Анализ Разработка зуб Микроб иннервации Использование Микрожидкостных Сотрудничество культуры устройств

Резюме

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Аннотация

Иннервация играет ключевую роль в разработке, гомеостаза и регенерации органов и тканей. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе этих явлений не хорошо, но понял. В частности, роль в развитии иннервации зубов и регенерации пренебречь.

Несколько в естественных исследований получены важные сведения о закономерностях иннервации тканей зубов во время развития и ремонтных процессов различных животных моделях. Тем не менее, большинство из этих подходов не являются оптимальными для выделения молекулярную основу взаимодействий между нервными волокнами и контрольных органов и тканей.

Co-культуры представляют собой ценный метод для исследования и манипулирования взаимодействия между нервными волокнами и зубов в контролируемой и изолированной среде. В последние десятилетия, обычные совместных культурах, используя тот же культуральную среду были проведены в течение очень коротких периодов (например, два дня)исследовать привлекательные или отталкивающие эффекты развивающихся устные и зубные ткани на сенсорных нервных волокон. Тем не менее, продление срока культуры, необходимых для расследования последствий иннервации на зуб морфогенеза и дифференцировки клеток.

Microfluidics системы позволяют совместное культивирование нейронов и различных типов клеток в их соответствующей культуральной среде. Недавно мы показали, что тройничного ганглиев (ТГ) и зубы способны выживать в течение длительного периода времени при совместном культивировании в микрожидкостных устройств, и что они поддерживают в этих условиях тот же шаблон иннервации, что они показывают в естественных условиях.

На этой основе, мы опишем, как изолировать и совместное культивирование развития тройничного ганглиев и зубные бактерии в протоколе микрофлюидных сокультуры system.This описывает простой и гибкий способ совместного культивирования ганглиев / нервы и ткани-мишени и изучать роли специфических молекул на таких взаимодействий в Controlled и изолированная среда.

Введение

Иннервация играет ключевую роль в разработке, гомеостаза и регенерации органов и тканей ^1,2. Кроме того, иннервации участвует в регуляции пролиферации стволовых клеток, мобилизации и дифференциации ^{3 - 5.} Действительно, недавние исследования, реализованные в тканях орофациального комплекса показали, что парасимпатических нервов являются необходимыми для функции эпителия клеток-предшественников во время развития и регенерации слюнных желез ^6,7. Точно так же было показано, что иннервация необходимо для развития и поддержания вкусовых рецепторов ^{8 - 11.} Таким образом, важно, чтобы проанализировать еще пренебрегают роли иннервации в развитии других важных орофациальных органов и тканей, таких как зубы.

Несмотря на богатой иннервации взрослых зубов, и в отличие от всех других органов и тканей тела, Develoзубы пинг начинают иннервируются на самых ранних стадиях постнатального. Зубы развиваются в результате последовательных и взаимных взаимодействий между ротовой эктодермы и черепной нервного гребня полученных мезенхимы. Эти взаимодействия приводят к эпителиальным полученных ameloblasts и мезенхимы, полученных одонтобластами, которые отвечают за формирование эмали и дентина, соответственно ^12. Сенсорные нервы от тройничного ганглиев и симпатических нервов от верхнего шейного ганглия иннервируют взрослые зубы ^{13 - 15.} В процессе эмбриогенеза, нервные волокна, исходящие из тройничного ганглиев проекта к проявляющему зубных зачатков и постепенно окружают их, но они не проникают в зубной сосочек мезенхимы ^13. Нервные волокна входят зубной пульпы мезенхиму на более продвинутых стадиях развития, которые коррелируют с одонтобласт дифференцировки и дентин матрицы осаждения ^16. Стоматологическая иннервации мякоть сбореeted вскоре после прорезывания зубов в полости рта ^13. Предыдущие исследования показали, что различные Semaphorins и нейротрофины участвуют в регуляции иннервации во одонтогенеза ^{16 - 19.} Более ранние исследования ясно показали, что иннервация предпосылкой для формирования зубов у рыб ^20. Более поздние исследования показали, что гомеостаз стоматологическая мезенхимового стволовых клеток в резцах мыши регулируется с помощью сенсорных нервов секреции звуковой еж (тсс) ^21. Тем не менее, роль иннервации зубов инициации, развития и регенерации еще весьма спорным у млекопитающих ^{22 - 24.}

Множество естественных условиях исследования в дали важную информацию о закономерностях иннервации тканей зубов во время развития и ремонтных процессов различных животных моделях ^13,25,26. Тем не менее, большинство из них APPROболи не являются оптимальными, чтобы выделить молекулярные основы взаимодействий между нервными волокнами и целевых органов и тканей. Co-культуры представляют собой ценный метод для исследования и манипулирования взаимодействия между нервными волокнами и зубов в контролируемой и изолированной среде ^{26 - 29.} В то же время, сокультивирования подлежит различных технических корректировок. Например, нервов и конкретных зубных тканей (например, зубной пульпы, стоматологические фолликул, стоматологические эпителия) часто требуют различных питательных сред для того, чтобы гарантировать выживание ткани в течение длительных периодов времени ^{30 - 32.}

В последние десятилетия, обычные сокультурах, используя тот же питательную среду были проведены в течение очень коротких периодов (например, два дня), чтобы исследовать привлекательные или отталкивающие эффекты развивающихся устные и зубные ткани на сенсорных нервных волокон ^{27 - 29.}Тем не менее, продление срока культуры, необходимых для расследования последствий иннервации на зуб морфогенеза и дифференцировки клеток, и для изучения динамики нервных волокон ветвящихся в органах-мишенях. Таким образом, несмежных сокультурах бы быть более подходящим для выполнения исследований по нейронных-зубных тканей взаимодействий.

Microfluidics системы позволяют совместное культивирование нейронов и различных типов клеток в их соответствующей культуральной среде. В этих устройствах, зубные ткани и нейроны разделены в различных отсеках, позволяя при этом рост аксонов от нервных клеток органов через микроканалы в сторону отсека, содержащего их ткани-мишени ^33. Микрофлюидных устройства уже используются для изучения взаимодействий между нейронами и микроглии ^34,35, а также клетки к клетке взаимодействий при раке и неоваскуляризации ^35. Кроме того, эти системы были использованы для изучения взаимодействия между дверьмиаль ганглии и остеобласты ^36.

Мы недавно показали, что невралгия тройничного ганглиев (ТГ) и зубы могут выжить в течение длительных периодов времени при совместном культивировании в микрофлюидных устройств ^37. Кроме того, мы показали, что зубы из разных стадиях развития поддерживать в этих условиях в пробирке же отталкивания или притяжения эффектов на тройничного иннервации, что они показывают в естественных условиях ^37. Этот протокол предоставляет информацию о простой, но мощный и гибкий способ совместного культивирования ганглиев / нервов и тканей-мишеней и изучения роли специфических молекул на таких взаимодействий в управляемой и изолированной среде.

протокол

Все мыши были сохранены и обработаны в соответствии с Законом швейцарской защиты животных и в соответствии с правилами офисе Кантональная ветеринарной, Цюрих.

1. Подготовка вскрытия Материал, медиакультуры, микрофлюидных устройств

1. Автоклав микро-рассечение пинцет и ножницы (121 ° С, время стерилизации: 20 мин) и хранят их в стерильный контейнер.
2. Стерилизовать покровные стекла (24 мм х 24 мм), при инкубировании их в 1 М HCl в течение 24 ч на орбитальном шейкере при 37 ° С. Вымойте их три раза стерильной дистиллированной H ₂ O и три раза с этанолом 99%. Сухой затем покровные при 37 ° С или в стерильных капотом потока. Наконец, автоклав и не подвергайте покровные в УФ-свете (30 мин), чтобы завершить стерилизацию. Покровные затем могут быть сохранены в 70% этаноле.
3. Удалить внимательно устройств AXIS Изоляция Axon из пакета с помощью стерильного пинцета и положите их в стерильную чашку Петри.
4. Используя стерильный биопсии удар (Ø: 1 мм) создают одно отверстие за образец для культивируют (рис 1) в соответствие с культурой камер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не ударить слишком близко к микродорожек, так как они могут быть повреждены приложенного давления.
5. Стерилизовать устройств AXIS Изоляция Axon по immerging их в этанол 70%. Сухие затем AXIS Axon Устройства изоляции и покровные полностью под капотом стерильной потока. Подождите минимум 3 часа, прежде чем продолжить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: неполное сушки приведет к дефектной сборки микрофлюидных устройств.
6. Поместите каждую покровное в 35 мм чашки Петри или в хорошо в 6-скважин пластины.
7. Поместите устройство изоляции AXIS Axon на покровное и нажмите мягко, но твердо с пинцета с изогнутыми концами, чтобы обеспечить полный адгезии между устройством изоляции и покровного стекла.
8. В каждой культуре камеры, пипетки 150 мкл поли-D-лизином (0,1 мг / мл в стерильной дистиллированной H ₂О). Поместите микрожидкостных устройства под вакуумом в течение 5 мин, чтобы удалить весь воздух из культуральных камерах.
9. Если воздух все еще можно увидеть в камерах, повторного пипетки в поли-D-лизин раствора в камерах.
10. Инкубируйте устройства с поли-D-лизином O / N при 37 ° С.
11. Вымойте камерах три раза стерильной дистиллированной H ₂ O.
12. Заполните камеры с 150 мкл рабочего раствора ламинин (Sigma-Aldrich, 5 мкг / мл, в PBS или бессывороточной среде), и инкубируют O / N при 37 ° С.
13. Подготовка 50 мл среды для культур тройничного ганглиев ^37, состоит в следующем: 48 мл среды Neurobasal, 1 мл В-27, 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 5 нг / мл фактора роста нервов (NGF) , 12:25 вечера цитозинарабинозид.
14. Подготовка 50 мл среды для культур зубного зачатка ^37, состоит в следующем: 40 мл DMEM-F12, 10 мл фетальной бычьей сыворотки (ФБС, конечная концентрация: 20%), 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 150 мкг / мл аскорбиновой кислоты.

2. эмбриона мыши Генерация и Препарирование

1. Определить возраст эмбриона в соответствии с влагалища плагина (вагинального пробки: эмбриональные день развития 0.5, E0.5) и подтвердите его с помощью морфологических критериев. Для этого протокола, мы обычно используем эмбрионов E14.5 E17.5-мыши.
2. Очистите область рассечение и стереоскоп с этанолом 70%.
3. Жертвоприношение беременная мать с помощью шейных позвонков. Блок шею мыши с первым и вторым пальцем на сетке, и тянуть с решением хвоста.
4. Проанализируйте кожу вокруг нижней части живота, и открыть живот с помощью ножниц. Найдите матку: в таких поздних стадиях беременности, матка обильно заполнить брюшную полость.
5. Рассеките из матки и место в трубку, заполненную PBS на льду. Когда на льду, ткань может быть оставлена ​​в течение нескольких часов. Откажитесь труп матери в соответствии с ведомственным руководящим принципам
6. Рассеките из эмбрионов из матки и освободить их от внезародышевых тканей. Поместите эмбрионов в PBS на льду.
7. Обезглавьте эмбрионов с помощью ножниц и отделить нижнюю челюсть от остальной части головы с помощью микро-рассечение ножницами (фиг.2А). Удалить именно нижнюю челюсть, не повреждая тройничного ганглиев; так как последний локализованы в непосредственной близости от нижней челюсти, их случайное повреждение возможно. Заповедник нижнюю челюсть и остальную часть головы в холодную PBS, на льду.
8. Рассекать TG, взять голову и поместите его на вскрытие стеклянную чашку Петри, ранее заполненной холодной PBS. Используя пинцет, удалите кожу и череп. Удалить тогда мозге и мозжечке путем размещения щипцы ниже мозге и лифтом; конечный мозг и мозжечок щелкнет вместе, из нижней части черепа воздействию.
9. Локализация тройничного ганглиев (как показано на рисунке 2, б). Используйте пинцетотделить TG от тройничного нервов. Устранить остатки тройничного прогнозов с использованием рассечение иглы, как ножи. Поместите расчлененный TG в чашке Петри, наполненной холодной PBS и держать их на льду.
10. Препарировать зубы эмбриональные, поместите нижнюю челюсть, ранее отделенной от черепа, на рассечение стеклянную чашку Петри, наполненную холодной PBS. Использование рассечение иглы, как ножи, удалить язык и кожу вокруг челюсти. Отделите левую и правую Hemi-челюсти путем разрезания вдоль средней линии челюсти. В зубные зачатки хорошо видны, как показано на рисунке 1С. Изолировать зуб микробов, используя рассечение иглы и удалить избыток не зубных тканей. Поместите расчлененный зубных зачатков в чашке Петри, наполненной холодной PBS и держать их на льду.

3. микрофлюидных Co-культуры

1. После вскрытия, удаления ламинин от микрофлюидных устройств. Заполните камеры с 200 мкл respectiве СМИ.
2. С пинцетом, аккуратно перенести на рассеченных TG и зубные бактерии в отверстия, созданных путем штамповки (рис 1D). Убедитесь, что зубные зачатки не плавают, и что они тонут, пока они не упрутся в покровные.
3. Культура образцы в инкубаторе при 37 ° С, 5% СО _2.
4. Изменить культуральной среде каждые 48 ч. Не допускать камер полностью, а не пипетки непосредственно в камерах культуры. Полное опорожнение камер приведет к образованию пузырьков воздуха в камерах; Прямая пипетки в камере может привести к повреждению аксонов. Чтобы избежать этих проблем, удалить носитель, указывающий пипетку к внешней стороне скважин; Аналогично, пипетки свежую среду на стороне скважин, расположенных напротив камер.
5. Во время периода культивирования, со-культуры могут быть легко отображены в покадровой микроскопии. Co-культуры может поддерживаться в течение более 10 дней.
6. После культивирования пародонтад, мыть камеры с помощью пипетки 150 мкл PBS в одну лунку на камеру, и позволяя проходить через PBS камер три раза.
7. Снимите PBS и исправить образцы с помощью пипетки 150 мкл параформальдегида 4% (в PBS) в одной скважине на камеру; инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
8. Вымойте камеры дважды PBS, как описано в 3.6.
9. Продолжить дальнейшего анализа.

Результаты

Эти результаты показывают, что изолированные тройничного ганглиев может расти в одном отсеке микрожидкостных устройств и, кроме того, что развитие изолированных зубных зачатков выдержан в течение длительного периода времени в другой отсек микрожидкостных устройств. Различные питат?...

Обсуждение

Предыдущая в пробирке исследования зубной иннервации были основаны на обычных сокультурах тройничного ганглиев и зубных тканей или клеток ^26,28,29. Эти исследования были проведены, чтобы исследовать в основном привлекательные эффекты этих клеток или тканей на сенсорных аксон...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033