JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

Abstract

فهم قابلية التنسيل الورم أمر بالغ الأهمية لفهم الآليات التي تشارك في تكون الأورام وأمراض التقدم. بالإضافة إلى ذلك، فهم التغييرات تكوين نسيلي التي تحدث داخل الورم في الاستجابة لبعض البيئة الصغرى أو العلاجات قد تؤدي إلى تصميم نهج أكثر تطورا وفعالة للقضاء على الخلايا السرطانية. ومع ذلك، فقد كان الورم تتبع نسيلي سكان شبه صعبة نظرا لعدم وجود علامات مميزة. لمعالجة هذه المشكلة، تم إنشاء بروتوكول VDJ تسلسل لتتبع أنماط التطور نسيلي من منتشر كبير سرطان الغدد الليمفاوية الخلية B (DLBCL) الانتكاس من خلال استغلال VDJ إعادة التركيب والتحور الجسدية (SHM)، واثنين من ميزات فريدة من الأورام اللمفاوية الخلايا البائية.

في هذا البروتوكول، شيدت الجيل التالي من التسلسل (خ ع) مكتبات مع إمكانية فهرسة من تضخيم المناعي ترتيبها السلسلة الثقيلة (IGH) المنطقة VDJ من أزواج من التشخيص الأولي والانتكاس DLBCL عصيدةليه. على تم الحصول المتوسط ​​أكثر من نصف مليون تسلسل VDJ في العينة بعد التسلسل، والتي تحتوي على كل VDJ إعادة ترتيب والمعلومات SHM. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير خطوط الأنابيب المعلوماتية الحيوية المخصصة للاستفادة الكاملة من المعلومات تسلسل لتوصيف IGH-VDJ ذخيرة داخل هذه العينات. وعلاوة على ذلك، فإن خط الأنابيب يسمح لإعادة الإعمار والمقارنة بين الهندسة المعمارية نسيلي الأورام الفردية، والتي تمكن الفحص من عدم التجانس نسيلي داخل الأورام التشخيص وخصم من أنماط التطور نسيلي بين التشخيص وأزواج الورم الانتكاس. عند تطبيق هذا التحليل على عدة أزواج التشخيص الانتكاس، وكشف لنا أدلة الرئيسي الذي أنماط تطورية الورم مميزة متعددة يمكن أن يؤدي إلى DLBCL الانتكاس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع هذا النهج في الجوانب السريرية الأخرى، مثل التعرف على المرض المتبقي الحد الأدنى، رصد التقدم المحرز الانتكاس والاستجابة للعلاج، والتحقيق في مأمن repertoirوفاق في سياقات غير سرطان الغدد الليمفاوية.

Introduction

السرطان هو مرض نسيلي. منذ ثلاثين عاما عندما اقترح بيتر C. نويل السرطان نسيلي نموذج التطور 1، وقد حاول العديد من الدراسات لتشريح السكان نسيلي داخل عينات الورم وإعادة التوسع والتطور أنماط نسيلي التي تكمن وراء عملية تكون الأورام 2. في الآونة الأخيرة، وقد مكن كامل الجينوم التسلسل المحققين إلى إلقاء نظرة عميقة على عدم التجانس نسيلي وتطور 3،4. ولكن نظرا لعدم وجود علامات الانقياد في العديد من أنواع الخلايا، فإنه من الصعب للاستدلال على العمارة نسيلي دقيقة والمسار التطوري. لحسن الحظ هناك علامة قابلية التنسيل الطبيعية في خلايا B الناضجة من فيه العديد من الأورام الخبيثة اللمفاوية، بما في ذلك DLBCL، تنشأ. وردا على التحفيز مستضد، ويمكن لكل خلية B تشكيل منتجة تسلسل IGH VDJ واحد من خلال الانضمام إلى H V (متغير)، وD (التنوع)، وJ H (الانضمام) قطعة معا من مجموعة كبيرة من هذه القطاعات. خلال هذه العلاقات العامةocess، وأجزاء صغيرة من التسلسل الأصلي قد يتم حذف ويمكن أن يضاف النيوكليوتيدات غير قالب إضافية لإنشاء VDJ إعادة ترتيب فريدة من نوعها. يمكن أن تكون موروثة هذا إعادة ترتيب VDJ محددة في كل ذرية من هذه الخلايا B، ومن ثم وضع علامات الفردية ناضجة B-الخلية ونتاجه 5. وعلاوة على ذلك، ويحدث SHM على تسلسل VDJ معاد في وسط جرثومي (GC) رد فعل لاحق لتقديم الطفرات إضافية لتوسيع تجمع الأضداد وتعزيز الأجسام المضادة تقارب 6. لذلك، من خلال مقارنة والمتناقضة VDJ وSHM أنماط عينات سرطان الغدد الليمفاوية التي خضعت هذه العمليات، يمكن أن يرسم داخل الورم عدم التجانس ويمكن استخلاصه مسار التطور نسيلي من المرض.

سابقا، يمكن تحديد VDJ إعادة ترتيب وSHM بواسطة PCR تضخيم المناطق معاد، استنساخ المنتجات PCR، وبعد ذلك سانجر التسلسل للحصول على معلومات التسلسل. هذا النهج طق منخفضة الإنتاجية والعائد المنخفض واسترجاع سوى جزء صغير جدا من كامل معاد ذخيرة VDJ، وتعيق توصيف التمثيل العام للسكان نسيلي ضمن عينة معينة. تم إنشاء نهج المعدلة عن طريق توليد NGS فهرسة المكتبات التسلسل من المنتجات VDJ PCR وأداء PE 2x150 بي بي التسلسل للحصول على أكثر من نصف مليون تسلسل VDJ معاد لكل عينة. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير خط أنابيب مخصصة لأداء مراقبة الجودة (QC)، محاذاة، فلتر VDJ التسلسل يقرأ لتحديد إعادة ترتيب وSHMS كل قراءة، وإجراء تحليل النشوء والتطور على بنية نسيلي من كل عينة. بالإضافة إلى ذلك، تم تأسيس نهج جديد لمزيد من تميز وتطور أنماط نسيلي عن العينات التي تم جمعها في مختلف مراحل المرض.

لقد طبقت هذه التقنية لعينات المريض DLBCL. DLBCL هو شكل من اشكال عدوانية من سرطان الغدد الليمفاوية غير هودجكين مع الانتكاس المتكرر في ال تصل إلى واحدIRD من المرضى 7. الانتكاسات DLBCL عادة تحدث في وقت مبكر، في غضون 2-3 سنوات من التشخيص الأولي، على الرغم من أن البعض الآخر تحدث بعد 5 سنوات 8. تشخيص حالة المرضى انتكس والفقراء، مع 10٪ فقط نتوصل إلى 3 سنوات البقاء على قيد الحياة خالية من التقدم بسبب خيارات العلاج محدودة. وهذا هو الأساس للحاجة الملحة لمقاربات جديدة لعلاج DLBCL الانتكاس 9،10. ومع ذلك، الآليات الجزيئية المرتبطة DLBCL الانتكاس لا تزال مجهولة إلى حد كبير. بشكل خاص، دور التجانس نسيلي في التشخيص وتطور نسيلي خلال تطوير الانتكاس DLBCL هم uncharacterized في الوقت الحاضر، مما يجعل من الصعب تعريف العلامات البيولوجية دقيقة ومفيدة للتنبؤ الانتكاس. لمعالجة هذه المسائل، طبقنا نهجنا VDJ التسلسل في أزواج متعددة من مطابقة الأساسي التشخيص الانتكاس عينة DLBCL أزواج. ظهرت سيناريوهين التطورية نسيلي متميزة من الانتكاس من المقارنة بين أبنية نسيلي بين التشخيص وعصيدة الانتكاسليه توحي بأن الآليات الجزيئية متعددة يمكن أن تشارك في DLBCL الانتكاس.

Protocol

1. VDJ التضخيم

1.1) استخلاص DNA من عينات الأورام

  1. استخراج الحمض النووي من الشرائح الرقيقة (10-20 ميكرون) من أكتوبر جزءا لا يتجزأ من الأنسجة الطبيعية أو الخبيثة المجمدة.
    1. هضم 10-30 أقسام رقيقة من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من بتخفيض مشراح ناظم البرد في 4 مل نوكليك الاحتياطي تحلل (0.0075 M تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.2؛ 0.3 M كلوريد الصوديوم؛ 0.002 M نا 2 EDTA) مع بروتين K (0.5 ملغ / مل، وتركيز النهائي ) و0.625٪ SDS في أنبوب 15 مل الطرد المركزي في 37 ° C حمام الماء بين عشية وضحاها.
    2. إضافة 1 مل من كلوريد الصوديوم المشبع (5 M) إلى خليط الهضم ويهز بقوة لمدة 15 ثانية.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. طاف لنقل 15 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة وإضافة مجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪.
    5. مزيج من قبل قلب الأنبوب 6-8 مرات. الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجة مئوية لجمع الحمض النووي عجل.
    6. يغسل بيليه الحمض النووي مرتين مع 70٪ من الإيثانول. CENTRifuge في 5000 x ج لمدة 15 دقيقة في كل مرة لجمع بيليه.
    7. حل DNA في 100-400 ميكرولتر TE العازلة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها على شاكر. العائد DNA هو 5-200 ميكروغرام (تركيز النهائي بين 50-500 نانوغرام / ميكرولتر) اعتمادا على حجم الأنسجة
  2. استخراج الحمض النووي من الشرائح الرقيقة (10-20 ميكرون) من الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من (FFPE) الأنسجة الطبيعية أو الخبيثة paraffin-.
    1. احتضان أقسام البارافين في 1 مل الزيلين مرتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في كل مرة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لنزع paraffinize. جمع المقاطع الأنسجة عن طريق الدوران في 13000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. احتضان المقاطع في 1 مل الإيثانول بنسبة 100٪ مرتين في درجة حرارة الغرفة، و 10 دقيقة في كل مرة لإزالة بقايا الزايلينات. جمع المقاطع الأنسجة عن طريق الدوران في 13000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يذوب البارافين تماما في هذه النقطة، وقسم النسيج والمتبقي فقط.
    3. الهواء الجاف الأقسام في غرفة الشركة المصرية للاتصالاتmperature لمدة 10-15 دقيقة.
    4. جعل 0.5 ملغ / مل بروتين K الحل مع 1X PCR العازلة (مخفف من 10X PCR العازلة مع nuclease خالية من المياه). إضافة محلول بروتين كاف للعينات في الحجم النهائي من 50-100 ميكرولتر واحتضان ليلا 37 درجة مئوية.
    5. تسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإبطال نشاط بروتين K.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يذوب DNA العينة في المخزن المؤقت PCR، ويمكن استخدامها في خطوات 1.2 و 1.3 مباشرة. العائد DNA هو 0،5 حتي 20 ميكروغرام (تركيز النهائي بين 10-200 نانوغرام / ميكرولتر) اعتمادا على حجم الأنسجة.

1.2) تقييم جودة DNA

  1. مزيج 0.25 ميكرولتر طق البلمرة DNA مع 45 ميكرولتر من مزيج الرئيسي من عدة سلم التجارية في أنبوب PCR.
  2. إضافة 5 DNA ميكرولتر أعدت من 1.1.1.7 أو 1.1.2.5 في أنبوب PCR ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل.
  3. استخدام الشروط التالية لتضخيم DNA: 95 ° C ل7 دقيقة. تليها 35 دورة من 45 ثانية في 95 درجة مئوية، و 45 ثانية في 60 درجة مئوية، و 90 ثانية في 72 ° C؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وعقد في 15 ° C.
  4. إعداد agarose هلام 2٪ في TBE (تريس / البورات / EDTA).
  5. مزيج 20 ميكرولتر PCR تفاعل مع 4 ميكرولتر صبغ 6X التحميل، وتحميل على 2٪ agarose هلام.
  6. وصمة عار على agarose هلام مع 0.5 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد الحل وكشف عن المنتجات PCR مع نظام هلام تخيل. ملاحظة: سوف العينات التي تسفر عن 5 منتجات PCR في أحجام 100، 200، 300، 400، و 600 نقطة أساس أن تستمر لتوليد amplicons VDJ.
    تنبيه: إيثيديوم بروميد هو المغير قوية. الرجاء التعامل مع الحذر الشديد من خلال ارتداء معدات الوقاية، مثل القفازات، والتصرف في حاويات المحددة في المبادئ التوجيهية المؤسسة.

1.3) VDJ PCR

1.3.1) أسهب معاد IGH VDJ الجزء من الإطار منطقة 1 (IgVHFR1)

  1. مزيج 45 ميكرولتر مزيج الرئيسي من التسمية أنبوبإد باسم "ميكس 2" لالجسدية IGH التحور الفحص للكشف جل عدة التجارية، 0.25 ميكرولتر طق البلمرة DNA، و 5 ميكرولتر عينة DNA أعدت من 1.1.1.7 أو 1.1.2.5 في أنبوب PCR.
  2. استخدام الشروط التالية لتضخيم DNA: 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تليها 35 دورة من 45 ثانية في 95 درجة مئوية، و 45 ثانية في 60 درجة مئوية، و 90 ثانية في 72 ° C؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وعقد في 15 ° C.
  3. حل المنتج PCR كامل في هلام الاغاروز 2٪ بحلول الكهربائي.
  4. وصمة عار على agarose هلام مع 0.5 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد الحل وكشف عن المنتجات PCR مع نظام التصوير هلام. ومن المتوقع مع حجم مجموعة من 310-380 سنة مضت A amplicon وحيدة النسيلة.
  5. استئصال جزء هلام يحتوي على amplicon وحيدة النسيلة بين 310-380 نقطة أساس.
  6. تنقية DNA من هلام المستأصل باستخدام أدوات استخراج جل القياسية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. ملاحظة: بالنسبة للعينات التي شظايا FR1 يمكن الحصول عليها، ليست هناك حاجة إلى بإسهاب IGVHFR2 وIgVHFR3.

1.3.2) أسهب معاد IGH VDJ الجزء من الإطار المنطقة 2 (IgVHFR2)

  1. مزيج 45 ميكرولتر مزيج الرئيسي من الأنبوب وصفت بأنها "أنبوب B" لأغراض تجارية IGH جين قابلية التنسيل الفحص للكشف جل عدة، 0.25 ميكرولتر طق البلمرة DNA، وDNA عينة 5 ميكرولتر أعدت من 1.1.1.7 أو 1.1.2.5 في أنبوب PCR .
  2. استخدام الشروط التالية لتضخيم DNA: 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تليها 35 دورة من 45 ثانية في 95 درجة مئوية، و 45 ثانية في 60 درجة مئوية، و 90 ثانية في 72 ° C؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ويترك عند 15 درجة مئوية.
  3. حل المنتج PCR كامل في هلام الاغاروز 2٪ بحلول الكهربائي.
  4. تصور PCR المنتج (ق) من 0.5 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد تلطيخ. ويمكن ملاحظة amplicon وحيدة النسيلة في نطاق حجم 250-295 نقطة أساس.
  5. استئصال جزء هلام يحتوي على amplicon وحيدة النسيلة بين 250-295 نقطة أساس.
  6. تنقية DNA من هلام المستأصل باستخدام استخراج جل القياسيةأيون كيت وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

1.4) تحسين VDJ PCR

  1. استخدام الظروف PCR المعدلة التالية لتضخيم IgVHFR1 وIgVHFR2 باستخدام الحمض النووي الأمثل: 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق، 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية، والإرشاد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.

2. VDJ Amplicon إعداد مكتبة وتسلسلها

2.1) إعداد مكتبة

2.1.1) نهاية لإصلاح

  1. نقل VDJ PCR المنتج من 1.3 في أنبوب PCR وإضافة العازلة إعادة تعليق من إعداد مجموعة DNA عينة لإظهار حجم إلى 60 ميكرولتر.
  2. إضافة 40 ميكرولتر من إصلاح النهاية مزيج من كيت تحضير DNA عينة وتخلط جيدا.
  3. احتضان رد الفعل عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في thermocycler قبل ساخنة (30 ° C) مع غطاء قبل ساخنة في 100 ° C.
  4. مزيج 136 ميكرولتر حبات مغناطيسية و24 ميكرولتر PCR زالمياه رادي لأول مرة في أنبوب 1.5 مل، ثم نقل كامل رد فعل نهاية إصلاح من 2.1.1.3 في أنبوب 1.5 مل وتخلط جيدا مع الحل الخرز.
  5. مكان الأنابيب على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة للسماح للفصل حبات من الحل. نضح طاف، وتغسل حبات مع 80٪ العذبة استعداد ETOH مرتين في حين أن أنبوب على الوقوف المغناطيسي.
  6. نضح الحل الايثانول تماما والسماح للالخرز على الهواء الجاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  7. خذ أنبوب المواجهة و resuspend المغناطيسي حبات في 17.5 ميكرولتر إعادة تعليق العازلة.
  8. مكان الأنابيب مرة أخرى على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة إلى حبات منفصلة عن العازلة إعادة تعليق. إزالة العازلة إعادة تعليق (هو معلق المنتج النهائي إصلاح في المنطقة العازلة إعادة تعليق الآن) في أنبوب PCR نظيفة.

2.1.2) A-المخلفات

  1. إضافة 12.5 ميكرولتر مزيج A-المخلفات في أنبوب PCR يحتوي المنتج النهائي إصلاح وتخلط جيدا.
  2. احتضان أنبوب PCR عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في thermocycler قبل ساخنة (37 ° C) مع غطاء ساخنة قبل في 100 ° C.

2.1.3) محول من ربط

  1. إضافة 2.5 ميكرولتر إعادة تعليق العازلة، 2.5 ميكرولتر من ربط ميكس، و 2.5 ميكرولتر مؤشر محول الحمض النووي في رد فعل المخلفات A.
  2. احتضان رد الفعل عند 30 درجة مئوية لمدة 30 minl في thermocycler قبل ساخنة (30 ° C) مع غطاء قبل ساخنة في 100 ° C.
  3. إضافة 5 ميكرولتر من ربط إيقاف مؤقت في كل رد فعل وتخلط جيدا.
  4. مزيج 42.5 حبات مغناطيسية ميكرولتر جيدا مختلطة لتنظيف رد فعل الخطوات التالية 2.1.1.5 ل2.1.1.8. إضافة 50 ميكرولتر إعادة تعليق مؤقت لأزل المنتج ligated محول.
  5. تنظيف المنتج ligated محول للمرة الثانية باستخدام 50 ميكرولتر جيدا مختلطة الخرز AMPure XP، وأزل المنتج في 25 ميكرولتر إعادة تعليق العازلة في أنبوب PCR نظيفة.

2.1.4) شظايا تضخيم DNA

  1. إضافة 5 ميكرولتر PCR التمهيدي كوكتيل و 25 ميكرولتر PCR ميكس ماجستير في أنبوب PCR يحتوي المنتج ligated محول وتخلط جيدا.
  2. أداء التضخيم في thermocycler مبرمجة مسبقا للشروط التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 10 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع الاستمرار في 10 ° C.
  3. تنظيف رد الفعل باستخدام 50 حبات مغناطيسية ميكرولتر جيدا مختلطة، وأزل المنتج النهائي في 30 ميكرولتر إعادة تعليق العازلة.

2.1.5) مكتبة التحقق من صحة

  1. تحديد المنتج النهائي مع التألق باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة. تركيز مكتبة النهائي بين 2،5 حتي 20 نانوغرام / ميكرولتر.
  2. تقييم جودة المنتج النهائي باستخدام أداة تحليلية مع رقاقة حساسية عالية DNA وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. نتوقع فرقة واحدة مع حجم المتوقع لأي IGVHFR1، IGVHFR2 أو IGVHFR3. البريدحجم xpected المنتج مكتبة يساوي حجم amplicon VDJ الأصلي بالإضافة إلى حجم المحولات (~ 125 شركة بريتيش بتروليوم).

2.2) VDJ-PCR مكتبة تجميع وتسلسلها

  1. حساب المولية من كل جزء مكتبة باستخدام الصيغة التالية: نانومتر = [(نانوغرام / 1000) / BP * 660] × 10 9 حيث نانوغرام هو تركيز المكتبة VDJ-PCR قياس في خطوة 2.1.5.1 وشركة بريتيش بتروليوم هي قمة حجم مكتبة VDJ-PCR قياس في خطوة 2.1.5.2.
  2. تمييع المكتبة إلى 2 نانومتر (المجموع 10 ميكرولتر) مع الماء خالية من الدناز.
  3. الجمع بين 10 ميكرولتر من المخفف 2 المكتبات نانومتر معا في أنبوب 1.5 مل.
  4. إضافة حجم مساو من PhiX ضبط ارتفاع في في أنبوب 1.5 مل.
  5. تحميل السباحة في تركيز 07:00 الصعود إلى flowcell.
  6. تسلسل المكتبات باستخدام إقران نهاية التسلسل 150 دورة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

تحليل 3. البيانات

ملاحظة: summآرى من النصوص المعلوماتية الحيوية المستخدمة في هذا القسم يمكن العثور على أنها رمز الملف التكميلي.

3.1) محاذاة وQC

  1. خريطة إقران نهاية التسلسل يقرأ ضد IGH V البشري، D والمنطقة قاعدة بيانات J تحميلها من الموقع IMGT 11 باستخدام خوارزمية الانفجار النووى وتكييفها على أساس 'blastn' المتاحة من NCBI مع الفجوة عقوبة مفتوحة من 2، الفجوة عقوبة تمديد 1، طول كلمة من 7، وعتبة قيمة الإلكترونية من 10 -4. تجاهل الزوج، قراءة لا تعين كلا من IGH V ومنطقة J.
  2. عد ما تبقى من أزواج قرأت أن يكون IGH V وJ تعيينات للحصول على ترددات مطابقة مجموعات VJ عبر عن قراءة أزواج تم الحصول عليها من المدى التسلسل على العينة. عد للقراءة الزوج إذا تم تعيينه لكلا من IGH V وJ الجينات، ثم قم بإضافة أليل لعدد المقابلة لمزيج VJ معين.
  3. ترتيب التهم لكل منطقة VDJ معاد تم الحصول عليها من 3.1.2 من أعلىمؤسسة إلى أدنى مستوى. المنطقة VDJ لديها أعلى يقرأ ويعرف العد كما مزيج إعادة ترتيب كبير.
  4. تجاهل تسلسل الانحياز التي تغطي أقل من 35٪ من إعادة ترتيب رئيسيا في مجال التعرف 3.1.3.

3.2) SHM تحديد الهوية

  1. عد كل أنماط SHM عبر يقرأ من الخطوة 3.1.3. تعريف كل نمط SHM باعتباره subclone.
  2. حساب عدد من subclones التي المقابلة لمختلف أنماط SHM فريدة من نوعها، وعدد القراءات التي تم تعيينها إلى subclones الفردية.

3.3) التمثيل البياني للنتائج

  1. إجراء تحليل النشوء والتطور على subclones استخدام مواردها المقابلة أنماط SHM باستخدام حي الانضمام طريقة من حزمة R "القرد" وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. حساب مصفوفة مسافة واحدة من الاصطفافات متميزة الفردية لإعادة نسالة subclone الجذور إلى تسلسل سلالة الجرثومية للVJ الجمع في السؤال لكل مجموعة العينة الثنائية.
  2. استخدام تسلسل النوكليوتيدات كل subclone كما ناقلات شخصية وحساب المسافة سلسلة تقريبية بين جميع subclones في إعادة ترتيب VJ رئيسي لكل من التشخيص وعينات الانتكاس المقابلة باستخدام مقياس المسافة Levenshtein حيث رياضيا أن المسافة بين اثنين من التحالفات التي كتبها د س، ص (ط، ي) حيث د س، ص (ط، ي) = 1 إذا كنت ≠ ي و 0 خلاف ذلك، ومن ثم تلخيص هذه الوظيفة على طول السلسلة الموافق النوكليوتيدات تسلسل i و j.
  3. بيانيا عرض المصفوفة الناتجة من مسافات subclone وتعول subclone يناظرها في الطريقتين التاليتين:
    1. استخدام حزمة R "الشامل" وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لتطبيق المقياس متعدد الأبعاد لمصفوفة مسافة subclone وتوليد مبدأ الأبعاد إحداثيات الخريطة، التي يتم بعد ذلك تآمر جنبا إلى جنب مع لوغاريتممن التهم subclonal باعتبارها نصف قطر الدائرة.
    2. بناء على الرسم البياني صليات على أساس المسافة Levenshtein، حيث تتوافق القمم لكل subclone متميزة الناشئة عن إعادة ترتيب VJ كبير.
      ملاحظة: إذا كانت المسافة بين اثنين من الحيوانات المستنسخة متميزة تساوي واحد ثم هناك ميزة بين هذه القمم اثنين. إذا كانت المسافة أكبر من واحد، ثم لا يوجد أي حافة ربطها.
    3. رسم بياني ل3.3.3.2 استخدام وظيفة tkplot في "iGraph" حزمة R مع تخطيط Kamada كاواي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. دائرة نصف قطرها من القمم يتناسب مع الجذر مكعبة من العدد الإجمالي من الحيوانات المستنسخة التي تم تعيينها إلى ذلك ويستخدم التظليل مجموعة الأحمر والأزرق للدلالة على نسبة من الحيوانات المستنسخة إما أن تنتمي إلى التشخيص (الأزرق) أو الانتكاس (الأحمر) عينات .

3.4) التجانس (الانتروبيا) قياس

  1. دراسة الأرقام والعد subclone للأنماط الفردية من التحور الجسدية التي تحدث في إعادة ترتيب VJ رئيسيا لكل إقران مجموعة من العينات.
  2. حساب تجريبي الكون والكون التجريبية المتبقية تعديل لعدد من الحيوانات المستنسخة متميزة في كل عينة باستخدام تقدير الكون الرسم البياني القياسية القائمة.

النتائج

الإجراء العام للVDJ التسلسل (VDJ وما يليها)، بما في ذلك استخراج الحمض النووي، معاد VDJ المنطقة التضخيم والتنقية، وبناء مكتبة التسلسل، يقرأ معالجة، وتحليل النشوء والتطور، تتمثل في الشكل 1. روتيني 5-200 DNA ميكروغرام يمكن استرجاعها من أقسام الأنسجة الصلبة ال...

Discussion

نظرا لوجود عدد غير محدود تقريبا من تكرار المعلومات تسلسل مشفرة عن طريق VDJ إعادة ترتيب وSHM في موضع IGH من خلايا B الإنسان، أثبت الفحص للذخيرة IGH بالكامل عن طريق الإنتاجية العالية في أعماق التسلسل لتكون وسيلة فعالة وشاملة لتحديد نسيلي والسكان B-خلية فرعية نسيلي. وعلاوة على...

Disclosures

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
EthanolVWR89125-170200 proof, for molecular biology
TE bufferLife Technologies12090-01510 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
XylenesVWREM-XX0055-6500 ml
Proteinase K Life Technonogies25530-015100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution MixPromegaU151510 mM each nucleotide
10x PCR Buffer Roche11699105001Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2Life Technonogies431180650 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size LadderInvivoscribe Technologies 2-096-002033 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel DetectionInvivoscribe Technologies 5-101-003033 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel DetectionInvivoscribe Technologies 1-101-002033 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA PolymerasePromegaM829120 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) bufferCorning (cellgro)46-011-CM6x1 L
50x TAE BUFFER  VWR101414-2981 L
Ethidium bromide solutionSigma-AldrichE151010 mg/ml
25 bp DNA LadderLife Technologies105970111 µg/µl
100 bp DNA LadderLife Technologies15628-0191 µg/µl
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-500500 g
40% Acrylamide/Bis SolutionBio-Rad Laboratories1610144500 ml
QIAquick Gel Extraction KitQiagen2870450 columns
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay KitLife TechnologiesQ32854
High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626
2100 BioanalyzerAgilent Technologies
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
MiSeqIllumina
Qubit 2.0 FluorometerLife TechnologiesQ32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Magnetic standLife Technologies4457858
Gel imaging systemBio-Rad Laboratories170-8370

References

  1. Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
  2. Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
  3. Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
  4. Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
  5. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
  6. Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
  7. Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
  8. Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
  9. Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
  10. Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
  11. Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
  12. Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
  13. Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

106 VDJ VDJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved