Análisis de Desarrollo del diente Germ Inervación Uso de dispositivos de microfluidos Co-cultura

Resumen

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Resumen

Inervación juega un papel clave en el desarrollo, la homeostasis y la regeneración de órganos y tejidos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a estos fenómenos no son bien entendidos todavía. En particular, se descuida el papel de la inervación en desarrollo de los dientes y la regeneración.

Varios estudios in vivo han proporcionado información importante acerca de los patrones de inervación de los tejidos dentales durante los procesos de desarrollo y reparación de diversos modelos animales. Sin embargo, la mayoría de estos enfoques no son óptimas para resaltar las bases moleculares de las interacciones entre las fibras nerviosas y órganos diana y tejidos.

Co-culturas constituyen un valioso método para investigar y manipular las interacciones entre las fibras nerviosas y los dientes en un ambiente controlado y aislado. En las últimas décadas, se han realizado co-cultivos convencionales utilizando el mismo medio de cultivo durante períodos muy cortos (por ejemplo, dos días)para investigar los efectos de atracción o repulsión de desarrollar tejidos bucales y dentales en las fibras nerviosas sensoriales. Sin embargo, se requiere la extensión del período de cultivo para investigar los efectos de la inervación de la morfogénesis y dientes citodiferenciación.

Sistemas de microfluidos permiten co-cultivos de neuronas y diferentes tipos de células en su medio de cultivo apropiado. Hemos demostrado recientemente que los ganglios del trigémino (TG) y los dientes son capaces de sobrevivir durante un largo período de tiempo cuando se co-cultivaron en dispositivos de microfluidos, y que se mantienen en estas condiciones el mismo patrón de inervación que muestran in vivo.

Sobre esta base, se describe cómo aislar y co-desarrollo de la cultura y de los ganglios del trigémino diente gérmenes en el protocolo de un co-cultivo de microfluidos sistema.Este describe una forma simple y flexible para co-cultura ganglios / nervios y los tejidos diana y para estudiar los papeles de moléculas específicas sobre tales interacciones en un controlled y entorno aislado.

Introducción

Inervación juega un papel clave en el desarrollo, la homeostasis y la regeneración de órganos y tejidos ^1,2. Además, la inervación está implicado en la regulación de la proliferación de células madre, la movilización y diferenciación ^{3 - 5 de.} De hecho, estudios recientes realizados en los tejidos del complejo orofacial han demostrado que los nervios parasimpáticos son necesarios para la función de las células progenitoras epiteliales durante el desarrollo y la regeneración de la glándulas salivales ^6,7. Del mismo modo, se ha demostrado que la inervación es necesaria para el desarrollo y mantenimiento de las papilas gustativas ^8-11. Por lo tanto, es importante analizar los papeles todavía descuidados de la inervación en el desarrollo de otros órganos y tejidos orofaciales importantes tales como dientes.

A pesar de la rica inervación de los dientes adultos, y en contraste con todos los demás órganos y tejidos del cuerpo, Develode ping dientes comienzan a ser inervado en las etapas postnatales tempranas. Los dientes se desarrollan como resultado de las interacciones secuenciales y recíproca entre el ectodermo oral y craneal mesénquima derivadas de la cresta neural. Estas interacciones dan lugar a ameloblastos epiteliales derivadas de mesénquima y odontoblastos derivados que son responsables de la formación del esmalte y la dentina, respectivamente ^12. Los nervios sensoriales de los ganglios del trigémino y los nervios simpáticos de los ganglios cervicales superiores inervan los dientes adultos ^13-15. Durante la embriogénesis, las fibras nerviosas que emana del proyecto ganglios del trigémino hacia los gérmenes dentales en desarrollo y progresivamente los rodean, pero que no penetran en el mesénquima papila dental ^13. Las fibras nerviosas entran en el mesénquima de pasta dental en las etapas de desarrollo más avanzados que se correlacionan con la diferenciación de odontoblastos y la matriz de dentina deposición ^16. Inervación pulpa dental es complETED poco después de la erupción del diente en la cavidad oral ^13. Estudios anteriores han revelado que varios semaforinas y las neurotrofinas están implicadas en la regulación de la inervación durante odontogenesis ^16-19. Estudios anteriores han demostrado claramente que la inervación es un requisito previo para la formación de los dientes en los peces ^20. Estudios más recientes han demostrado que la homeostasis de las células madre mesenquimales dental en incisivos ratón está regulada por los nervios sensoriales a través de la secreción de sonic hedgehog (Shh) ^21. Sin embargo, el papel de la inervación en diente de iniciación, el desarrollo y la regeneración es todavía muy controvertido en mamíferos ^22-24.

Una gran cantidad de estudios in vivo han proporcionado información importante acerca de los patrones de inervación de los tejidos dentales durante los procesos de desarrollo y reparación de diversos modelos animales ^13,25,26. Sin embargo, la mayoría de estos APPROdolores no son óptimas para resaltar las bases moleculares de las interacciones entre las fibras nerviosas y órganos diana y tejidos. Co-culturas constituyen un valioso método para investigar y manipular las interacciones entre las fibras nerviosas y los dientes en un ambiente controlado y aislado ^26-29. Al mismo tiempo, co-cultivo está sujeto a diversos ajustes técnicos. Por ejemplo, los nervios y los tejidos dentales específicos (por ejemplo, la pulpa dental, folículo dental, epitelio dental) a menudo requieren diferentes medios de cultivo con el fin de garantizar la supervivencia del tejido durante largos períodos de tiempo ^30-32.

En las últimas décadas, se han realizado co-cultivos convencionales utilizando el mismo medio de cultivo durante períodos muy cortos (por ejemplo, dos días) para investigar los efectos de atracción o repulsión de desarrollar tejidos bucales y dentales en las fibras nerviosas sensoriales ^27-29.Sin embargo, se requiere la extensión del período de cultivo para investigar los efectos de la inervación de la morfogénesis y dientes citodiferenciación, y para estudiar la dinámica de las fibras nerviosas se ramifican en los órganos diana. Por lo tanto, co-cultivos no contiguos serían más adecuados para llevar a cabo estudios sobre neuronales dental tejidos interacciones.

Sistemas de microfluidos permiten co-cultivos de neuronas y diferentes tipos de células en su medio de cultivo apropiado. En estos dispositivos, los tejidos dentales y las neuronas se separan en diferentes compartimentos, mientras que permite el crecimiento de los axones de los cuerpos de las células neuronales a través de microcanales hacia el compartimento que contiene su tejido diana ^33. Los dispositivos microfluídicos han sido ya utilizado para estudiar las interacciones entre las neuronas y la microglia ^34,35, así como interacciones célula a célula en el cáncer y la neovascularización ^35. Además, estos sistemas se han utilizado para estudiar las interacciones entre dorsal ganglios de la raíz y osteoblastos ^36.

Hemos demostrado recientemente que los ganglios del trigémino (TG) y los dientes son capaces de sobrevivir por largos períodos de tiempo cuando se co-cultivaron en dispositivos de microfluidos ^37. Por otra parte, hemos demostrado que los dientes de las diferentes etapas de desarrollo mantienen en estas condiciones in vitro los mismos efectos repulsivas o atractivas en la inervación del trigémino que muestran in vivo ^37. Este protocolo proporciona información acerca de una forma sencilla, potente y flexible para co-cultura ganglios / nervios y los tejidos diana y para estudiar los papeles de moléculas específicas en tales interacciones en un ambiente controlado y aislado.

Protocolo

Todos los ratones fueron mantenidos y manejados de acuerdo a la Ley de Protección de los Animales de Suiza y en cumplimiento de la normativa de la oficina cantonal Veterinaria, Zurich.

1. Preparación de Material de disección, Medios de Cultivo, dispositivos de microfluidos

1. Fórceps Autoclave micro-disección y tijeras (121 ° C, tiempo de esterilización: 20 min) y almacenarlos en un recipiente estéril.
2. Esterilizar cubreobjetos de vidrio (24 mm x 24 mm) mediante su incubación en HCl 1 M durante 24 h en un agitador orbital a 37 ° C. Lavar tres veces con ellos, H ₂ O destilada estéril y tres veces con etanol 99%. Seco entonces los cubreobjetos a 37 ° C o bajo campana de flujo estéril. Por último, en autoclave o exponer los cubreobjetos a la luz UV (30 min) para completar la esterilización. Los cubreobjetos se pueden almacenar entonces en etanol al 70%.
3. Retire con cuidado los dispositivos de aislamiento AXIS Axon del paquete usando pinzas estériles y colocarlos en una placa de Petri estéril.
4. Usando un punzón de biopsia estéril (ø: 1 mm) crear un agujero por muestra a ser cultivados (Figura 1) en correspondencia de las cámaras de cultivo.
   NOTA: No perfore demasiado cerca de los microsurcos, ya que podrían ser dañados por la presión aplicada.
5. Esterilizar los dispositivos de aislamiento AXIS Axon sumergiéndola en etanol al 70%. Seque luego Dispositivos de aislamiento AXIS Axon y cubreobjetos completamente bajo una campana de flujo estéril. Espere un mínimo de 3 horas antes de proceder.
   NOTA: secado incompleto resultará en el montaje defectuoso de los dispositivos de microfluidos.
6. Coloque cada cubreobjetos en una placa de Petri de 35 mm o en un pozo dentro de una placa de 6 pocillos.
7. Coloque el aislamiento de dispositivos AXIS Axon en el cubreobjetos y presione suavemente pero con firmeza con un fórceps con extremos doblados con el fin de permitir la plena adherencia entre el dispositivo de aislamiento y el cubreobjetos de vidrio.
8. En cada cámara de cultivo, pipeta 150 l de poli-D-lisina (0,1 mg / ml en estéril, destilada H ₂O). Coloque los dispositivos de microfluidos bajo vacío durante 5 min, a fin de eliminar todo el aire de las cámaras de cultivo.
9. Si el aire todavía se puede ver dentro de la cámaras, re-pipeta la solución de poli-D-lisina en las cámaras.
10. Incubar los dispositivos con O poli-D-lisina / N a 37 ° C.
11. Lávese las cámaras tres veces con estéril, _H2O destilada
12. Rellene cámaras con 150 l solución laminina trabajo (Sigma-Aldrich, 5 mg / ml, en PBS o medio libre de suero), e incubar O / N a 37 ° C.
13. Preparar 50 ml de medio para cultivos de ganglios del trigémino ^37, compuesta como sigue: 48 ml Neurobasal medio, 1 ml B-27, 100 U de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 5 ng / ml de factor de penicilina / / ml de crecimiento nervioso (NGF) , arabinósido de citosina 24:25.
14. Preparar 50 ml de medio para cultivos germinales diente ^37, compuesta como sigue: 40 ml de DMEM-F12, 10 ml de suero fetal bovino (FBS, concentración final: 20%), 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 150 mg / ml de ácido ascórbico.

2. Generación de embriones de ratón y disección

1. Determinar la edad embrionaria acuerdo con tapón vaginal (tapón vaginal: día embrionario de desarrollo 0.5, E0.5) y confirmarla mediante criterios morfológicos. Para este protocolo, por lo general usamos embriones de ratón E14.5-E17.5.
2. Limpie el área de disección y el estereoscopio con etanol al 70%.
3. Sacrificar la madre embarazada a través de la dislocación cervical. Bloquear el cuello del ratón con el primer y segundo dedo sobre una rejilla y tire con la decisión de la cola.
4. Diseccionar la piel alrededor del abdomen inferior, y abrir el abdomen con unas tijeras. Busque el útero: durante tales etapas finales del embarazo, el útero abundantemente llenar la cavidad abdominal.
5. Diseccionar el útero y colocar en un tubo lleno de PBS en hielo. Cuando en el hielo, el tejido se puede dejar para varias horas. Deseche el cadáver de la madre según las directrices institucionales
6. diseccionar los embriones del útero y liberarlos de sus tejidos extraembrionarias. Coloca los embriones en PBS en hielo.
7. Decapitar a los embriones con unas tijeras, y separar la mandíbula inferior del resto de la cabeza con unas tijeras micro-disección (Figura 2). Eliminar precisamente la mandíbula inferior, sin dañar los ganglios del trigémino; como este último se localizan en las proximidades de la mandíbula inferior, su daño accidental es posible. Preservar la mandíbula inferior y el resto de la cabeza en PBS frío, en hielo.
8. Para diseccionar TG, toma la cabeza y colocarla en una placa de Petri de vidrio de la disección, previamente llenado con PBS frío. Usando las pinzas, quitar la piel y el cráneo. Retire entonces el telencéfalo y el cerebelo colocando fórceps debajo del telencéfalo y ascensor; el telencéfalo y el cerebelo le dará la vuelta juntos, dejando la parte inferior del cráneo expuesta.
9. Localizar los ganglios del trigémino (que se muestra en la Figura 2B). Utilice las pinzaspara separar el TG de los nervios trigémino. Elimine los restos de las proyecciones del trigémino usando las agujas de disección como cuchillos. Coloque el TG diseccionado en una placa de Petri llena de PBS frío y mantenerlos en hielo.
10. Para diseccionar dientes embrionarias, colocar la mandíbula inferior, separado previamente del cráneo, en la placa de Petri de vidrio disección, lleno de PBS frío. El uso de agujas de disección como cuchillos, retire la lengua y la piel que rodea la mandíbula. Separar el los hemi-mandíbulas izquierdo y derecho cortando a lo largo de la línea media de la mandíbula. Los gérmenes de los dientes son fácilmente visibles, como se muestra en la Figura 1C. Aislar los gérmenes de dientes utilizando agujas de disección y retirar el exceso de tejidos no dentales. Coloca los gérmenes de dientes disecados en una placa de Petri llena de PBS frío y mantenerlos en hielo.

3. microfluidos Co-culturas

1. Después de la disección, laminina eliminar de los dispositivos de microfluidos. Llenar las cámaras con 200 l de la respecticinco medios de comunicación.
2. Con unas pinzas, transfiera suavemente los TG y diente gérmenes disecados en los agujeros creados por la perforación (Figura 1D). Asegúrese de que los gérmenes de dientes no flotan y que se hunden hasta que entran en contacto con los cubreobjetos.
3. Cultura las muestras en incubadora a 37 ° C, 5% de CO _2.
4. Cambie el medio de cultivo cada 48 horas. No vaciar las cámaras por completo, y no pipetear directamente en las cámaras de cultivo. El vaciado completo de las cámaras daría lugar a la formación de burbujas de aire dentro de las cámaras; pipeteado directa en la cámara podría resultar en daño axonal. Para evitar estos problemas, se elimina el medio que señala la pipeta hacia el lado externo de los pozos; Del mismo modo, pipetear el medio fresco en el lado de los pozos situados frente a las cámaras.
5. Durante el período de cultivo, co-cultivos pueden ser fácilmente imágenes de microscopía de lapso de tiempo. Co-culturas se pueden mantener por más de 10 días.
6. Después de que el perio culturad, lavar las cámaras con la pipeta 150 l de PBS en un pocillo por cámara, y dejando PBS fluya a través de las cámaras de tres veces.
7. Retire el PBS y fijar las muestras con la pipeta 150 l de paraformaldehído al 4% (en PBS) en un pozo por cada cámara; incubar a TA durante 15 min.
8. Lavar las cámaras dos veces con PBS como se describe en 3.6.
9. Continúe con su posterior análisis.

Resultados

Estos resultados muestran que los ganglios del trigémino aislados pueden crecer en un compartimiento del dispositivo de microfluidos y, además, que el desarrollo de los gérmenes de los dientes aislados se mantiene durante un largo período de tiempo en el otro compartimento del dispositivo de microfluidos. Diferentes medios de cultivo se utilizan en los dos compartimentos, y los microsurcos entre los dos compartimentos permitir la extensión de axones desde el ganglio del trigémino hacia los gérmenes dentales en de...

Discusión

Anterior en estudios in vitro de la inervación de los dientes estaban basados ​​en co-cultivos convencionales de los ganglios del trigémino y los tejidos o células ^26,28,29 dentales. Estos estudios se realizaron para investigar principalmente los efectos atractivos de estas células o tejidos en los axones sensoriales ^38. Aunque trayendo avances significativos en el campo, se plantearon varias cuestiones técnicas. Gérmenes de dientes empiezan a degenerar después de pocos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033