la madre incinta tramite dislocazione cervicale. Bloccare il collo del mouse con il primo e secondo dito su una griglia, e tirare con decisione la coda.
4. Sezionare la pelle intorno basso addome, e aprire l'addome con le forbici. Individuare l'utero: durante queste ultime fasi della gravidanza, l'utero abbondantemente riempire la cavità addominale.
5. Sezionare l'utero e posto in un tubo riempito con PBS sul ghiaccio. Quando sul ghiaccio, il tessuto può essere lasciato per vari hr. Eliminare il cadavere della madre in base alle linee guida istituzionali
6. sezionare gli embrioni dall'utero e liberarli dai loro tessuti extraembrionali. Mettere gli embrioni in PBS sul ghiaccio.
7. Decapitare gli embrioni con forbici, e separare la mascella inferiore dal resto della testa con le forbici micro-dissezione (Figura 2A). Rimuovere proprio la mascella inferiore, senza danneggiare i gangli del trigemino; come quest'ultimo sono localizzate in prossimità della mascella inferiore, il loro danneggiamento accidentale è possibile. Conservare la mandibola e il resto della testa in PBS freddo, sul ghiaccio.
8. Per sezionare TG, prendere la testa e metterlo su un piatto di vetro Petri dissezione, già pieno di PBS freddo. Utilizzando le pinze, togliere la pelle e il cranio. Rimuovere poi il telencefalo e il cervelletto ponendo forcipe sotto telencefalo e ascensore; telencefalo e cervelletto si capovolgere insieme, lasciando il fondo del cranio esposto.
9. Localizzare gangli del trigemino (Figura 2B). Utilizzare le pinzeper separare il TG dai nervi trigemino. Eliminare i resti delle proiezioni trigeminali con gli aghi di dissezione come coltelli. Posizionare il TG sezionato in una capsula di Petri riempita con PBS freddo e tenerli su ghiaccio.
10. Per sezionare denti embrionali, posizionare la mascella inferiore, precedentemente separato dal cranio, sulla piastra di Petri di vetro dissezione, pieno di PBS freddo. Usando aghi dissezione come coltelli, rimuovere la lingua e la pelle che circonda la mascella. Separare la destra emi-griffe sinistra e tagliando lungo la linea mediana della mandibola. I germi dei denti sono facilmente visibili, come mostrato nella Figura 1C. Isolare i germi dei denti utilizzando aghi dissezione e rimuovere l'eccesso di tessuti non-dentali. Posizionare i germi dente sezionato in una capsula di Petri riempita con PBS freddo e tenerli su ghiaccio.

3. Microfluidic co-culture

1. Dopo la dissezione, rimuovere laminina dai dispositivi microfluidica. Riempire le camere con 200 microlitri della respective media.
2. Con pinze, trasferire delicatamente i TG e dei denti germi sezionato nei fori creati dalla punzonatura (Figura 1D). Assicurarsi che i germi dei denti non galleggiano e che affondano fino a quando entrano in contatto con le lamelle.
3. Cultura campioni in incubatore a 37 ° C, 5% di CO _2.
4. Modificare il terreno di coltura ogni 48 ore. Non svuotare le camere completamente, e non pipettare direttamente nelle camere di coltura. Completo svuotamento delle camere comporterebbe la formazione di bolle d'aria all'interno delle camere; pipettaggio diretto nella camera potrebbe causare un danno assonale. Per evitare questi problemi, rimuovere il supporto punta della pipetta verso il lato esterno dei pozzetti; analogamente, pipettare il mezzo fresco sulla parete del pozzetto situato di fronte alle camere.
5. Durante il periodo di coltura, co-culture possono essere facilmente ripreso al microscopio time-lapse. Co-culture possono essere mantenuti per più di 10 giorni.
6. Dopo il perio culturad, lavare le camere pipettando 150 ml di soluzione in un pozzo per ogni camera, e lasciando PBS fluire attraverso le camere per tre volte.
7. Rimuovere la PBS e fissare i campioni pipettando 150 ml di paraformaldeide 4% (in PBS) in un pozzetto per camera; incubare a temperatura ambiente per 15 min.
8. Lavare le camere due volte con PBS come descritto in 3.6.
9. Procedere con ulteriori analisi.

Risultati

Questi risultati mostrano che isolati gangli trigemini possono crescere in un compartimento del dispositivo microfluidico e, inoltre, che lo sviluppo dei germi isolati dente è mantenuta per un lungo periodo di tempo in altro compartimento del dispositivo microfluidico. Diversi terreni di coltura sono utilizzati nei due scomparti, e le microscolpiture tra i due compartimenti consentono estensione dell'assone dal ganglio trigeminale verso i germi di sviluppo dei denti. Figura 3 rappresenta una visual...

Discussione

Precedente in studi in vitro di dente innervazione erano basati su co-colture convenzionali di gangli trigeminali e tessuti dentali o cellule ^26,28,29. Sono stati condotti Questi studi per investigare principalmente gli effetti interessanti di queste cellule o tessuti di assoni sensoriali ^38. Anche se portare significativi progressi nel campo, alcuni problemi tecnici sono state sollevate. Germi denti cominciano a degenerare dopo pochi giorni di coltura ^37. Sulla base di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033