VDJ-のSeq：B細胞リンパ腫のクローン進化のパターンを明らかに転位免疫グロブリン重鎖遺伝子のディープシーケンシング解析

要約

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

要約

腫瘍クローン性を理解することは、腫瘍形成および疾患の進行に関与するメカニズムを理解するために重要です。また、特定の微小環境または治療に反応して腫瘍内で発生するクローン組成変化を理解することは、腫瘍細胞を根絶するために、より洗練され、効果的なアプローチの設計につながる可能性があります。しかし、腫瘍クローンのサブ集団を追跡することは、識別可能なマーカーの欠如に挑戦しています。この問題に対処するために、VDJ-seqのプロトコルは、VDJ組換えおよび体細胞超変異（SHM）、B細胞リンパ腫の2つのユニークな機能を利用することにより、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）再発のクローン進化パターンを追跡するために作成されました。

このプロトコルでは、索引付けの可能性を秘めた次世代シーケンシング（NGS）ライブラリは、一次診断と再発DLBCL SAMPの組からの増幅された再配列免疫グロブリン重鎖（IgH遺伝子）VDJ地域から構築しましたレ。サンプルあたりの平均万人以上のVDJ配列は、VDJ再配列とSHM情報の両方が含まれているシーケンシング、後に得た上で。また、カスタマイズされたバイオインフォマティクスパイプラインは完全にこれらのサンプル内のIgH-VDJレパートリーの特徴付けのための配列情報を利用するために開発されました。また、パイプラインは、復興と診断腫瘍と診断し、再発腫瘍対間のクローン進化パターンの控除内クローン不均一性の検査を可能に個々の腫瘍のクローンアーキテクチャの比較を可能にします。いくつかの診断・再発のペアにこの分析を適用するとき、我々は、複数の特徴的な腫瘍の進化のパターンはDLBCLの再発につながることを重要な証拠を発見しました。さらに、このアプローチは、微小残存病変の同定、再発の進行および治療応答をモニターし、免疫repertoirの調査のような他の臨床面、に展開することができ非リンパ腫文脈におけるES。

概要

がんはクローン病です。ピーターC. Nowellが癌クローン進化モデル^{1を提案し}たときに30年前から、多くの研究は、腫瘍サンプル内のクローン集団を分析し、腫瘍形成プロセス^{2の根底にある}クローン拡大と進化パターンを再構築しようとしています。最近では、全ゲノム配列決定は、クローン異質と進化^3,4で深く見てみるために研究者を可能にしました。しかし、多くの細胞型で扱いやすいマーカーの欠如に起因し、それは正確なクローンのアーキテクチャおよび進化の経路を推測することは困難です。幸いDLBCLを含む多くのリンパ系悪性腫瘍は、発信元の成熟B細胞における天然クローン性マーカーがあります。抗原刺激に応答して、これらのセグメントの大きなプールから一緒にセグメントを、各B細胞は、V _H（可変）、D（多様性）を結合することによって、単一の生産のIgH VDJ配列を形成することができ、およびJ _Hの （参加します）。このPRの間にocessは、元の配列の小さな部分を削除することができ、追加の非鋳型ヌクレオチドはユニークなVDJ再構成を作成するために添加されてもよいです。この特定のVDJ再配列は、したがって、個々の成熟B細胞およびその子孫^5をタグ付け、このB細胞のすべての子孫に継承することができます。また、SHMは、抗体プールの拡大や抗体アフィニティー⁶の強化のための追加の突然変異を導入するために、その後の胚中心（GC）反応における再結合VDJ配列に発生します。したがって、比較し、これらのプロセスを経たリンパ腫サンプルのVDJ及びSHMパターンを対比することによって、腫瘍内の不均一性を描写することができ、疾患のクローン進化経路を推定することができます。

以前は、VDJ再構成とSHMのPCR産物をクローニングし、再結合領域を増幅するPCRによって同定することができ、配列情報を得るために、その後サンガー配列決定。このアプローチの私全体再結​​合VDJレパートリーのごく小さな部分を取得し、与えられたサンプル中のクローン集団の全体的な表現の特性を妨げ、低スループットと低収量です。修正されたアプローチは、VDJ PCR産物からNGSインデックスさシーケンシングライブラリーを作製し、サンプルあたり万人以上の組換えVDJ配列を得るために、PE 2x150 bpの塩基配列決定を行うことによって作成されました。また、カスタムパイプラインは、フィルタVDJ配列決定は、各リードの再配置とSHMSを識別し、各サンプルのクローンアーキテクチャに系統学的解析を実行するために読み出して、品質管理（QC）を行う位置合わせするために開発されました。また、新たなアプローチは、さらに、様々な病期で収集したサンプルについて、クローン進化パターンを特徴付けるために確立されています。

私たちは、DLBCL患者試料にこの手法を適用しています。 DLBCLは、1回目までに頻繁に再発と非ホジキンリンパ腫の積極的な形であります患者⁷のIRD。いくつかは、5年⁸後に発生するんがDLBCLの再発は、通常、最初の診断の2〜3年以内に、早期に発生します。再発患者の予後は10％だけが原因限られた治療選択肢に3年無増悪生存率を達成することで、不良です。これは、DLBCLの再発^9,10を治療するための新規なアプローチが緊急に必要に基礎です。しかし、DLBCLの再発に関連する分子メカニズムはまだ不明な点が多いです。特に、DLBCLの再発の開発中に診断し、クローン進化でクローン異質の役割は、それが困難な再発を予測するために、正確かつ有用なバイオマーカーを定義すること、現在特徴付けられていないです。これらの質問に対処するために、我々は一致した一次診断、再発DLBCLサンプルのペアの複数のペアに私たちのVDJシーケンシングアプローチを適用しました。再発2つの異なるクローン進化のシナリオは、診断と再発SAMPの間にクローンアーキテクチャの比較から登場しましたレ複数の分子機構は、DLBCLの再発に関与する可能性があることを示唆しています。

プロトコル

1. VDJ増幅

腫瘍試料から1.1）のDNA抽出

1. 冷凍10月埋め込み正常または悪性組織の薄い切片（10〜20ミクロン）からDNAを抽出します。
   1. プロテイナーゼK（0.5 mg / mlの最終濃度で4 mlの核酸の溶解緩衝液（0.002 MのNa ₂ EDTA; 0.3 MのNaCl 0.0075 MトリスHCl、pHは8.2）でクリオスタットミクロトームにより切断包埋組織の10-30薄い部分をダイジェスト）、一晩37℃の水浴中で15 mlの遠心管中で0.625％SDS。
   2. 消化混合物を飽和NaCl（5 M）の1ミリリットルを加え、15秒間激しく振ります。
   3. 室温で15分間1100×gで遠心分離します。
   4. 新しい15ミリリットルの遠心チューブに上清を移し、100％の2容量のエタノールを追加します。
   5. チューブを6-8回転倒混和します。 4℃で60分間、5,000×gで遠心分離し、沈殿したDNAを収集します。
   6. 70％エタノールで2回DNAペレットを洗浄します。 CENTR15分ペレットを収集するたびに、5,000×gでifuge。
   7. シェーカーで一晩の室温で100-400μlのTEバッファーでDNAを溶解します。 DNAの収量は、組織の大きさに応じて5〜200μgの（50-500 ngの/μlの間の最終濃度）であります
2. ホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）正常または悪性組織の薄い切片（10〜20ミクロン）からDNAを抽出します。
   1. - パラフィンを塗るを解除1.5 mlのマイクロ遠心チューブに毎回10分間、室温で二回キシレン1ml中パラフィン切片をインキュベートします。室温で5分間、13,000×gで回転させて組織切片を収集します。
   2. 室温で10分間2回1 mlの100％エタノールに残留キシレンを除去するたびに、切片をインキュベートします。室温で5分間、13,000×gで回転させて組織切片を収集します。パラフィンは、完全にこの時点で溶解し、唯一の組織切片が残っています。
   3. 部屋teにおけるセクションを空気乾燥10〜15分間mperature。
   4. （ヌクレアーゼフリー水で10倍PCR緩衝液から希釈）を1×PCRバッファーで0.5 mg / mlのプロテ​​イナーゼK溶液を作ります。 50〜100μlの最終容量で、サンプルのプロテイナーゼK溶液を加え、37℃で一晩インキュベートします。
   5. プロテイナーゼKを不活性化するために10分間95℃でサンプルを加熱します
      注：このステップでは、サンプルのDNAは、PCR緩衝液に溶解し、直接ステップ1.2および1.3で使用することができます。 DNAの収量は、組織の大きさに応じて、0.5〜20μgの（10-200 ngの/μlの間の最終濃度）です。

1.2）のDNAの品質評価

1. PCRチューブの商業ラダーキットからマスターミックスの45μlの0.25μlのTaq DNAポリメラーゼを混ぜます。
2. PCRチューブに1.1.1.7または1.1.2.5から調製され、少なくとも5回のピペッティングによりよく混ぜ5μlのDNAを追加します。
3. 95°Cの場合：DNAを増幅するために、以下の条件を使用して、7分。 95℃で45秒の35サイクル、60℃45秒間、および72℃で90秒間、続い。その後、72℃で10分間、15℃で保持します。
4. TBE（トリス/ホウ酸塩/ EDTA）中の2％アガロースゲルを準備します。
5. 4μlの6×ローディング色素と20μlのPCR反応をミックスし、2％アガロースゲル上にロードします。
6. 0.5μg/ mlの臭化エチジウム溶液でアガロースゲルを染色し、ゲル想像システムでPCR産物を検出します。注：100、200、300、400、600塩基対のサイズで5 PCR産物を得たサンプルVDJアンプリコンを生成するために継続されます。
   注意：エチジウムブロマイドは、強力な変異原です。保護具、 すなわち手袋を身に着けていることによって細心の注意を払って処理し、機関のガイドラインに従って、特定の容器に廃棄してください。

1.3）VDJ PCR

1.3.1フレームワーク領域1（IgVHFR1）から）を増幅再結合のIgH VDJセグメント

1. チューブラベルから45μlのマスターミックスを混ぜますED商業体細胞超変異IGHアッセイゲル検出のためのキットの「ミックス2」、Taq DNAポリメラーゼμlの0.25、およびPCRチューブに1.1.1.7または1.1.2.5から調製された5μlのサンプルDNAとして。
2. DNAを増幅するために、以下の条件を使用してください：95℃7分間。 95℃で45秒の35サイクル、60℃45秒間、および72℃で90秒間、続い。その後、72℃で10分間、15℃で保持します。
3. 電気泳動による2％アガロースゲルで全体のPCR産物を解決します。
4. 0.5μg/ mlの臭化エチジウム溶液でアガロースゲルを染色し、ゲル画像化システムを用いてPCR産物を検出します。モノクローナルアンプリコンは、310から380塩基対のサイズ範囲と予想されます。
5. 310から380塩基対の間のモノクローナルアンプリコンを含むゲル部分を切り出します。
6. 製造業者のプロトコルに従って、標準的なゲル抽出キットを使用して切り出したゲルからDNAを精製します。注意：FR1の断片が得られたサンプルに対して、のIgVを十分にする必要はありませんHFR2とIgVHFR3。

1.3.2フレームワーク領域2（IgVHFR2）から）を増幅再結合のIgH VDJセグメント

1. PCRチューブに1.1.1.7または1.1.2.5から調製したゲル検出キット用の市販IGH遺伝子クローン性アッセイの「チューブB」、Taq DNAポリメラーゼμlの0.25、および5μlのサンプルDNAとしてラベルチューブから45μlのマスターミックスを混ぜます。
2. DNAを増幅するために、以下の条件を使用してください：95℃7分間。 95℃で45秒の35サイクル、60℃45秒間、および72℃で90秒間、続い。その後、72℃で10分間、15℃で残します。
3. 電気泳動による2％アガロースゲルで全体のPCR産物を解決します。
4. 0.5μg/ mlのエチジウムブロマイド染色によってPCR産物（単数または複数）を視覚化します。モノクローナルアンプリコンは、250から295塩基対のサイズ範囲内で観察することができます。
5. 250から295塩基対の間のモノクローナルアンプリコンを含むゲル部分を切り出します。
6. 標準ゲルエキスを使用して切り出したゲルからDNAを精製製造業者のプロトコールに従って、イオンのキット。

1.4）の最適化VDJ PCR

1. 7分、60秒、60秒、60℃95℃の40サイクル、および90秒間72℃、の最終伸長95℃：IgVHFR1とIgVHFR2は次善のDNAを用いて増幅するために、次の修正PCR条件を使用してください10分間72℃です。

2. VDJアンプリコンライブラリの準備とシーケンシング

2.1）ライブラリの準備

2.1.1）エンド・修理

1. PCRチューブに1.3からVDJ PCR産物を移し、60μlにボリュームを起動するためのDNAサンプル調製キットの再懸濁バッファーを追加します。
2. 最後の40μlのDNAサンプル調製キットからミックスを修復し、十分に混合を追加します。
3. 100℃に予熱された蓋で予熱されたサーモ（30°C）で30分間30℃で反応をインキュベートします。
4. 136μlの磁気ビーズと24μlのPCRグラムを混ぜますRADE水は最初の1.5mlチューブに、その後、1.5mlチューブに2.1.1.3から全体エンド修復反応を転送し、ビーズ溶液とよく混ぜます。
5. 溶液からのビーズの分離を可能にするために2分間の磁気スタンドにチューブを置きます。上清を吸引除去し、チューブを磁気スタンド上にある間に二度80％の新鮮な準備EtOHでビーズを洗浄します。
6. 完全にエタノール溶液を吸引し、15分間、室温で15分間空気乾燥したビーズを可能にします。
7. 17.5μlの再懸濁バッファーに磁気スタンド再懸濁ビーズからチューブを取ります。
8. バック再懸濁バッファーとは別個のビーズに2分間磁気スタンドの上に置きチューブ。きれいなPCRチューブに再懸濁バッファーを（エンド修復製品は現在、再懸濁緩衝液に再懸濁する）を外します。

2.1.2）A-テーリング

1. エンド修復製品を含むPCRチューブに12.5μlのA-テーリングミックスを加え、よく混ぜます。
2. 100℃に予熱された蓋で予熱されたサーモ（37°C）で30分間37℃でPCR管をインキュベートします。

2.1.3）アダプターライゲーション

1. A-テーリング反応に2.5μlの再懸濁バッファー、2.5μlのライゲーションミックス、および2.5μlのDNAアダプターのインデックスを追加します。
2. 100℃に予熱された蓋で予熱されたサーモ（30°C）で30 minl 30℃で反応をインキュベートします。
3. 各反応に5μlの停止ライゲーションバッファーを添加し、十分に混合します。
4. 2.1.1.5 2.1.1.8への手順は以下の反応をきれいに42.5μL、よく混合した磁気ビーズを混ぜます。アダプターライゲーション生成物を溶出するために50μlの再懸濁バッファーを追加します。
5. 50μlのよく混合さAMPure XPビーズを使用して二度目のアダプター連結産物を清掃し、クリーンPCRチューブに25μlの再懸濁バッファー中で生成物を溶出。

2.1.4）を増幅したDNA断片

1. アダプター連結産物を含むPCRチューブに5μlのPCRプライマーのカクテルと25μlのPCRマスターミックスを加え、よく混ぜます。
2. 以下の条件で事前にプログラムされたサーマルサイクラーで増幅を実行します。30秒間、98℃; 30秒30秒、72℃10秒、60℃98℃の10サイクル;その後、72℃で5分間、10℃で保持します。
3. 50μlのよく混合した磁気ビーズを使用して反応をクリーンアップし、30μlの再懸濁バッファーの最終生成物を溶出。

2.1.5）ライブラリの検証

1. 製造業者のプロトコルを使用して、蛍光光度計を用いて、最終生成物を定量します。最終ライブラリー濃度は2.5〜20 ngの/μlの間です。
2. 製造業者のプロトコルに従って高感度DNAチップで分析機器を使用して、最終製品の品質を評価します。 IGVHFR1、IGVHFR2またはIGVHFR3のいずれかの予想サイズの単一のバンドを期待しています。電子ライブラリ製品のxpectedサイズはオリジナルのVDJアンプリコンのサイズ+アダプタ（〜125塩基対）の大きさに等しいです。

2.2）VDJ-PCRライブラリプールとシーケンシング

1. 次の式を使用して、各ライブラリー画分のモル濃度を計算します。nMで= [（NG /千）/ BP * 660] NGはステップ2.1.5.1で測定されたVDJ-PCRライブラリーの濃度であり、BPがピークである10 ⁹ xはVDJ-PCRライブラリーのサイズは、ステップ2.1.5.2で測定。
2. DNアーゼを含まない水で2 nMの（10μlの合計）にライブラリを希釈します。
3. 1.5mlチューブに一緒に希釈した2 nMのライブラリの10μLを結合します。
4. 1.5mlチューブにPHIXスパイクインコントロール等量のを追加します。
5. フローセル上に7 PM濃度でプールをロードします。
6. シーケンス製造業者のプロトコルに従って、ペアエンド150サイクルシーケンサーを使用してライブラリ。

3.データ分析

注：SUMMこのセクションで使用されているバイオインフォマティクスの進スクリプトは、補助コードファイルとして求めることができます。

3.1）アラインメントとQC

1. 地図ペアエンド配列決定、2のギャップオープンペナルティ、NCBIから入手可能な「BLASTN」に基づく適応ヌクレオチドBLASTアルゴリズムを使用して、IMGTのウェブサイト¹¹からダウンロードした人IGH V、DおよびJ領域データベース、1のギャップ伸長ペナルティに対して読み込み7のワード長、および10 ^-4の電子値しきい値。 IGH VおよびJ領域の両方にマップされない読み取りペアを捨てます。
2. すべてにわたってVJの組み合わせに一致する周波数を得るためにIGH VおよびJマッピングが残りの読み取りペアを数えるサンプルのシークエンスの実行から得たペアをお読みください。それはIGH VおよびJ遺伝子の両方にマップされている場合は、読み取りペアをカウントした後、特定のVJの組み合わせで対応するカウントにその対立遺伝子を追加します。
3. 高いから3.1.2から得られた各再結合VDJ領域についてカウントランク最低のEST。 VDJ領域が最も高いが、カウントが主要な再配置の組み合わせとして定義されて読み込みがあります。
4. 3.1.3で同定されたドメインの主要な転位の35％未満をカバーする整列された配列を破棄します。

3.2）SHMのプロファイル識別

1. ステップ3.1.3からの読み取りを越え、すべてのSHMパターンをカウントします。サブクローンとして各SHMパターンを定義します。
2. 異なるユニークなSHMパターンに対応しているサブクローンの数、および個々のサブクローンにマッピングされている読み込みの数をカウントします。

3.3）結果をグラフィカルに

1. 製造業者のプロトコルに従ってRパッケージ「猿」から接合方法近所を使用して、それらに対応するSHMパターンを使用してサブクローンの系統解析を実行します。 Vの生殖細胞系配列に根ざしたサブクローンの系統発生を再作成するために、個々の異なるアラインメントからの距離行列を計算します各ペアのサンプルセットのための問題のJの組み合わせ。
2. 文字ベクトルとして各サブクローンのヌクレオチド配列を使用する二つの整列の間の距離をdと_X、Yによって与えられる数学的に診断し、レーベンシュタイン距離の尺度を使用して、対応する再発試料の両方の主要なVJ再配列内のすべてのサブクローン間の近似文字列の距離を計算します私はそれ以外の場合は、J≠0とし、その後の配列iとjのヌクレオチド配列に対応する文字列の長さにわたって、この関数を合計すると（i、j）は、 ここで、d は _{、X、Y（i、j）}が 1 =。
3. グラフィカルに、以下の2つの方法でサブクローン距離とそれに対応するサブクローンカウントの結果の行列を表示します。
   1. 使用Rパッケージ「質量」とは、サブクローン距離行列に多次元スケーリングを適用し、2次元の原理を生成するために、製造業者のプロトコルによれば、その後対数と一緒にプロットされているマップを、座標円の半径としてsubclonalカウント。
   2. 頂点が主要なVJ再配列から生じる各個別のサブクローンに対応レーベンシュタイン距離に基づいて、無向グラフを構築します。
      注：二つの異なるクローン間の距離が1に等しい場合には、これらの2つの頂点の間にエッジが存在します。距離が1より大きい場合には、それらを連結するいかなるエッジが存在しません。
   3. 製造業者のプロトコルに従って鎌田河合レイアウトで「IGRAPH「Rパッケージのtkplot機能を使用して3.3.3.2のグラフをプロットします。頂点の半径はそれにマッピングされたクローンの総数の三乗根に比例し、シェーディングが診断（青）に属しているいずれかのクローンの割合または再発（赤）のサンプルを表すために赤と青の範囲を使用しています。

3.4）異質性（エントロピー）の測定

1. の番号とサブクローン数を調べサンプルの各ペアのセットのための主要なVJ再配列に生じる体細胞超変異の個々のパターン。
2. 標準ヒストグラムベースのエントロピー推定を使用して、各サンプル中の異なるクローンの数に合わせて調整経験的エントロピーと残留経験的エントロピーを計算します。

結果

DNAの抽出を含むVDJ配列決定（VDJ-SEQ）の全体的な手順は、ライブラリー構築の配列決定、VDJ領域の増幅および精製を再結合し、処理、および系統学的解析を読み出し、 図1に示されている。日常5-200μgのDNAをから検索することができます凍結固体組織切片またはホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を0.5から20μgのDNAを。品質、再配置パターン、および個々のサンプルのSHMの程度...

ディスカッション

そのため、ヒトB細胞のIGH遺伝子座にVDJ再配列とSHMによってコード化された配列情報の反復のほぼ無制限の数の、ハイスループットディープシークエンシングにより全体IGHレパートリーの検査は、クローン描写するための効率的かつ包括的な方法であることが判明しましたサブクローン性B細胞集団。さらに、この方法は、疾患の種々の段階に沿って収集された患者サンプルのクローンおよび?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	89125-170	200 proof, for molecular biology
TE buffer	Life Technologies	12090-015	10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
Xylenes	VWR	EM-XX0055-6	500 ml
Proteinase K	Life Technonogies	25530-015	100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix	Promega	U1515	10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer	Roche	11699105001	Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2	Life Technonogies	4311806	50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder	Invivoscribe Technologies	2-096-0020	33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	5-101-0030	33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	1-101-0020	33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8291	20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer	Corning (cellgro)	46-011-CM	6x1 L
50x TAE BUFFER	VWR	101414-298	1 L
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich	E1510	10 mg/ml
25 bp DNA Ladder	Life Technologies	10597011	1 µg/µl
100 bp DNA Ladder	Life Technologies	15628-019	1 µg/µl
UltraPure Agarose	Life Technologies	16500-500	500 g
40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad Laboratories	1610144	500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	50 columns
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Life Technologies	Q32854
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
MiSeq	Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Magnetic stand	Life Technologies	4457858
Gel imaging system	Bio-Rad Laboratories	170-8370