JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

Abstract

clonality גידול הבנה הוא קריטי להבנת המנגנונים המעורבים בהתקדמות tumorigenesis ומחלה. בנוסף, הבנת שינויי ההרכב המשובטים המתרחשים בתוך גידול בתגובה למייקרו-סביבה או טיפולים מסוימים עלולה להוביל לעיצוב של גישות יותר מתוחכמות ויעילות למיגור תאים סרטניים. עם זאת, תת-אוכלוסיות משובטים גידול מעקב היו מאתגרות בשל חוסר הסמנים להבחין. כדי לטפל בבעיה זו, פרוטוקול VDJ-seq נוצר כדי להתחקות אחרים דפוסי התפתחות המשובטים של לימפומה B תא הגדולה הישנות מפוזרת (DLBCL) על ידי ניצול רקומבינציה VDJ וhypermutation הגופני (SHM), שתי תכונות ייחודיות של לימפומות תאי B.

בפרוטוקול זה, ספריות רצף של הדור הבא (NGS) עם פוטנציאל לאינדקס נבנו משרשרת מוגברת אימונוגלובולינים מחדש כבדה (IGH) אזור VDJ מזוגות של אבחון ראשוני וSAMP DLBCL הישנותles. על יותר מממוצע חצי מיליון רצפי VDJ למדגם התקבלו לאחר רצף, המכיל שני VDJ התארגנות ומידע SHM. בנוסף, צינורות ביואינפורמטיקה מותאמים אישית פותחו לנצל מידע רצף לאפיון של רפרטואר IGH-VDJ בתוך דגימות אלה באופן מלא. יתר על כן, הצינור מאפשר שחזור והשוואה של הארכיטקטורה המשובט של גידולים בודדים, המאפשרת הבחינה של ההטרוגניות המשובט בתוך גידולי האבחון וניכוי דפוסי התפתחות משובטים בין האבחון וזוגות גידול הישנות. כאשר מיישמים את הניתוח הזה לכמה זוגות אבחון הישנות, אנחנו חשפנו ראיות מרכזיות שדפוסים אבולוציוניים גידול ייחודי מרובים עלולים להוביל לנסיגת DLBCL. בנוסף, גישה זו יכולה להיות מורחבת להיבטים קליניים אחרים, כגון זיהוי של מחלה שיורית מינימאלית, מעקב אחר התקדמות הישנות ותגובה לטיפול, וחקירה של רפרטואר חיסוניes בהקשרים שאינם לימפומה.

Introduction

הסרטן הוא מחלה משובט. מאז לפני שלושים שנה, כאשר פיטר ג Nowell הציע מודל התפתחות הסרטן המשובט 1, מחקרים רבים ניסו לנתח אוכלוסיות משובטים בתוך דגימות גידול ולשחזר דפוסי התרחבות והתפתחות משובטים העומדים בבסיס תהליך יצירת הגידולים 2. לאחרונה, רצף הגנום אפשר חוקרים ליסתכל עמוק בהטרוגניות והאבולוציה 3,4 המשובטים. עם זאת, בשל חוסר סמנים צייתן בסוגי תאים רבים, קשה להסיק ארכיטקטורה משובט המדויקת ומסלול האבולוציוני. למרבה המזל, יש סמן clonality טבעי בתאי B הבוגרים ממנו רבות ממאירות הלימפה, כולל DLBCL, מקורן. בתגובה לגירוי אנטיגן, כל תא B יכול ליצור רצף IGH VDJ יחיד יצרני על ידי הצטרפות H V (משתנה), D (גיוון), וH J (הצטרפות) קטע יחד ממאגר גדול של מגזרים אלו. במהלך יחסי ציבור זהocess, מנות קטנות של הרצף המקורי עשויים להימחק ונוקלאוטידים שאינן בתבניות נוספות ניתן להוסיף ליצור סידור מחדש VDJ ייחודי. סידור מחדש VDJ ספציפי זה יכול להיות בירושה בכל הצאצאים של תאי B זה, ולכן תיוג B-תא בוגר פרט וצאצאיה 5. יתר על כן, SHM מתרחש על רצפי VDJ recombined בתגובה הבאה מרכז נבטי (GC) להציג מוטציות נוספות להרחבת בריכת הנוגדן ושיפור של זיקת נוגדן 6. לכן, על ידי השוואה והנגדה דפוסים של דגימות לימפומה שעברו תהליכים אלה VDJ וSHM, ההטרוגניות תוך גידול יכולה להיות שמסומן ונתיב התפתחות משובט של המחלה ניתן ללמוד.

בעבר, סידור מחדש VDJ וSHM יכולים להיות מזוהה על ידי PCR הגברת אזורי recombined, שיבוט מוצרי ה- PCR, ולאחר מכן רצף סנגר לקבל מידע רצף. אני גישה זוזה נמוך תפוקה ותשואה נמוכה, אחזור רק חלק קטן מרפרטואר VDJ recombined כל, ומעכב את האפיון של הייצוג הכולל של האוכלוסייה המשובט בתוך מדגם נתון. גישה שונה נוצרה על ידי יצירת אינדקס NGS ספריות רצף ממוצרי VDJ PCR וביצוע רצף נ"ב 2x150 PE להשיג יותר מחצי מיליון רצפי VDJ recombined לדגימה. בנוסף, צינור מותאם אישית פותח כדי לבצע בקרת איכות (QC), ליישר, רצף VDJ המסנן קורא לזהות rearrangements וSHMs של כל קריאה, ולבצע ניתוח פילוגנטי על הארכיטקטורה המשובט של כל דגימה. בנוסף, גישה חדשה הוקמה כדי להמשיך ולאפיין את דפוסי התפתחות המשובטים לדגימות שנאספו בשלבי מחלה שונים.

יש לנו ליישם את הטכניקה הזו לדגימות חולה DLBCL. DLBCL הוא צורה אגרסיבית של לימפומה שאינה הודג'קין עם הישנות תכופה בה עד אחדIRD של החולים 7. התקפי DLBCL בדרך כלל להתרחש מוקדם, בתוך 2 עד 3 שנים של האבחון הראשוני, למרות שחלקם מתרחש לאחר 5 שנים 8. הפרוגנוזה של חולי הישנות היא עניה, עם רק 10% השיג 3 שנות הישרדות ללא התקדמות מחלה בשל אפשרויות טיפול מוגבלות. זהו הבסיס לצורך הדחוף בגישות חדשות לטיפול בהישנות DLBCL 9,10. עם זאת, מנגנונים מולקולריים הקשורים בהישנות DLBCL עדיין במידה רבה לא ידועים. במיוחד, התפקיד של ההטרוגניות משובט באבחון ואבולוציה משובט במהלך פיתוח הישנות DLBCL הוא כיום uncharacterized, ולכן קשה להגדיר סמן ביולוגי מדויק ושימושי לחזות הישנות. כדי לענות על שאלות אלה, יישמנו גישת VDJ-הרצף שלנו בזוגות רבים של זוגות מדגם DLBCL אבחון הישנות ראשונית מתאימים. שני תרחישים האבולוציונית משובטים מובהקים של הישנות יצאו מההשוואה של הארכיטקטורות המשובטים בין האבחון וSAMP הישנותles שמציע מנגנונים מולקולריים מרובים עשוי להיות מעורב בהישנות DLBCL.

Protocol

1. VDJ הגברה

1.1) הפקת DNA מדגימות גידולים

  1. תמצית ה- DNA מחלקים דקים (10-20 מיקרומטר) של רקמות מוטבעות אוקטובר קפוא רגילות או ממאיר.
    1. לעכל 10-30 חלקים דקים של רקמה משובצת נחתכה על ידי microtome cryostat ב 4 מיליליטר גרעין תמוגה מאגר (.0075 M טריס HCl, pH 8.2; 0.3 M NaCl; 0.002 M Na 2 EDTA) עם proteinase K (0.5 מ"ג / מיליליטר, ריכוז סופי ) ו0.625 SDS% בצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הוסף 1 מיליליטר של NaCl הרווי (5 מ ') לתערובת העיכול ולנער במרץ במשך 15 שניות.
    3. צנטריפוגה ב -1,100 XG במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
    4. מעבירים את supernatant לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חדש ולהוסיף שני כרכים של אתנול 100%.
    5. מערבבים על ידי צינור היפוך 6-8 פעמים. צנטריפוגה ב XG 5000 עבור 60 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את ה- DNA זירז.
    6. שטוף את כדור DNA פעמיים עם 70% אתנול. Centrifuge בXG 5000 במשך 15 דקות בכל פעם כדי לאסוף את הכדור.
    7. ממיסים DNA במאגר TE 100-400 μl בטמפרטורת חדר בלילה שייקר. תשואת DNA היא 5 עד 200 מיקרוגרם (ריכוז סופי בין 50-500 ng / μl) בהתאם לגודל של הרקמה
  2. תמצית ה- DNA מחלקים דקים (10-20 מיקרומטר) של, רקמות קבועות פורמלין כפאראפין משובץ (FFPE) רגילות או ממאיר.
    1. דגירה סעיפי פרפין ב 1 מיליליטר קסילן פעמיים בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות בכל פעם בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר לדה-paraffinize. לאסוף את חלקי רקמות על ידי ספינינג ב13,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    2. דגירה סעיפים ב 1 מיליליטר 100% אתנול פעמיים בטמפרטורת חדר, 10 דקות בכל פעם כדי להסיר שאריות xylenes. לאסוף את חלקי רקמות על ידי ספינינג ב13,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. פרפין הוא נמס לגמרי בשלב זה, ורק סעיף הרקמה שנותר.
    3. אוויר יבש הסעיפים בte החדרmperature במשך 10-15 דקות.
    4. הפוך 0.5 מ"ג / מיליליטר פתרון proteinase K עם חיץ 1x PCR (בדילול מ10x חיץ PCR עם מים nuclease חינם). מוסיף את פתרון proteinase K לדגימות בנפח סופי של 50-100 μl ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס.
    5. מחממים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להשבית proteinase ק
      הערה: בשלב זה, ה- DNA המדגם נמס במאגר PCR וניתן להשתמש בם בשלבי 1.2 ו -1.3 ישירות. תשואת DNA היא 0.5-20 מיקרוגרם (ריכוז סופי בין 10-200 ng / μl) בהתאם לגודל של הרקמות.

1.2) הערכת איכות DNA

  1. מערבבים 0.25 μl פולימראז תקי DNA עם 45 μl של תערובת אמן מערכת הסולם המסחרית בצינור PCR.
  2. הוסף 5 DNA μl הוכן מ1.1.1.7 או 1.1.2.5 לתוך צינור PCR ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך לפחות 5 פעמים.
  3. השתמש בתנאים הבאים כדי להגביר את ה- DNA: 95 מעלות צלזיוס למשך7 דקות; אחרי 35 מחזורים של 45 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 45 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ו- 90 שניות על 72 מעלות צלזיוס; אז 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולהחזיק ב 15 מעלות צלזיוס.
  4. הכן 2% agarose ג'ל בTBE (טריס / Borate / EDTA).
  5. מערבבים תגובת PCR 20 μl עם צבע טעינת 6x 4 μl, ולטעון על ג'ל agarose 2%.
  6. כתם ג'ל agarose עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד פתרון ולזהות מוצרי ה- PCR עם מערכת דמיון ג'ל. הערה: הדגימות שתנבנה 5 מוצרי ה- PCR בגדלים של 100, 200, 300, 400, ו -600 נ"ב יהיה המשיך ליצור amplicons VDJ.
    זהירות: ברומיד הוא mutagen חזק. אנא לטפל בזהירות רבה על ידי לובש הילוכים מגן, כפפות כלומר, ולהיפטר לתוך מכולות ספציפיות להנחיות של המוסד.

1.3) VDJ PCR

1.3.1) מגזר להגביר recombined IGH VDJ ממסגרת האזור 1 (IgVHFR1)

  1. מערבבים תערובת אב 45 μl מהתווית הצינוראד כ" מיקס 2 "של סומטיים IGH Hypermutation Assay עבור ג'ל איתור ערכה מסחרית, 0.25 μl פולימראז תקי DNA, ו- DNA מדגם 5 μl הוכן מ1.1.1.7 או 1.1.2.5 בצינור PCR.
  2. השתמש בתנאים הבאים כדי להגביר את ה- DNA: 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות; אחרי 35 מחזורים של 45 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 45 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ו- 90 שניות על 72 מעלות צלזיוס; אז 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולהחזיק ב 15 מעלות צלזיוס.
  3. לפתור את מוצר ה- PCR השלם ב2% agarose ג'ל אלקטרופורזה על ידי.
  4. כתם ג'ל agarose עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד פתרון ולזהות מוצרי ה- PCR עם מערכת הדמיה ג'ל. Amplicon חד שבטי צפוי עם מגוון הגודל של 310-380 נ"ב.
  5. בלו חלק ג'ל המכיל את amplicon חד שבטי בין 310-380 נ"ב.
  6. לטהר DNA מג'ל נכרת באמצעות ערכה סטנדרטית חילוץ ג'ל על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: לדגימות שניתן להשיג שברי FR1, אין צורך בשפע IGVHFR2 וIgVHFR3.

1.3.2) מגזר להגביר recombined IGH VDJ ממסגרת האזור 2 (IgVHFR2)

  1. מערבבים תערובת אב 45 μl מהצינור שכותרתו "Tube B" של IGH ג'ין Clonality Assay מסחרי לערכת ג'ל איתור, 0.25 μl פולימראז תקי DNA, ו- DNA מדגם 5 μl הוכן מ1.1.1.7 או 1.1.2.5 בצינור PCR .
  2. השתמש בתנאים הבאים כדי להגביר את ה- DNA: 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות; אחרי 35 מחזורים של 45 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 45 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ו- 90 שניות על 72 מעלות צלזיוס; אז 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולעזוב בגיל 15 מעלות צלזיוס.
  3. לפתור את מוצר ה- PCR השלם ב2% agarose ג'ל אלקטרופורזה על ידי.
  4. דמיינו מוצר ה- PCR (ים) של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד מכתים. Amplicon חד שבטי אפשר לראות בטווח הגודל של 250-295 נ"ב.
  5. בלו חלק ג'ל המכיל את amplicon חד שבטי בין 250-295 נ"ב.
  6. לטהר DNA מג'ל נכרת באמצעות תמצית ג'ל סטנדרטיתיון ערכה על פי הפרוטוקול של היצרן.

1.4) מטב VDJ PCR

  1. השתמש בתנאי PCR שונה הבאים כדי להגביר IgVHFR1 וIgVHFR2 באמצעות DNA האופטימלי: 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות, 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות, ארכה סופית ב C ° 72 במשך 10 דקות.

2. VDJ Amplicon ספריית הכנה ורצף

2.1) ספריית הכנה

2.1.1) סוף-תיקון

  1. העבר את מוצר ה- PCR VDJ מ1.3 לתוך צינור PCR ולהוסיף Resuspension הצפת מדגימת DNA הכנת ערכה כדי להעלות את הנפח עד 60 μl.
  2. הוסף 40 μl של תיקון סוף המיקס מערכת הכנת דגימת DNA ומערבבים היטב.
  3. דגירה התגובה על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בthermocycler מחומם מראש (30 ° C) עם מכסה מחומם מראש על 100 מעלות צלזיוס.
  4. מערבבים 136 μl חרוזים מגנטיים ו -24 μl PCR זמים ראד ראשון בצינור 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן להעביר את תגובת הסוף-תיקון כל מ2.1.1.3 לתוך צינור 1.5 מ"ל ומערבבים היטב עם פתרון חרוזים.
  5. צינורות מקום על דוכן מגנטי עבור 2 דקות, כדי לאפשר את ההפרדה של חרוזים מהפתרון. לשאוב supernatant, ולשטוף את החרוזים עם EtOH מוכן טרי 80% פעמיים בזמן שהצינור הוא על הדוכן המגנטי.
  6. לשאוב את פתרון אתנול לחלוטין ולאפשר את החרוזים לייבוש באוויר במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
  7. קח צינור מחרוזי הדוכן וגלול המגנטיים ב17.5 μl Resuspension מאגר.
  8. צינורות מקום בחזרה אל הדוכן המגנטי עבור 2 דקות לחרוזים נפרדים ממאגר Resuspension. הסר את Resuspension הצפת (מוצר קצה תיקון resuspended במאגר Resuspension עכשיו) לתוך צינור PCR נקי.

2.1.2)-עוקב

  1. להוסיף תערובת-עוקבת 12.5 μl לתוך צינור PCR המכיל מוצר קצה תיקון ומערבבים היטב.
  2. דגירה צינור PCR על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בthermocycler מחומם מראש (37 ° C) עם מכסה מחומם מראש על 100 מעלות צלזיוס.

2.1.3) מתאם קשירת

  1. להוסיף 2.5 Resuspension הצפת μl 2.5 μl קשירת מיקס, ו -2.5 μl DNA מתאם מדד לתגובה עוקב-.
  2. דגירה התגובה על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 minl בthermocycler מחומם מראש (30 ° C) עם מכסה מחומם מראש על 100 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף 5 μl Stop קשירת מאגר לכל תגובה ומערבבים היטב.
  4. מערבבים 42.5 חרוזים מגנטיים μl גם מעורבים לנקות את התגובה הבאה צעדים 2.1.1.5 ל2.1.1.8. הוסף 50 μl Resuspension מאגר לelute המוצר-ligated המתאם.
  5. נקה את המוצר-ligated מתאם בפעם שנייה על ידי שימוש בחרוזי 50 AMPure XP μl גם מעורבים, וelute המוצר ב -25 Resuspension הצפת μl לתוך צינור PCR נקי.

2.1.4 רסיסים להגביר DNA)

  1. הוסף 5 μl קוקטייל PCR פריימר ו -25 μl PCR מיקס מאסטר לצינור PCR המכיל מוצר-ligated מתאם ומערבבים היטב.
  2. בצע הגברה בthermocycler מתוכנתת מראש עם התנאים הבאים: 98 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; 10 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; אז 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהחזיק ב 10 מעלות צלזיוס.
  3. לנקות את התגובה באמצעות 50 חרוזים מגנטיים μl גם מעורבים, וelute המוצר הסופי ב -30 Resuspension הצפת μl.

2.1.5) ספריית אימות

  1. לכמת את המוצר הסופי עם fluorometer באמצעות הפרוטוקול של היצרן. ריכוז ספרייה סופי הוא בין 2.5-20 ng / μl.
  2. להעריך את איכותו של המוצר הסופי באמצעות מכשיר אנליטי עם שבב הרגישות הגבוה DNA על פי הפרוטוקול של היצרן. מצפה להקה יחידה עם הגודל הצפוי לאו IGVHFR1, IGVHFR2 או IGVHFR3. לְךָגודל xpected של מוצר הספרייה שווה את גודל amplicon VDJ המקורי בתוספת הגודל של המתאמים (~ 125 נ"ב).

2.2) VDJ-PCR ספריית איגום ורצף

  1. לחשב את molarity של כל חלק ספרייה באמצעות הנוסחא הבאה: ננומטר = [(/ 1000 ng) / נ"ב * 660] x 10 9 שבי ng הוא הריכוז של ספריית VDJ-PCR נמדדה בשלב 2.1.5.1 ונ"ב הוא השיא גודל של ספריית VDJ-PCR נמדד בשלב 2.1.5.2.
  2. לדלל את הספרייה עד 2 ננומטר (סה"כ 10 μl) עם מים ללא DNase.
  3. לשלב 10 μl של 2 ספריות ננומטר מדוללים יחד לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
  4. הוסף נפח שווה של שליטת ספייק-בPhiX לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
  5. טען את הבריכה בריכוז 07:00 על flowcell.
  6. רצף הספריות באמצעות רצף מחזור לזווג סוף 150 על פי הפרוטוקול של היצרן.

ניתוח 3. נתונים

הערה: Summניתן למצוא ארי של התסריטים ביואינפורמטיקה בשימוש בסעיף זה כקובץ קוד משלים.

3.1) יישור וQC

  1. רצף לזווג סוף מפה קורא נגד V IGH אנושי, D ומסד נתוני אזור J להוריד מאתר האינטרנט IMGT 11 באמצעות אלגוריתם פיצוץ נוקלאוטיד מותאם המבוסס על 'blastn' זמין מצמח השדה עם עונש פער פתוח של 2, עונש הארכת פער של 1, מילת אורך של 7, וסף דואר ערך של 10 -4. מחק את קריאת הזוג לא המפה לשני V IGH ואזור J.
  2. רוזן שנותרו לקריאה הזוגות שיש לי מיפויי IGH V ו- J להשיג את התדרים של שילובי VJ התאמה בכל לקרוא זוגות המתקבלים מריצת הרצף על המדגם. רוזן קריאה זוג אם זה ממופה לשני V IGH וגן J, ולאחר מכן להוסיף אלל לספירה המקבילה לשילוב VJ המסוים.
  3. דרג את הספירה לכל איזור VDJ recombined מתקבל מ3.1.2 מגבוהest לנמוך ביותר. אזור VDJ יש הגבוה ביותר קורא ספירה מוגדרת כשילוב סידור גדול.
  4. בטל רצפים מיושרים שמכסים פחות מ -35% מהסידור מחדש העיקרי שזוהה בתחום 3.1.3.

3.2) זיהוי פרופיל SHM

  1. לספור את כל דפוסי SHM פני קורא מצעד 3.1.3. להגדיר כל דפוס SHM כsubclone.
  2. לספור את מספר subclones שהמתאימים לדפוסי SHM ייחודיים שונים, ומספר קורא שממופים לsubclones הבודד.

3.3) ייצוג גרפי של תוצאות

  1. לבצע ניתוח פילוגנטי על subclones באמצעות דפוסי השימוש בשכונת הצטרפות שיטה מ" קוף "חבילת R פי הפרוטוקול של יצרן SHM המקביל שלהם. חישוב מטריצת מרחק מהמערכים שונים הפרט לשחזר את תולדות הגזע subclone נטועים רצף germline של Vשילוב J בשאלה עבור כל קבוצת מדגם לזווג.
  2. השתמש ברצף נוקליאוטידים של כל subclone כוקטור אופי ולחשב את המרחק בין כל מחרוזת המשוערת subclones בסידור מחדש VJ העיקרי לאבחון והן דגימות הישנות מקבילה באמצעות מדד מרחק Levenshtein בי מתמטי המרחק בין שני מערכים ניתן על ידי x ד, y (I, j) כאשר x ד, y (i, j) = 1 אם אני ≠ j ו0 אחרת, ולאחר מכן לסכם בפונקציה זו על פני האורך של המחרוזת המתאימה לנוקלאוטיד רצפי i ו j.
  3. גרפי להציג את מטריצת מרחקי subclone וספירת subclone המקבילה שלהם בשתי הדרכים הבאות וכתוצאה מכך:
    1. להשתמש בחבילת R "מסה" על פי הפרוטוקול של היצרן כדי להחיל קנה מידה רב ממדית למטריצת מרחק subclone וליצור עיקרון שני ממדי קואורדינטות מפה, אשר לאחר מכן הוא להתוות יחד עם הלוגריתםשל ספירת subclonal כרדיוס של המעגל.
    2. לבנות גרף undirected מבוסס על מרחק Levenshtein, שבו הקודקודים מתאימות לכל subclone השונה הנובע מהתארגנות VJ הגדולה.
      הערה: אם המרחק בין שני שיבוטים שונים שווה לאחד ולאחר מכן קיימת קצה בין שני הקודקודים האלה. אם המרחק הוא גדול יותר מאחד, אז אין קצה חיבורם.
    3. העלילה הגרף של 3.3.3.2 באמצעות פונקצית tkplot בחבילת R "iGraph" עם פריסת קמהדע קאוואי פי הפרוטוקול של היצרן. הרדיוס של הקודקודים הוא פרופורציונאלי לשורש חתוך לקוביות של המספר הכולל של שיבוטים הממופים אליו וההצללה משתמשת במגוון אדום והכחול כדי לציין את חלקם של שיבוטים שגם שייכים לאבחון (הכחול) או להרע דגימות (אדום) .

3.4) הטרוגניות מדידה (אנטרופיה)

  1. בדוק את המספרים וספירת subclone שלדפוסים אישיים של hypermutation הגופני המתרחשים בסידור מחדש VJ הגדול עבור כל זוגי של קבוצה של דגימות.
  2. לחשב את האנטרופיה האמפירית והאנטרופיה אמפירית שייר מותאם למספר שיבוטים שונים בכל מדגם באמצעות הערכת אנטרופיה מבוססת היסטוגרמה סטנדרטית.

תוצאות

ההליך הכולל של רצף VDJ (VDJ-seq), כולל מיצוי DNA, recombined הגברה VDJ אזור וטיהור, בניית ספריית רצף, קורא עיבוד, וניתוח פילוגנטי, מיוצג באיור 1. באופן שגרתי 5-200 מיקרוגרם DNA יכול להאסף מ חלקים קפואים רקמות מוצקות או 0.5-20 מיקרוגרם DNA מסעיפי רקמות מוטבע פרפין-קבוע פורמלין. בהתאם ?...

Discussion

בגלל המספר כמעט בלתי מוגבל של חזרות של רצף מידע המקודד על ידי סידור מחדש VDJ וSHM במוקד IGH של תאי B אנושיים, בדיקה של כל רפרטואר IGH ידי תפוקה גבוהה עמוק רצף הוכיחה להיות דרך יעילה ומקיפה להתוות משובט ואוכלוסיות B-תא תת-משובטים. יתר על כן, אסטרטגיה זו יכולה לשמש כדי לחקור את נ?...

Disclosures

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
EthanolVWR89125-170200 proof, for molecular biology
TE bufferLife Technologies12090-01510 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
XylenesVWREM-XX0055-6500 ml
Proteinase K Life Technonogies25530-015100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution MixPromegaU151510 mM each nucleotide
10x PCR Buffer Roche11699105001Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2Life Technonogies431180650 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size LadderInvivoscribe Technologies 2-096-002033 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel DetectionInvivoscribe Technologies 5-101-003033 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel DetectionInvivoscribe Technologies 1-101-002033 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA PolymerasePromegaM829120 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) bufferCorning (cellgro)46-011-CM6x1 L
50x TAE BUFFER  VWR101414-2981 L
Ethidium bromide solutionSigma-AldrichE151010 mg/ml
25 bp DNA LadderLife Technologies105970111 µg/µl
100 bp DNA LadderLife Technologies15628-0191 µg/µl
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-500500 g
40% Acrylamide/Bis SolutionBio-Rad Laboratories1610144500 ml
QIAquick Gel Extraction KitQiagen2870450 columns
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay KitLife TechnologiesQ32854
High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626
2100 BioanalyzerAgilent Technologies
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
MiSeqIllumina
Qubit 2.0 FluorometerLife TechnologiesQ32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Magnetic standLife Technologies4457858
Gel imaging systemBio-Rad Laboratories170-8370

References

  1. Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
  2. Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
  3. Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
  4. Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
  5. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
  6. Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
  7. Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
  8. Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
  9. Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
  10. Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
  11. Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
  12. Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
  13. Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

106VDJhypermutationVDJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved