VDJ-Seq: B Hücreli Lenfoma klonal Evrim Patterns Reveal Rearranged İmmünglobulin Ağır Zincir Gen Derin Sıralama Analizi

Özet

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

Özet

Anlama tümör klonalite tumorigenezden ve hastalığın ilerlemesi yer alan mekanizmaların anlaşılması için önemlidir. Buna ek olarak, belirli bir mikro-ortam veya uygulamaya yanıt olarak bir tümör içinde meydana klonal bir bileşim değişiklikleri anlama tümör hücrelerini yok etmek için daha gelişmiş ve etkili yöntem tasarımına yol açabilir. Ancak, izleme tümör klonal alt popülasyonları nedeniyle ayırt belirteçlerin eksikliği zor olmuştur. Bu sorunu çözmek için, bir VDJ seq protokol VDJ rekombinasyonu ve somatik hipermutasyona (SHM), B hücreli lenfomalarda iki benzersiz özellikleri istismar ederek diffüz büyük B hücreli lenfoma (DLBCL) nüks klonal evrim modellerini izlemek için oluşturuldu.

Bu protokolde, indeksleme potansiyeli ile Yeni Nesil sıralama (NGS) kütüphaneler birincil tanı ve nüks DLBCL samp çiftleri amplifiye yeniden düzenlenmiş immünoglobulin ağır zincir (IgH) VDJ bölgesinden inşa edildiles. Numune başına ortalama milyondan fazla yarısı VDJ dizileri VDJ yeniden düzenleme ve SHM bilgilerini bir arada bulunduran sıralama, sonra elde edildi On. Buna ek olarak, özel biyoinformatik boru hatları tamamen bu örneklerin içinde IgH-VDJ repertuar karakterizasyonu için sırası bilgilerini kullanmak için geliştirilmiştir. Ayrıca, boru hattı yeniden yapılanma ve tanı tümörlerinin tanı ve nüks tümör çiftleri arasındaki klonal evrim kalıpları düşüldükten içinde klonal heterojenite incelenmesini sağlayan bireysel tümörlerin klonal mimarisi, karşılaştırılmasına olanak sağlar. Birkaç tanı nüks çiftleri bu analizi uygularken, birden fazla ayırt edici tümör evrimsel modeller DLBCL nüks yol açabilecek önemli kanıtlar ortaya çıkardı. Ayrıca, bu yaklaşım, minimal rezidüel hastalığın tanımlanması, nüks ilerleme ve tedaviye yanıtı izlemek ve bağışıklık repertuarıyla soruşturma gibi diğer klinik yönlerini içine genişletilebilirolmayan lenfoma bağlamlarda es.

Giriş

Kanser klonal bir hastalıktır. Otuz yıl önce Peter C. Nowell kanseri klonal evrim modeli ¹ teklif Ne zamandan beri birçok çalışma tümör örnekleri içinde klonal popülasyonları incelemek ve tumorigenezden sürecini ² altında yatan klonal genişleme ve evrim modellerini yeniden denedim. Son zamanlarda, bütün genom dizileme klonal heterojenite ve evrim ^3,4 derin bir bakmak araştırmacıları sağladı. Ancak, pek çok hücre tipinde izlenebilir belirteçlerin eksikliği nedeniyle, kesin klonal mimari ve evrimsel yolu sonucuna zordur. Neyse DLBCL dahil olmak üzere birçok lenfoid maligniteler, kaynaklandığı olgun B hücrelerinde doğal bir klonalite işareti vardır. Antijen uyarılmasına tepki olarak bu segmentlerin büyük bir havuzdan bir araya segmenti, her bir B-hücresi V _{H (değişken),} D (çeşitlilik) katılarak tek bir üretim IgH VDJ sekansı meydana getirebilir, ve _J, H (birleştirme). Bu pr sırasındakapsayabilecektir orijinal dizisinin küçük porsiyonlarda silinebilir ve ek olmayan şablonu nükleotidleri benzersiz VDJ yeniden düzenlenmesini oluşturmak için ilave edilebilir. Bu özel VDJ yeniden düzenlenmesi, bu nedenle bireysel olgun B-hücresi ve yavrular ⁵ etiketleme, bu B-hücre tüm yavrularında kalıtsal olabilir. Bundan başka, antikor, SHM havuz genişlemesi ve antikor afinite ⁶ arttırılması için ek mutasyonlar dahil etmek için daha sonra germinal merkez (GC) reaksiyonunda rekombine VDJ sekanslarda ortaya çıkar. Bu nedenle, karşılaştırma ve bu işlemleri geçirmiş lenfoma örnekleri VDJ ve SHM desen karşılaştırarak, tümör içi heterojenlik tarif edilebilir ve hastalığın gelişimi klonal yolu saptanabilecektir.

Daha önce, VDJ yeniden düzenlenme ve SHM sekans bilgilerini elde etmek için PCR ürünleri, ve daha sonra Sanger sıklıklaştırıcı klonlama, rekombine bölgeleri amplifiye PCR ile tespit edilebilir. Bu yaklaşım, iTüm rekombine VDJ repertuarının, sadece çok küçük bir bölümünü almak ve belirli bir örnek içinde klonal nüfusun genel temsil karakterizasyonu engelleyen, düşük verimlilik ve düşük bir verim s. Modifiye yaklaşım VDJ PCR ürünlerinden NGS endeksli sıralama kütüphaneleri üreten ve numune başına daha yarım milyondan fazla rekombine VDJ dizileri elde etmek için PE 2x150 bp sıralama yapılarak oluşturuldu. Buna ek olarak, özel bir boru hattı filtre VDJ dizileme her okuma düzenlenmeleri ve SHMS belirlemek ve her numunenin klonal mimarisi üzerine filogenetik analizi gerçekleştirmek için okur, kalite kontrol (QC) gerçekleştirmek hizalamak için geliştirilmiştir. Buna ek olarak, yeni bir yaklaşım daha çeşitli hastalık evrelerinde toplanan örneklerin klonal evrim modellerini karakterize etmek kurulmuştur.

Biz DBBHL hasta numunelerinin için bu tekniği uyguladık. DBBHL kadar bir inci sık nüks ile non-Hodgkin lenfoma saldırgan formudurHastaların ⁷ ird. Yaklaşık 5 yıl ⁸ sonra meydana rağmen DLBCL nüksler normalde ilk tanı 2 ila 3 yıl içinde erken ortaya çıkar. Nüksetmiş hastalarda prognoz sadece% 10 nedeni tedavi seçenekleri kısıtlı 3 yıllık progresyonsuz sağkalım elde kötüdür. Bu DBBHL nüks ^9,10 tedavisinde yeni yaklaşımlar için acil ihtiyaç için temeldir. Ancak, DBBHL nüks ile ilişkili moleküler mekanizmalar henüz tam olarak bilinmemektedir. Özellikle, DBBHL nüks gelişimi sırasında tanı ve klonal evrim de klonal heterojenite rolü, halen uncharacterized olan zor nüks tahmin etmek doğru ve yararlı bir biyobelirteci tanımlamak için yapım. Bu soruları gidermek için, biz eşleşti primer tanı nüks DBBHL örnek çiftlerinden birden çiftleri bizim VDJ-sıralama yaklaşımı uygulandı. Nüks İki farklı klonal evrim senaryoları tanı ve nüks samp arasındaki klonal mimarileri karşılaştırıldığında ortaya çıkanBirden moleküler mekanizmaları öneriyor les DLBCL nüks tutulabilir.

Protokol

1. VDJ Büyütme

Tümör Örneklerinden 1.1) DNA Ekstraksiyon

1. Donmuş Ekim gömülü normal veya malign dokuların ince kesitlerinin (10-20 mikron) DNA ayıklayın.
   1. Proteinaz K ile (0.5 mg / ml, son konsantrasyon elde 4 mi Nükleik Lizis Tamponu (; 0.3 M NaCl 0.002 M _Na2EDTA 0,0075 M Tris HCI, pH 8.2) bir kriyostat mikrotom ile kesilmiş gömülü doku 10-30 ince kesitler Digest ) ve gece boyunca bir 37 ° C su banyosu içinde, 15 ml santrifüj tüpü içinde 0,625% SDS.
   2. Sindirim karışımı, doymuş NaCl (5 M) 1 ml ilave edilir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır.
   3. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1100 x g'de santrifüjleyin.
   4. Yeni bir 15 ml santrifüj tüpüne süpernatant aktarın ve 100% etanolden iki hacmin ilave edin.
   5. Tüpü 6-8 kez tersine çevirerek karıştın. 4 ° C'de 60 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüjleyin Çökelen DNA toplamak.
   6. % 70 etanol ile iki kez DNA pelet yıkayın. Centr15 dakika pelet toplamak için her zaman için 5.000 xg'de ifuge.
   7. Bir çalkalama gece boyunca oda sıcaklığında 100-400 ul TE tampon maddesi içinde DNA içinde çözülür. DNA verimi doku boyutuna bağlı olarak 5 ila 200 ug (50-500 ng / ul arasında nihai konsantrasyon)
2. Formalinle sabitlenmiş, parafin gömülü (FFPE), normal veya habis doku ince bölümler (10-20 um) DNA ekstrakte edin.
   1. Iki kez 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 10 dakika, her seferinde, oda sıcaklığında de-paraffinize ksilen 1 ml parafin kesitleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 x g'de iplik doku bölümleri toplayın.
   2. Oda sıcaklığında 10 dakika tortu, ksilenler çıkarmak için her iki kez 1 ml% 100 etanol içinde bölümleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 x g'de iplik doku bölümleri toplayın. Parafin tamamen bu noktada çözülür ve sadece doku bölümü ayakta durmaktadır.
   3. Oda te de bölümleri Hava kuruması10-15 dakika boyunca mperature.
   4. (Nükleaz içermeyen su ile 10x PCR tamponu seyreltilmiş), 1x PCR tampon maddesi ile bir 0.5 mg / ml Proteinaz K solüsyonu sağlayın. 50-100 ul'lik bir nihai hacim içinde örnekleri Proteinaz K solüsyonu ilave edin ve gece boyunca 37 ° C enkübe edilir.
   5. Proteinaz K. inaktive etmek için 10 dakika boyunca 95 ° C 'de ısıtınız örnekleri
      Not: Bu adımda, örnek DNA, PCR tampon maddesi içinde çözülmüş ve direkt Adım 1.2 ve 1.3 'de kullanılabilir. DNA verimi doku boyutuna bağlı olarak 0.5 ila 20 ug (10-200 ng / ul arasında nihai konsantrasyon).

1.2) DNA Kalite Değerlendirmesi

1. PCR tüpünde ticari merdiven kiti ana karışımı 45 ul 0,25 ul Taq DNA polimeraz karıştırın.
2. PCR tüpüne 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir 5 ul DNA ekleyin ve en az 5 kez pipetleme aşağı iyice karıştırın.
3. 95 ° C için: DNA'yı büyütmek için aşağıdaki şartları kullanın7 dakika; 95 ° C, 60 ° C 'de 45 saniye ve 72 ° C'de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C 'de sabit.
4. TBE (Tris / borat / EDTA) ve% 2 agaroz jeli hazırlayın.
5. 4 ul 6x yükleme boyası ile 20 ul PCR reaksiyon karışımı, bir% 2 agaroz jeli üzerine yüklenir.
6. 0.5 ug / ml etidyum bromür solüsyonu ile agaroz jel leke ve bir jel hayal sistemi ile PCR ürünleri algılar. Not: 100, 200, 300, 400 ve 600 bp ebatlarda 5 PCR ürünleri elde edildi örnekleri VDJ amplikonları oluşturmak için devam edilecektir.
   DİKKAT: Etidyum bromür güçlü bir mutajen olduğunu. Koruyucu dişliler, yani eldiven giyerek son derece dikkatli ele ve kurumun kurallarına göre belirli kaplara atın.

1,3) VDJ PCR

1.3.1) Çerçeve Bölgesinde 1 Amplify recombined IgH VDJ Segmenti (IgVHFR1)

1. Tüp etiketi 45 ul ana karışımı karıştırıned ticari bir somatik IGH Hipermutasyon Deneyi Jel Tespiti için kitin "karışımı 2", Taq DNA polimeraz ul 0.25, ve bir PCR tüpü içinde 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir 5 ul numune DNA kullanılabilir.
2. DNA'yı büyütmek için aşağıdaki koşullar kullanın: 7 dakika boyunca 95 ° C; 95 ° C, 60 ° C 'de 45 saniye ve 72 ° C'de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C 'de sabit.
3. Elektroforez ile% 2 agaroz jeli içinde bütün PCR ürünü giderin.
4. 0.5 ug / ml etidyum bromür solüsyonu ile agaroz jel leke ve bir jel görüntüleme sistemi ile PCR ürünleri algılar. Bir monoklonal amplikon 310-380 bp boyut aralığı ile tahmin edilmektedir.
5. 310-380 bp arasındaki monoklonal amplikonu içeren jel bölümü tüketim.
6. Üreticinin protokolüne göre, standart bir Gel Extraction Kit, çıkarılan jel DNA saflaştınlır. Not: FR1 fragmanları elde edilebilir örnekleri için, iGV bol miktarda olan gerek yokturHFR2 ve IgVHFR3.

1.3.2) Çerçeve Bölgesinde 2 Amplify recombined IgH VDJ Segmenti (IgVHFR2)

1. PCR tüpü içinde 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir jel Tespit kiti ticari bir IGH Gen Klonalite Testinin "Tüp B", Taq DNA polimeraz ul 0,25 ve 5 ul örnek DNA olarak adlandırılan tüp 45 ul ana karışımı karıştırın .
2. DNA'yı büyütmek için aşağıdaki koşullar kullanın: 7 dakika boyunca 95 ° C; 95 ° C, 60 ° C 'de 45 saniye ve 72 ° C'de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C 'de bırakın.
3. Elektroforez ile% 2 agaroz jeli içinde bütün PCR ürünü giderin.
4. 0,5 ug / ml etidyum bromür boyama PCR ürün (ler) görselleştirme. Bir monoklonal amplikon 250-295 bp büyüklüğünde bir aralık içinde görülebilir.
5. 250-295 bp arasındaki monoklonal amplikonu içeren jel bölümü tüketim.
6. Standart Jel Özü kullanılarak eksize jelden DNA arındırmaküreticinin protokolüne uygun iyon Kit.

1.4) Optimize VDJ PCR

1. 7 dakika, 60 saniye, 60 saniye boyunca 60 ° C, 95 ° C 40 döngü, 90 saniye için 72 ° C sıcaklıkta son uzatma, 95 ° C: IgVHFR1 ve IgVHFR2 optimal DNA kullanılarak amplifiye etmek için, aşağıdaki tadil edilmiş PCR koşulları kullanarak 10 dakika boyunca 72 ° C.

2. VDJ Amplikon Kütüphane hazırlanması ve Sekanslanması

2,1) Kütüphane hazırlanması

2.1.1) End-onarım

1. PCR tüp içine 1.3 VDJ PCR ürünü aktarın ve 60 ul hacim getirmek için DNA Numune Hazırlama Seti Tekrar Süspansiyonu Buffer ekleyin.
2. DNA Numune Hazırlama Seti sonu Onarım Mix 40 ul ekleyin ve iyice karıştırın.
3. 100 ° C'de önceden ısıtılmış bir kapak ile önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (30 ° C) 'de 30 dakika süre ile 30 ° C' de reaksiyon inkübe edin.
4. 136 ul manyetik boncuk ve 24 ul PCR g MixRade Suyun ilk olarak 1.5 ml bir tüp içinde, daha sonra 1,5 ml tüp içine 2.1.1.3'de tamamını sonu tamir reaksiyonunu aktarmak ve boncuk çözeltisi ile iyice karıştırılır.
5. 2 dakika için bir manyetik stand üzerine yerleştirin borular çözeltiden boncuk ayrılmasını sağlamak için. Süpernatantı aspire ve tüp manyetik standında açıkken iki kez% 80 taze hazırlanmış EtOH ile boncuk yıkayın.
6. Tamamen etanol çözeltisi aspire ve 15 dakika için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca havada kurumaya boncuklar verir.
7. 17.5 ul Tekrar Süspansiyonu Tampon manyetik standı ve tekrar süspansiyon boncuk kapalı tüp atın.
8. Geri Tekrar Süspansiyonu Tampon ayrı boncuk 2 dakika süreyle manyetik stand üzerine yerleştirin tüpleri. Temiz bir PCR tüpüne Tekrar Süspansiyonu Buffer (Son onarım ürünü şimdi Tekrar Süspansiyonu tamponunda yeniden süspanse) çıkarın.

2.1.2) A-atık

1. Son onarım ürünü ihtiva eden PCR tüpüne 12.5 ul A-atık karışımı ekleyin ve iyice karıştırın.
2. 100 ° C 'de bir ön-ısıtılmış kapak ile, bir önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (37 ° C)' de 30 dakika süre ile 37 ° C 'de, PCR tüpü inkübe edin.

2.1.3) Adaptör ligasyonu

1. A-atık reaksiyona 2.5 ul Tekrar Süspansiyonu Buffer, 2.5 ul ligasyon Mix ve 2.5 ul DNA Adaptör Endeksi ekleyin.
2. 100 ° C'de önceden ısıtılmış bir kapak ile önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (30 ° C) 'de 30 minl 30 ° C' de reaksiyon inkübe edin.
3. Her reaksiyon içine 5 ul Dur ligasyon Buffer ekleyin ve iyice karıştırın.
4. 2.1.1.5 2.1.1.8 adımları aşağıdaki reaksiyonu temizlemek için 42.5 ul iyi karıştırılmış manyetik boncuk karıştırın. 'Adaptörü bağlı ürünü elüte etmek için 50 ul Tekrar süspansiyona, Tamponu ekleyin.
5. 50 ul iyi karıştırılmış AMPure XP boncuklar kullanılarak ikinci bir defa 'adaptörü bağlı ürün temizleme ve temiz bir PCR tüpüne 25 ul Tekrar süspansiyona, Tamponu içinde, ürünü yıkamak.

2.1.4) Genişletme DNA Fragments

1. Adaptör bağlandı ürünü içeren PCR tüp 5 ul PCR Primer Kokteyl ve 25 ul PCR Master Mix ekleyin ve iyice karıştırın.
2. Aşağıdaki koşullar ile önceden programlanmış bir PCR amplifikasyon yapın: 30 saniye için 98 ° C; 10 sn için 98 ° C 10 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 30 sn için 72 ° C; Daha sonra 5 dakika boyunca 72 ° C ve 10 ° C'de tutun.
3. 50 ul iyi karıştırılmış manyetik boncuklar kullanarak tepkisini temizleyin ve 30 ul Tekrar Süspansiyonu Tampon nihai ürün Zehir.

2.1.5) Kütüphane Doğrulama

1. Üreticinin protokolü kullanılarak bir florometre ile nihai ürünü ölçmek. Nihai kütüphanesi konsantrasyonu 2,5 ila 20 ng / ul arasındadır.
2. Üreticinin protokolüne göre Yüksek Hassasiyet DNA çip ile bir analitik araç kullanılarak nihai ürünün kalitesini değerlendirmek. IGVHFR1, IGVHFR2 ya IGVHFR3 biri için umulan boyutta tek bir bant bekliyoruz. SanaKütüphane ürünün xpected boyutu orijinal VDJ amplikonun boyutunu artı adaptörleri (~ 125 bp) boyutunu eşittir.

2.2) VDJ-PCR Kütüphane havuzu ve Sıralama

1. Aşağıdaki formül kullanılarak her bir kütüphane fraksiyonu molaritesini hesaplayın: nM = [(ng / 1000) / bp * 660] ng adımda 2.1.5.1 ölçülen VDJ-PCR kütüphane konsantrasyonu 10 ⁹ x ve bp doruğudur VDJ-PCR kütüphanenin ebadı adım 2.1.5.2 kaydedilmiştir.
2. DNaz içermeyen su ile 2 nM (10 ul toplam) kütüphaneyi seyreltin.
3. Birlikte bir 1,5 ml tüp içine seyreltildi 2 nM kütüphanelerinin 10 ul birleştirin.
4. 1,5 ml tüp içine phix başak kontrol eşit hacim.
5. Bir akış hücresi üzerine 07:00 konsantrasyonda havuz yükleyin.
6. Üreticinin protokolüne göre eşleştirilmiş uç 150 çevrim sequencer kullanarak kütüphaneleri sırası.

3. Veri Analizi

Not: SummBu bölümde kullanılan biyoinformatik Dizelerin li bir Ek kod dosyası olarak bulunabilir.

3.1) Uyum ve QC

1. Harita paired-end dizileme, bir insan IGH V karşı okur 2 aralık açık cezası, 1 aralık uzatma cezası ile NCBI temin 'BLASTN' dayalı bir uyarlanmış nükleotid blast algoritmasını kullanarak IMGT web sitesinden ¹¹ indirilen Ge ve J bölge veritabanı, 7 sözcük uzunluğu ve 10 ^-4 e-değeri eşik. Bir IGH V ve J bölge hem eşleşmiyor okuma-çifti atın.
2. Tüm örnek üzerinde sıralama çalışmadan elde edilen çiftleri okumak karşısında VJ kombinasyonları eşleşen frekanslarını elde etmek için IGH V ve J eşlemeleri var kalan okuma-çiftleri sayın. Bir IGH V ve J geninin hem eşleştirilmiş ise salt çifti sayın ve sonra belirli VJ kombinasyonu gelen saymak onun alel ekleyin.
3. Yüksekten 3.1.2 elde edilen her bir rekombine VDJ bölge için sayıları Ranken est. VDJ bölgesi en yüksek sayısı önemli bir yeniden düzenleme kombinasyonu olarak tanımlanır okur vardır.
4. 3.1.3 tanımlanan etki büyük düzenlenmesi az% 35 kapsayacak hizalanmış dizileri atın.

3.2) SHM Profili Kimlik

1. Adım 3.1.3 okur genelinde tüm SHM desenleri güvenin. Bir alt klon olarak her SHM desen tanımlayın.
2. Farklı benzersiz SHM desenleri karşılık olan alt grupların sayısını ve bireysel altklonları eşlenen okur sayısını.

Sonuçların 3.3) Grafik Temsil

1. Üreticinin protokolüne göre R paketi "maymun" dan yöntemini birleştiren bir mahalle kullanarak gelen SHM kalıplarını kullanarak altklonları üzerinde filogenetik analizi yapın. V tohum çizgisi dizisine köklü altklonüs soyoluşu yeniden bireysel farklı hizalamaları bir mesafe matrisi hesaplayınHer paired sample seti için söz konusu J kombinasyonu.
2. Karakter vektör olarak, her alt klonun nükleotit sıklığı kullanımı ve iki eşleştirmede arasındaki mesafe d, _{x, y} ile verilir matematiksel tanı ve Levenshtein mesafe ölçüsünü kullanılarak ilgili nüks numuneler için önemli bir yeniden düzenleme VJ tüm alt-klonları arasındaki yaklaşık dize mesafenin hesaplanması (i, j) d _{x, y} (i, j) = 1 i j ≠ 0, aksi takdirde, ardından dizileri i ve j nükleotid karşılık gelen dize uzunluğu boyunca bu işlevi toplamı ise nerede.
3. Grafiksel aşağıdaki iki yolla altklonüs mesafeler ve bunlara karşılık gelen altklonüs sayıları çıkan matris görüntüler:
   1. R paketi kullanın "MASS" üreticinin protokolüne göre altklonüs mesafe matris boyutlu ölçekleme uygulamak ve iki boyutlu bir ilke oluşturmak için daha sonra logaritma ile birlikte çizilmiştir harita, koordinatlardairenin yarıçapı olarak subclonal sayar.
   2. Köşeleri büyük VJ düzenlenmesi kaynaklanan her farklı alt klon karşılık Levenshtein mesafe dayalı bir yönsüz grafik oluşturun.
      Not: Bir, daha sonra bu iki köşe arasındaki bir kenar bulunduğunu iki ayrı klonlar arasındaki mesafe eşit ise. Uzaktan bir daha büyük ise, daha sonra bunları bağlayan herhangi bir kenarı vardır.
   3. Üreticinin protokolüne uygun olarak Kamada Kawai düzeni "iGRAPH" R paketinde tkplot fonksiyonunu kullanarak 3.3.3.2 grafiği çizilir. Köşe yarıçapı kendisine eşlenen klonların toplam sayısının küp kökü ile orantılıdır ve gölgeleme ya Tanı (mavi) veya nüks (kırmızı) örneklere ait klonların oranını belirtmek için kırmızı ve mavi aralığını kullanır .

3.4) Heterojenite (Entropi) Ölçüm

1. Numaralarını ve altklonüs sayıları inceleyinHer biri için en önemli VJ düzenlenmesi meydana gelen somatik hipermutasyon bireysel desenler numunelerin set eşleştirilmiş.
2. Standart histogram tabanlı entropi tahmin kullanarak her numunedeki farklı klonların sayısı için ayarlanmış ampirik entropi ve artık ampirik entropi hesaplayın.

Sonuçlar

DNA izolasyonu da dahil olmak üzere VDJ sekanslama (VDJ seq), genel prosedür, işleme ve filogenetik analizi okur VDJ bölgesi amplifikasyon ve saflaştırma, sıralama belge konstrüksiyon rekombine, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Rutin 5-200 ug DNA alınabilir dondurulmuş katı doku bölümleri veya formalin ile fikse parafine gömülü doku bölümleri 0,5-20 mg DNA. Kalite, yeniden düzenleme desen, ve tek tek numunelerin SHM derecesine bağlı olarak, farklı örneklerden VDJ PCR ürünlerin...

Tartışmalar

Çünkü insan B hücrelerinin IGH loküsündeki VDJ düzenlenmesi ve SHM tarafından kodlanmış dizi bilgi iterasyon neredeyse sınırsız sayıda, yüksek hacimli derin dizileme ile tüm IGH repertuarının inceleme klonal çizmek için etkin ve kapsamlı bir yol olduğunu kanıtladı ve alt klonal B hücre popülasyonları. Bundan başka, bu strateji hastalığın çeşitli evrelerinde boyunca alınmış hasta örneklerinin klonal ve alt klonal mimarileri karşılaştırarak B hücre tümör gelişiminin remisyon ve...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	89125-170	200 proof, for molecular biology
TE buffer	Life Technologies	12090-015	10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
Xylenes	VWR	EM-XX0055-6	500 ml
Proteinase K	Life Technonogies	25530-015	100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix	Promega	U1515	10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer	Roche	11699105001	Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2	Life Technonogies	4311806	50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder	Invivoscribe Technologies	2-096-0020	33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	5-101-0030	33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	1-101-0020	33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8291	20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer	Corning (cellgro)	46-011-CM	6x1 L
50x TAE BUFFER	VWR	101414-298	1 L
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich	E1510	10 mg/ml
25 bp DNA Ladder	Life Technologies	10597011	1 µg/µl
100 bp DNA Ladder	Life Technologies	15628-019	1 µg/µl
UltraPure Agarose	Life Technologies	16500-500	500 g
40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad Laboratories	1610144	500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	50 columns
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Life Technologies	Q32854
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
MiSeq	Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Magnetic stand	Life Technologies	4457858
Gel imaging system	Bio-Rad Laboratories	170-8370