ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Summary

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Abstract

עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות. עם זאת, מנגנוני תופעות אלה אינם מובנים היטב עדיין. בפרט, התפקיד של עצבוב בהתפתחות שן והתחדשות מוזנח.

כמה מחקרים בvivo סיפקו מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים. עם זאת, רוב הגישות אלה אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות.

שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת. בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים)כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתיים. עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation.

מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופה ארוכה של זמן, כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic, וכי הם שומרים בתנאים אלה את אותו דפוס העצבוב שהם מראים בvivo.

על בסיס זה, אנו מתארים כיצד לבודד ושיתוף התרבות מתפתחת חיידקי הגרעינים ושן המשולש בפרוטוקול system.This שיתוף תרבות microfluidic מתארת ​​בצורה פשוטה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על אינטראקציות כאלה בcontrolled וסביבה מבודדת.

Introduction

עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות ^1,2. יתר על כן, עצבוב מעורב בוויסות של התפשטות תאי גזע, גיוס ובידול ^3-5. ואכן, מחקרים שנעשה לאחרונה הבינו ברקמות של המתחם orofacial הראו כי עצבים הפאראסימפתטית נחוצים לתפקוד תאי אפיתל בפיתוח וההתחדשות של בלוטות הרוק ^6,7. באופן דומה, זה כבר הוכיח כי העצבוב הוא הכרחי לפיתוח והתחזוקה של בלוטות טעם ^8-11. לפיכך, חשוב לנתח את התפקידים עדיין המוזנחים של עצבוב בפיתוח איברים אחרים חשובים orofacial ורקמות כגון שיניים.

למרות העצבוב העשיר של שיניים למבוגרים, וזאת בניגוד לכל איברים ורקמות האחרים בגוף, develoשיני פינג מתחילות להיות מעוצבבים בשלבי הלידה המוקדמים. שיניים להתפתח כתוצאה מאינטראקציות רציפות והדדית בין האאקטודרם האוראלי וmesenchyme נגזר רכס העצבי גולגולתי. אינטראקציות אלה להצמיח ameloblasts נגזר אפיתל וodontoblasts נגזר mesenchyme שאחראי להיווצרות של אמייל והדנטין, בהתאמה ^12. עצבים תחושתיים מהגרעינים המשולש ועצבים סימפטיים מגרעיני צוואר רחם מעולים מעצבבים את השיניים למבוגרים ^13-15. במהלך עובר, סיבי עצב הנובעים מפרויקט הגרעינים המשולש כלפי חיידקי שן פיתוח ומקיפים אותם בהדרגה, אבל הם לא לחדור לתוך mesenchyme papilla השיניים ^13. סיבי עצב להיכנס mesenchyme עיסת השיניים בשלבי התפתחות מתקדמים יותר המתואמים עם בידול odontoblast ומטריצת דנטין תצהיר ^16. עצבוב עיסת שיניים הוא completed זמן קצר לאחר בקיעת השן בחלל הפה ^13. מחקרים קודמים גילו כי semaphorins וneurotrophins השונים מעורבים בוויסות של עצבוב בodontogenesis ^16-19. המחקרים קודמים הראו כי באופן ברור עצבוב הוא תנאי הכרחי להיווצרות שן בדגים ^20. מחקרים מאוחרים יותר הראו שהומאוסטזיס של תאי גזע mesenchyme שיניים בשיניים חותכות עכבר מוסדר על ידי עצבים תחושתיים באמצעות הפרשה של קיפוד הקולי (ששש) ^21. עם זאת, התפקיד של עצבוב בשן ייזום, פיתוח והתחדשות הוא עדיין שנוי במחלוקת ביונקים ^22-24.

שפע של מחקרי in vivo סיפק מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים ^13,25,26. עם זאת, רוב אלה approכאבים אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות. שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת ^26-29. במקביל, שיתוף culturing כפוף להתאמות טכניות שונות. לדוגמא, עצבים ורקמות ספציפיות שיניים (לדוגמא, עיסת שיניים, זקיק שיניים, השיניים אפיתל) לעתים קרובות דורש תקשורת ותרבות שונה על מנת להבטיח את הישרדות רקמה לפרקי זמן ארוך ^{30 - 32.}

בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים) כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתי ^27-29.עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation, וללמוד את הדינמיקה של סיבי עצב הסתעפות בתוך אברי מטרה. לכן, שיתוף תרבויות בלתי רציפה תהיה יותר מתאימות לביצוע מחקרים על אינטראקציות רקמות עצביות-שיניים.

מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. במכשירים אלה, רקמות ותאי עצב שיניים מופרדות בתאים שונים, תוך מתן אפשרות לצמיחה של אקסונים מהגופים התא העצביים דרך microchannels כלפי התא המכיל רקמות היעד שלהם ^33. מכשירי microfluidic כבר נעשו שימוש כדי ללמוד את יחסי הגומלין בין תאי עצב והמיקרוגלים ^34,35, כמו גם תא לתא אינטראקציות בסרטן וneovascularization ^35. יתר על כן, מערכות אלה היו בשימוש כדי לחקור את יחסי הגומלין בין Dorsגרעיני אל שורש וosteoblasts ^36.

אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופות זמן ארוכות כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic ^37. יתר על כן, יש לנו הראינו ששיניים משלבי התפתחות שונים לשמור במבחנה בתנאים אלה את אותו האפקט דוחה או מושך על עצבוב המשולש שהם מראים בvivo ^37. פרוטוקול זה מספק מידע על דרך פשוטה, חזקה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על כגון אינטראקציות בסביבה מבוקרת ומבודדת.

Protocol

כל העכברים נשמרו וטופלו על פי חוק צער בעלי החיים השוויצרי ובהתאם לתקנות של משרד הקנטון הווטרינרית, ציריך.

1. הכנת Dissection חומר, תרבות מדיה, המכשירים microfluidic

1. מלקחיים החיטוי מיקרו לנתיחה ומספריים (121 מעלות צלזיוס, זמן עיקור: 20 דקות) ולאחסן אותם במכל סטרילי.
2. לעקר coverslips זכוכית (24 מ"מ x 24 מ"מ) על ידי דוגריהם ב 1 M HCl למשך 24 שעות על שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף אותם שלוש פעמים עם סטרילי H, מזוקק ₂ O ושלוש פעמים עם אתנול 99%. יבש ולאחר מכן את coverslips על 37 מעלות צלזיוס או מתחת למכסת מנוע לזרום סטרילי. לבסוף, החיטוי או לחשוף את coverslips לאור UV (30 דקות) כדי להשלים את העיקור. אז יכול להיות מאוחסן בcoverslips 70% אתנול.
3. מוציא בזהירות את התקני בידוד AXIS אקסון מהחבילה באמצעות מלקחיים סטרילית ומניח אותם בצלחת פטרי סטרילי.
4. באמצעות אגרוף ביופסית סטרילי (o: 1 מ"מ) ליצור חור אחד לדגימה ללהיות מתורבת (איור 1) בהתכתבות של תאי התרבות.
   הערה: אל אגרוף קרוב מדי לmicrogrooves, כפי שהם עלולים להיפגע על ידי הלחץ המופעל.
5. לעקר את מכשירי בידוד AXIS אקסון ידי immerging באתנול 70%. יבשים אז התקני AXIS אקסון בידוד וcoverslips תחת מכסה המנוע זרימת סטרילי לגמרי. חכה מינימום של 3 שעות לפני שתמשיך.
   הערה: ייבוש חלקי תגרום הרכבה לקויה של מכשירי microfluidic.
6. מניחים כל coverslip לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ או לתוך באר בתוך צלחת 6 בארות.
7. מניחים את מכשיר בידוד AXIS אקסון על coverslip ולחץ בעדינות אך בתקיפות עם מלקחיים עם קצוות מקופלים על מנת לאפשר הדבקה מלאה בין מכשיר הבידוד וcoverslip הזכוכית.
8. בכל חדר תרבות, פיפטה 150 μl של פולי-D ליזין (0.1 מ"ג / מ"ל בסטריליים, מזוקקת H ₂O). הנח את מכשירי microfluidic תחת ואקום במשך 5 דקות, כדי להסיר את כל האוויר מתאי התרבות.
9. אם אוויר עדיין ניתן לראות בתוך התאים, מחדש פיפטה פתרון poly-D- ליזין לתאים.
10. דגירה המכשירים עם O פולי-D ליזין / N על 37 מעלות צלזיוס.
11. שטוף תאים שלושה זמן עם סטרילי H, מזוקק ₂ O.
12. מלא תאים עם 150 פתרון μl laminin עובד (סיגמא אולדריץ, 5 מיקרוגרם / מיליליטר, ב PBS או בינוני סרום ללא), ודגירת O / N על 37 מעלות צלזיוס.
13. הכן 50 מיליליטר של מדיום לתרבויות גרעיני trigeminal ^37, מורכב כדלקמן: 48 מיליליטר Neurobasal בינוני, 1 מיליליטר B-27, 100 U / פניצילין / סטרפטומיצין, L-גלוטמין 2 מ"מ, 5 ng / גורם גדילה עצבית מיליליטר מיליליטר (NGF) , Arabinoside ציטוזין 12:25.
14. הכן 50 מיליליטר של מדיום לתרבויות נבט שן ^37, מורכב כדלקמן: 40 מיליליטר DMEM-F12, בסרום שור עוברי 10 מיליליטר (FBS ריכוז, סופי: 20%), 100 U / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, L-גלוטמין 2 מ"מ, 150 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית.

דור העובר 2. עכבר וDissection

1. לקבוע גיל עוברי על פי התוספת נרתיק (תוסף נרתיק: יום עוברי של התפתחות 0.5, E0.5) ולאשר אותה באמצעות קריטריונים מורפולוגיים. לפרוטוקול זה, אנחנו בדרך כלל להשתמש בעוברי עכברי E14.5-E17.5.
2. נקה את האזור לנתיחה וstereoscope עם 70% אתנול.
3. להקריב את האמא בהריון באמצעות נקע בצוואר הרחם. לחסום את הצוואר של העכבר עם האצבע הראשונה ושנייה על גבי רשת, ולמשוך עם החלטת הזנב.
4. לנתח את העור סביב הבטן התחתונה, ולפתוח את הבטן באמצעות מספריים. אתר את הרחם: בשלבים מאוחר כל כך של הריון, הרחם למלא את חלל הבטן בשפע.
5. לנתח את הרחם ומקום בצינור מלא PBS על קרח. כאשר על קרח, הרקמות ניתן להשאיר לכמה שעות. מחק את הגופה של האם על פי הנחיות מוסדיות
6. לנתח את העוברים מהרחם ולשחרר אותם מרקמות extraembryonic. מניחים את העוברים בPBS על קרח.
7. לערוף את העוברים באמצעות מספריים, ולהפריד את הלסת התחתונה משאר הראש באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה (איור 2 א). הסר בדיוק הלסת התחתונה, מבלי לפגוע בגרעינים המשולש; כהאחרונים מקומיים בסמיכות ללסת התחתונה, הנזק המקרי שלהם הוא אפשרי. לשמר את הלסת תחתונה ושאר הראש בקור PBS, על קרח.
8. לנתח TG, לקחת את הראש ומניח אותו על גבי צלחת פטרי זכוכית לנתיחה, מילאה בעבר עם PBS הקר. שימוש במלקחיים, להסיר את העור ואת הגולגולת. הסר אז telencephalon והמוח הקטן על ידי הצבת מלקחיים מתחת לtelencephalon והמעלית; telencephalon והמוח הקטן תהיה להעיף ביחד, משאירים את החלק התחתון של הגולגולת החשופה.
9. למקם את הגרעינים המשולש (שמוצגים באיור 2 ב). השתמש במלקחייםלהפריד את TG מהעצבים המשולש. לחסל את השאריות של תחזיות trigeminal באמצעות המחטים לנתיחה כסכינים. מניחים את TG גזור בצלחת פטרי מלאה PBS הקר ולשמור אותם על קרח.
10. לנתח שיניים עובריות, למקם את הלסת התחתונה, נפרדה בעבר מהגולגולת, על צלחת פטרי זכוכית לנתיחה, מלאה PBS הקר. שימוש במחטים לנתיחה כסכינים, להסיר את הלשון והעור שמסביב הלסת. הפרד את השמאל וחם-לסתות תקין על ידי חיתוך לאורך קו האמצע של הלסת. חיידקי השן בקלות לעין, כפי שמוצגים באיור 1 ג. לבודד את חיידקי השן באמצעות מחטים לנתיחה ולהסיר את העודפים של רקמות שאינן שיניים. מניחים את חיידקי שן גזור בצלחת פטרי מלאה PBS הקר ולשמור אותם על קרח.

3. Microfluidic שיתוף תרבויות

1. לאחר נתיחה, להסיר laminin ממכשירי microfluidic. מלא את התאים עם 200 μl של respectiיש תקשורת.
2. עם מלקחיים, להעביר בעדינות את חיידקי TG ושן גזורים לתוך החורים שנוצרו על ידי ניקוב (1D איור). ודא שחיידקי השן לא יצופו ושהם שוקעים עד שקשר עם coverslips.
3. תרבות דגימות חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
4. לשנות את מדיום התרבות כל שעה 48. לא לרוקן את התאים לחלוטין, ולא פיפטה ישירות לתאי התרבות. התרוקנות מלאה של תאים יגרמו להיווצרות של בועות אוויר בתוך התאים; pipetting הישיר לתוך התא יגרום לניזק axonal. כדי למנוע בעיות אלה, להסיר את המדיום מצביע פיפטה לכיוון הצד החיצוני של הבארות; באופן דומה, פיפטה בינונית הטרי בצד של הבארות ממוקמות מול לתאי.
5. במהלך תקופת התרבות, ניתן הדמיה שיתוף תרבויות בקלות על ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות. שיתוף תרבויות יכולות להישמר במשך 10 ימים.
6. לאחר Perio התרבותד, לשטוף את התאים על ידי pipetting 150 μl של PBS לתוך היטב אחד לכל תא, ומאפשר לי PBS לזרום דרך התאים שלוש פעמים.
7. הסר את PBS ולתקן את הדגימות על ידי pipetting 150 μl של paraformaldehyde 4% (PBS) ובאחד לתא; לדגור על RT במשך 15 דקות.
8. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS כמתואר ב3.6.
9. להמשיך בניתוח נוסף.

תוצאות

תוצאות אלו מראות כי הגרעינים המשולש מבודדים יכולים לגדול בתא אחד של מכשיר microfluidic ו, בנוסף, כי הפיתוח של חיידקי שן הבודדים מתמשך לתקופה ארוכה של זמן בתא האחר של מכשיר microfluidic. תקשורת והתרבות שונה משמשות בשני תאים, וmicrogrooves בין שני התאים לאפשר הרחבה של האקסון מגנגליון trigem...

Discussion

קודם בניסויים במבחנה של עצבוב שן היו מבוסס על שיתוף תרבויות קונבנציונליות של הגרעינים המשולש ורקמות או תאים ^26,28,29 שיניים. מחקרים אלה נערכו לחקור בעיקר את ההשפעות אטרקטיביות של תאים או רקמות אלה באקסונים חושיים ^38. למרות שמביא התקדמות משמעותית בתחום, כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033