VDJ-Seq: Tiefe Sequenzierung Analyse Rearranged Immunglobulin-Schwerketten-Gen zu Klonale Entwicklung Muster der B Zell-Lymphom Reveal

Zusammenfassung

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

Zusammenfassung

Verständnis Tumor Klonalität ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Tumorentstehung und Progression der Erkrankung beteiligt sind. Zusätzlich Verständnis der klonalen Zusammensetzungsänderungen, die innerhalb eines Tumors in Reaktion auf bestimmte Mikroumgebung oder Behandlungen auftreten können, um die Gestaltung komplexer und wirksame Ansätze führen zu beseitigen Tumorzellen. Allerdings hat Tracking Tumor klonale Subpopulationen war aufgrund des Fehlens der unterscheidbaren Markierungen schwierig. Zur Lösung dieses Problems wurde ein VDJ-seq-Protokoll erstellt, um die klonalen Evolution Muster der diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL) Rückfall durch Ausnutzung VDJ Rekombination und somatische Hypermutation (SHM), zwei einzigartige Features von B-Zell-Lymphomen zu verfolgen.

In diesem Protokoll wurden Next-Generation Sequencing (NGS) Bibliotheken mit Indexierung Potential von verstärkten umge Immunglobulin-Schwerkette (IgH) VDJ-Region von Paaren von Primärdiagnose und Rückfall DLBCL samp aufgebautles. Im Durchschnitt mehr als eine halbe Million VDJ-Sequenzen pro Probe wurden nach Sequenzierung, die sowohl VDJ Umlagerung und SHM Informationen enthalten erhalten. Zusätzlich wurden angefertigt Bioinformatik Leitungen entwickelt und vollständig genutzt Sequenzinformation für die Charakterisierung der IgH-VDJ Repertoire in diesen Proben. Darüber hinaus ermöglicht die Pipeline des Wiederaufbaus und der Vergleich der klonalen Architektur der einzelnen Tumoren, die die Prüfung des klonalen Heterogenität innerhalb der Diagnose von Tumoren und Abzug der klonalen Evolution Muster zwischen Diagnose und Rezidivtumor Paaren ermöglicht. Bei der Anwendung dieser Analyse auf mehrere Diagnose-Rückfall-Paare aufgedeckt haben wir wichtige Beweismittel, dass mehrere Unterscheidungstumor evolutionären Muster könnte zu DLBCL Rückfall führen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz auch auf andere klinische Aspekte wie Identifizierung der minimalen Resterkrankung, Überwachung Rückfall Fortschritt und Ansprechen auf die Behandlung und Untersuchung von Immun Repertoire erweitert werdenn in nicht-Lymphom Kontexten.

Einleitung

Krebs ist eine klonale Erkrankung. Seit vor dreißig Jahren, als Peter C. Nowell vorgeschlagen, den Krebs zu klonalen Evolution Modell ¹ haben viele Studien versucht, klonalen Populationen innerhalb Tumorproben zu sezieren und zu rekonstruieren klonalen Expansion und Evolution Muster, die die Tumorentstehung Prozess ² zugrunde liegen. Vor kurzem hat Vollgenomsequenzierung Forschern ermöglicht, einen tiefen Blick auf die klonalen Heterogenität und Evolution ^3,4 zu nehmen. Aufgrund des Mangels an tractable Marker in vielen Zelltypen ist es jedoch schwierig, die genaue klonalen Architektur und Entwicklungspfad abzuleiten. Glücklicherweise gibt es eine natürliche Klonalität Marker in reifen B-Zellen, aus denen viele malignen Lymphomen, einschließlich DLBCL, stammen. Als Antwort auf Antigen-Stimulation, wobei jede B-Zelle kann eine einzelne produktive IgH VDJ Sequenzsegment zusammen aus einem großen Pool von diesen Segmenten zu bilden, durch Verbinden einer V _H (variable), eine D (Diversity) und ein J _{H (Verbindung).} Während dieser process können kleine Teile der ursprünglichen Sequenz deletiert werden und zusätzliche ohne Matrize Nukleotide können verwendet werden, um eine einzigartige VDJ-Rearrangement erstellen. Diese spezifische VDJ Umlagerung kann in allen Nachkommen dieser B-Zelle geerbt werden daher Tagging einzelne reife B-Zelle und ihrer Nachkommenschaft ^5. Weiterhin tritt SHM an rekombinierten VDJ-Sequenzen in der anschließenden Keimzentren (GC) Reaktion zur zusätzlichen Mutationen für die Erweiterung des Antikörperpool und die Verstärkung der Antikörperaffinität ⁶ einzuführen. Daher wird durch Vergleich und die Gegen VDJ und SHM Muster Lymphom Proben, die diese Prozesse durchlaufen haben könnte intratumorale Heterogenität abzugrenzen und klonale Entwicklungsweg der Krankheit kann abgeleitet werden.

Bisher konnten VDJ-Rearrangement und SHM durch PCR Amplifikation der rekombinierten Bereiche, Klonierung der PCR-Produkte, und anschließend die Sanger-Sequenzierung, um Sequenzinformation zu erhalten, identifiziert werden. Dieser Ansatz is niedrigem Durchsatz und niedrige Ausbeute, Abrufen nur einen sehr kleinen Teil des gesamten rekombiniert VDJ Repertoire und innerhalb einer gegebenen Probe behindern die Charakterisierung der Gesamtdarstellung der klonalen Population. Ein modifizierter Ansatz wurde von Erzeugung NGS indexiert Sequenzierungsbibliotheken von VDJ PCR-Produkte und die Durchführung PE 2x150 bp-Sequenzierung, um mehr als eine halbe Million rekombiniert VDJ-Sequenzen pro Probe zu erhalten erstellt. Darüber hinaus wurde eine benutzerdefinierte Pipeline entwickelt, um die Qualitätskontrolle (QC) durchführen, richten, Filter VDJ Sequenzierung liest den Umlagerungen und SHM jedes Lese identifizieren und durchzuführen phylogenetische Analyse auf der klonalen Architektur jeder Probe. Darüber hinaus wurde ein neuer Ansatz wurde gegründet, um weiteren Charakterisierung der klonalen Evolution Muster für Proben bei verschiedenen Krankheitsstadien gesammelt.

Wir haben diese Technik, um DLBCL Patientenproben angewendet. DLBCL ist eine aggressive Form von Non-Hodgkin-Lymphom mit häufigen Rückfällen in bis zu einem third der Patienten ^7. DLBCL Rückfälle in der Regel früh auftreten, innerhalb von 2 bis 3 Jahren von der ersten Diagnose, obwohl einige haben nach 5 Jahren ⁸ auftreten. Prognose für die Rückfall-Patienten ist schlecht, mit nur 10% zu erreichen 3 Jahre das progressionsfreie Überleben aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Dies ist die Grundlage, um den dringenden Bedarf an neuen Ansätzen zur DLBCL Rezidiv ^9,10 behandeln. Allerdings sind die molekularen Mechanismen mit DLBCL Rückfall assoziiert noch weitgehend unbekannt. Insbesondere ist die Rolle von klonalen Heterogenität bei der Diagnose und klonale Entwicklung während DLBCL Rezidiv Entwicklung derzeit nicht charakterisierten, was es schwierig macht, eine genaue und nützliche Biomarker Rezidiv vorher definieren. Um diese Fragen zu beantworten, haben wir unsere angelegten VDJ-Sequenzierungsansatz auf mehreren paarweise mit identischer Primärdiagnose-Rückfall DLBCL Probenpaare. Zwei verschiedene klonale evolutionären Szenarien Rezidiv aus dem Vergleich der klonalen Architekturen zwischen der Diagnose und Rezidiv samp tauchtles, die mehrere molekulare Mechanismen schlägt in DLBCL Rückfall einbezogen werden.

Protokoll

1. VDJ Amplification

1.1) DNA-Extraktion aus Tumorproben

1. Extrahieren von DNA aus dünnen Abschnitten (10-20 um) eingefroren Oktober eingebettet normalen oder malignen Geweben.
   1. Verdauen 10-30 dünne Schnitte von eingebetteten Gewebe von einem Kryostat-Mikrotom in 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2, 0,3 M NaCl, 0,002 M _Na 2 EDTA) geschnitten mit Proteinase K (0,5 mg / ml, Endkonzentration ) und 0,625% SDS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen in einem 37 ° C-Wasserbad über Nacht.
   2. 1 ml gesättigtem NaCl (5 M), um die Verdauung des Gemischs und kräftig schütteln, 15 Sek.
   3. Zentrifuge bei 1.100 xg für 15 min bei Raumtemperatur.
   4. Den Überstand in ein neues 15 ml Zentrifugenröhrchen und fügen Sie zwei Volumina 100% Ethanol.
   5. Mischen Sie durch Umdrehen des Röhrchens 6-8 mal. Zentrifuge bei 5000 × g für 60 min bei 4 ° C, um die gefällte DNA zu sammeln.
   6. Zweimaliges Waschen des DNA-Pellets mit 70% Ethanol. Centrifuge bei 5.000 xg für 15 Minuten jedes Mal, um das Pellet zu erhalten.
   7. Aufzulösen DNA in 100-400 ul TE-Puffer bei Raumtemperatur auf einem Schüttler über Nacht. Die DNA-Ausbeute beträgt 5 bis 200 & mgr; g (Endkonzentration zwischen 50-500 ng / & mgr; l) in Abhängigkeit von der Größe der Gewebe
2. Extrahieren von DNA aus dünnen Abschnitten (10-20 & mgr; m) von formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) normalen oder malignen Gewebe.
   1. Inkubieren Paraffinschnitte in 1 ml Xylol bei Raumtemperatur zweimal für je 10 min in einem 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen zu de-Paraffin säubern. Sammle die Gewebeschnitte durch Schleudern bei 13.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Abschnitte in 1 ml 100% Ethanol zweimal bei Raumtemperatur inkubiert, 10 Minuten jedes Mal zu Xylolen Rückstände zu entfernen. Sammle die Gewebeschnitte durch Schleudern bei 13.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Das Paraffin wird vollständig an dieser Stelle aufgelöst und nur die Gewebeschnitt verbleibt.
   3. Der Luft trocknen die Teile bei Raum temperatur für 10-15 min.
   4. Machen Sie eine 0,5 mg / ml Proteinase K-Lösung mit 1x PCR-Puffer (ab 10x PCR-Puffer mit Nuklease-freies Wasser verdünnt). Füge das Proteinase-K-Lösung zu den Proben in einem Endvolumen von 50-100 ul beimpft und über Nacht bei 37 ° C.
   5. Erhitzen Sie die Proben bei 95 ° C für 10 min, um Proteinase K zu inaktivieren
      Anmerkung: In diesem Schritt wird die DNA-Probe in der PCR-Puffer gelöst und kann in den Schritten 1.2 und 1.3 direkt verwendet werden. Die DNA-Ausbeute beträgt 0,5 bis 20 & mgr; g (Endkonzentration 10-200 ng / & mgr; l) in Abhängigkeit von der Größe des Gewebes.

1.2) DNA Quality Assessment

1. Mix 0,25 ul Taq DNA Polymerase mit 45 & mgr; l der Master-Mix aus dem Handelsleiter-Kit in einem PCR-Röhrchen.
2. In 5 von 1.1.1.7 oder 1.1.2.5 hergestellten ul DNA in die PCR-Röhrchen und mischen Sie gut durch und Abpipettieren für mindestens 5-mal.
3. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen, um die DNA zu amplifizieren: 95 ° C7 min; gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 95 ° C, 45 sec bei 60 ° C und 90 sec bei 72 ° C; dann 72 ° C für 10 min und Halten bei 15 ° C.
4. Vorbereitung einer 2% igen Agarosegel in TBE (Tris / Borat / EDTA).
5. Mischungs 20 ul PCR-Reaktion mit 4 ul 6x Ladepuffer und geladen auf ein 2% iges Agarosegel.
6. Flecken auf der Agarosegel mit 0,5 ug / ml Ethidiumbromid-Lösung und detektieren PCR-Produkte mit einem Gel Vorstellen Systems. Hinweis: Die Proben, die 5 PCR-Produkte ergeben in Größen von 100, 200, 300, 400, und 600 bp wird weiterhin VDJ Amplikons zu erzeugen.
   VORSICHT: Ethidiumbromid ist ein potenter mutagen. Bitte mit äußerster Vorsicht durch das Tragen von Schutzzahnräder, dh Handschuhe, und entsorgen Sie in bestimmte Behälter pro Richtlinien Institution.

1.3) VDJ PCR

1.3.1) Amplify rekombiniert IgH VDJ-Segment von Framework-Region 1 (IgVHFR1)

1. Mix 45 ul Master-Mix aus der Tube Labeled als "Mix 2" eines kommerziellen somatische Hypermutation IGH-Assay für Gel-Nachweis-Kit, 0,25 & mgr; l Taq-DNA-Polymerase, und 5 ul von 1.1.1.7 oder 1.1.2.5 in einem PCR-Röhrchen hergestellte Probe DNA.
2. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen, um die DNA zu amplifizieren: 95 ° C für 7 min; gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 95 ° C, 45 sec bei 60 ° C und 90 sec bei 72 ° C; dann 72 ° C für 10 min und Halten bei 15 ° C.
3. Lösung der gesamten PCR-Produkts in einem 2% igen Agarosegel durch Elektrophorese.
4. Flecken auf der Agarosegel mit 0,5 ug / ml Ethidiumbromid-Lösung und detektieren PCR-Produkte mit einem Gel-Bildgebungssystem. Monoklonaler Amplifikat wird mit dem Grßenbereich von 310-380 bp zu erwarten.
5. Auszuschneiden Gelanteils mit dem monoklonalen Amplikon zwischen 310 bis 380 bp.
6. Reinigen DNA von exzidierten Gel unter Verwendung einer Standard-Gel-Extraktions-Kit nach Herstellerprotokoll. Anmerkung: Für Proben, die FR1-Fragmente erhalten werden konnte, gibt es keine Notwendigkeit, IgV reichlichHFR2 und IgVHFR3.

1.3.2) Amplify rekombiniert IgH VDJ-Segment von Framework-Region 2 (IgVHFR2)

1. Mix 45 ul Master-Mix aus der Tube als "Tube B" einer kommerziellen IGH Gene Klonalität Assay zur Gel-Nachweis-Kit, 0,25 & mgr; l Taq-DNA-Polymerase, und 5 ul Proben-DNA aus 1.1.1.7 oder 1.1.2.5 in einem PCR-Röhrchen vorbereitet markiert .
2. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen, um die DNA zu amplifizieren: 95 ° C für 7 min; gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 95 ° C, 45 sec bei 60 ° C und 90 sec bei 72 ° C; dann 72 ° C für 10 min und lassen bei 15 ° C.
3. Lösung der gesamten PCR-Produkts in einem 2% igen Agarosegel durch Elektrophorese.
4. Visualisieren PCR-Produkt (e) von 0,5 ug / ml Ethidiumbromid. Monoklonaler Amplikon kann im Größenbereich von 250-295 bp beobachtet werden.
5. Auszuschneiden Gelanteils mit dem monoklonalen Amplikon zwischen 250 bis 295 bp.
6. Reinige DNA aus ausgeschnittenen Gel mit einem Standard-Gel-ExtraktIonen Kit nach Herstellerprotokoll.

1.4) Optimize VDJ PCR

1. Mithilfe der folgenden modifizierten PCR-Bedingungen zu amplifizieren IgVHFR1 und IgVHFR2 Verwendung suboptimaler DNA: 95 ° C für 7 min, 40 Zyklen von 95 ° C für 60 sec, 60 ° C für 60 sec, und 72 ° C für 90 sec, abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min.

2. VDJ Amplicon Bibliothek Vorbereitung und Sequencing

2.1) Bibliothek Vorbereitung

2.1.1) End-Reparatur

1. Bringen VDJ PCR-Produkt aus 1.3 in ein PCR-Röhrchen und fügen Resuspensionspuffer von DNA-Probenvorbereitung Kit auf 60 ul zu bringen Sie die Lautstärke.
2. In 40 ul End Repair Mix aus DNA Probenvorbereitung Kit und gründlich mischen.
3. Inkubieren der Reaktion bei 30 ° C für 30 Minuten in einem vorgewärmten Thermocycler (30 ° C) mit einem vorgewärmten Deckel bei 100 ° C.
4. Mischen Sie 136 ul magnetische Perlen und 24 & mgr; l PCR grade Wasser zuerst in einem 1,5-ml-Röhrchen, übertragen Sie dann die gesamte End-Reparaturreaktion von 2.1.1.3 in die 1,5-ml-Röhrchen und mischen Sie gut mit dem Perlen-Lösung.
5. Die Röhrchen auf einem magnetischen Ständer für 2 min, um die Trennung der Beads von der Lösung zu ermöglichen. Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Perlen mit 80% frisch zubereiteten EtOH zweimal, während das Rohr auf dem Magnetständer.
6. Saugen Sie das Ethanol-Lösung vollständig und ermöglichen die Perlen an der Luft trocknen für 15 Minuten bei Raumtemperatur für 15 min.
7. Nehmen Rohr von den Magnetstativ und resuspendieren Perlen in 17,5 ul Resuspensionspuffer.
8. Die Röhrchen wieder auf die magnetische Halterung für 2 min zu trennen Perlen aus der Resuspensionspuffer. Entfernen Sie die Resuspensionspuffer (End-Repair-Produkt ist nun in der Resuspension Puffer) in ein sauberes PCR-Röhrchen.

2.1.2) A-Tailing

1. In 12,5 ul A-Tailing-Mix in den PCR-Röhrchen, das End-Repair-Produkt und gründlich mischen.
2. Inkubieren des PCR-Röhrchen bei 37 ° C für 30 Minuten in einem vorgewärmten Thermocycler (37 ° C) mit einem vorgewärmt Deckel bei 100 ° C.

2.1.3) Adaptor-Ligation

1. In 2,5 ul Resuspensionspuffer, 2,5 ul Ligationsmischung und 2,5 ul DNA-Adaptor-Index in die A-Tailing-Reaktion.
2. Inkubieren der Reaktion bei 30 ° C für 30 MINL in einem vorgewärmten Thermocycler (30 ° C) mit einem vorgewärmten Deckel bei 100 ° C.
3. In 5 ul Stop-Ligationspuffer in jede Reaktions und gründlich mischen.
4. Mix 42,5 ul gut gemischten magnetischen Kügelchen, um die Reaktion folgende Schritte 2.1.1.5 bis 2.1.1.8 zu reinigen. In 50 ul Resuspensionspuffer, um den Adapter-ligierte Produkt zu eluieren.
5. Reinigen Sie den Adapter-ligierte Produkt ein zweites Mal unter Verwendung von 50 & mgr; gut gemischten AMPure XP Perlen und eluieren das Produkt in 25 ul Resuspensionspuffer in ein sauberes PCR-Röhrchen.

2.1.4) Amplify DNA-Fragmenten

1. In 5 ul PCR Primer Cocktail und 25 & mgr; l PCR-Master-Mix auf die PCR-Röhrchen, das Adapter-ligierte Produkt und gründlich mischen.
2. Die Amplifikation in einer vorprogrammierten Thermocycler unter den folgenden Bedingungen: 98 ° C für 30 sec; 10 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 30 sec; dann 72 ° C für 5 min Halten bei 10 ° C.
3. Bereinigen Sie die Reaktion unter Verwendung von 50 & mgr; l gut gemischte magnetische Kügelchen, und eluieren das Endprodukt in 30 ul Resuspensionspuffer.

2.1.5) Bibliothek Validation

1. Quantifizierung des Endproduktes mit einem Fluorometer unter Verwendung der Herstellerprotokoll. Endgültige Bibliothek-Konzentration zwischen 2,5 bis 20 ng / & mgr; l.
2. Beurteilung der Qualität des Endproduktes mit Hilfe eines Analyseinstrument mit hoher Empfindlichkeit DNS-Chips nach dem Protokoll des Herstellers. Erwarten Sie eine einzelne Bande mit der erwarteten Größe für entweder IGVHFR1, IGVHFR2 oder IGVHFR3. DichRWARTETE Größe der Bibliothek Produkt entspricht der Größe des ursprünglichen VDJ Amplikon sowie die Größe der Adapter (~ 125 bp).

2.2) VDJ-PCR-Bibliothek Pooling und Sequenzierung

1. Berechnung der Molarität jeder Bankfraktion mit der folgenden Formel: NM = [(ng / 1.000) / bp * 660] x ¹⁰ 9 ng wo die Konzentration des VDJ-PCR-Bibliothek in Schritt 2.1.5.1 gemessen und bp ist der Spitzen Größe des VDJ-PCR-Bibliothek in Schritt 2.1.5.2 gemessen.
2. Verdünnen Sie die Bibliothek bis 2 nm (10 ul insgesamt) mit DNase-freiem Wasser.
3. Kombinieren Sie die 10 ul der verdünnten 2 nM Bibliotheken zusammen in ein 1,5-ml-Tube.
4. Hinzufügen eines gleichen Volumens PhiX Spike-Kontrolle in die 1,5-ml-Tube.
5. Laden Sie den Pool am 07.00 Konzentration auf eine Durchflusszelle.
6. Sequenz, die die Bibliotheken mit einem Paired-End 150 Zyklussequenzer nach Herstellerprotokoll.

3. Datenanalyse

Hinweis: Ein summary der Bioinformatik-Skripte in diesem Abschnitt verwendet, kann als Ergänzungs-Code-Datei.

3.1) Ausrichtung und QC

1. Karte Paired-End-Sequenzierung liest gegen einen menschlichen IGH V, D und J-Region-Datenbank aus der IMGT Website ¹¹ mit einer angepassten Nukleotid-BLAST-Algorithmus, basierend auf 'blastn' von NCBI mit gap open penalty 2, gap extension penalty von 1 heruntergeladen, Wortlänge von 7 und E-Wert, der sich ^von 10 -4. Entsorgen Sie die Lese-Paar nicht, um sowohl eine IGH V und J-Region zuzuordnen.
2. Zählen der verbleibenden Lesepaare, IGH V- und J-Zuordnungen müssen die Frequenzen der pass VJ Kombinationen für alle Lesepaare von der Sequenzierungslauf auf der Probe erhalten wird. Graf eine Lesepaar, wenn es sich sowohl auf eine IGH V und J-Gen kartiert, und fügen Sie ihre Allel an die entsprechende Zählung für die besondere VJ Kombination.
3. Rang der Zählungen für jede neu kombiniert VDJ-Region von 3.1.2 von der Hoch erhaltenest zur niedrigsten. Die Region verfügt über die höchste VDJ liest Zählung wird als Haupt Umlagerung Kombination definiert.
4. Entsorgen Sie ausgerichteten Sequenzen, die weniger als 35% des Gebietes Haupt Umlagerung in 3.1.3 fest decken.

3.2) SHM Profil Identification

1. Zählen Sie alle SHM Muster über das liest aus Schritt 3.1.3. Definieren Sie die SHM Muster als Subklon.
2. Zählen die Anzahl von den Subklonen, die verschiedene einzigartige SHM Mustern entsprechen, und die Anzahl von Lesevorgängen, die auf einzelne Subklone abgebildet werden.

3.3) Grafische Darstellung der Ergebnisse

1. Führen die phylogenetische Analyse der Subklone mit ihren entsprechenden SHM-Muster unter Verwendung einer Nachbarschaftsverbindungsverfahren von R-Paket "Affe" entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Berechnen einer Distanzmatrix von den einzelnen unterschiedlichen Ausrichtungen, um den Subklon phylogeny zur Keimbahnsequenz der V verwurzelt neuJ Kombination in Frage für jeden gepaarten Probensatz.
2. Verwenden der Nukleotidsequenz von jedem Subklon als Zeichenvektors und Berechnen der ungefähren Saitenabstand zwischen allen Subklone in der Haupt VJ Umlagerung zur Diagnose und entsprechende Rückfall Proben unter Verwendung eines Levenshtein Abstandsmaß wo mathematisch der Abstand zwischen zwei Ausrichtungen durch d _{x, y} gegeben (i, j), wobei d _{x, y} (i, j) = 1, wenn i ≠ j und 0 sonst, und summieren diese Funktion über die Länge der Zeichenfolge entspricht, Sequenzen, i und j Nukleotids.
3. Graphisch die resultierende Matrix der Subklon Abstände und ihre entsprechenden Subklon Zählungen in den zwei folgenden Arten:
   1. Verwenden Sie R-Paket "Masse" nach Herstellerprotokoll zur multidimensionalen Skalierung auf den Subklon Distanzmatrix anzuwenden und erzeugen eine zweidimensionale Prinzip koordiniert Karte, die dann aufgetragen wird zusammen mit dem Logarithmusder subclonal zählt wie der Radius des Kreises.
   2. Konstruieren Sie einen ungerichteten Graphen basierend auf der Levenshtein-Distanz, wo die Scheitelpunkte entsprechen den jeweiligen unterschiedlichen Subklon, die aus der großen VJ Umlagerung.
      Hinweis: Wenn der Abstand zwischen zwei anderen Klone gleich eins ist, dann gibt es eine Kante zwischen diesen beiden Eckpunkten. Wenn die Entfernung größer als eins ist, dann gibt es keinen Rand verbindet.
   3. Zur graphischen Bestimmungen 3.3.3.2 mit der tkplot Funktion in der "IGRAPH" R-Paket mit dem Kamada Kawai-Layout nach dem Protokoll des Herstellers. Der Radius der Ecken ist proportional der dritte Wurzel der Gesamtzahl an Klonen, es abgebildet und die Schattierung verwendet einen roten und blauen Bereich, um den Anteil von Klonen, gehören entweder zur Diagnose (blau) oder Rückfall (rot) Proben bezeichnen .

3.4) Heterogenität (Entropie) Messung

1. Untersuchen Sie die Zahlen und Subklon Grafen von derEinzelmuster somatische Hypermutation in der Haupt VJ Umlagerung für jede vorkommende gepaarten Proben gesetzt.
2. Berechnen die empirische Entropie und Rest empirische Entropie für die Anzahl der unterschiedlichen Klone in jeder Probe unter Verwendung des Standard-Histogramms auf Basis Entropieschätzung eingestellt.

Ergebnisse

Das Gesamtverfahren der VDJ-Sequenzierung (VDJ-seq), einschließlich DNA-Extraktion, rekombiniert VDJ-Region Amplifikation und Reinigung, Sequenzierung Bibliothekskonstruktion liest Verarbeitung und phylogenetische Analyse, ist in Abbildung 1 dargestellt. Routinemßig 5-200 ug DNA kann aus abgerufen werden gefroren oder Gewebeschnitten von 0,5 bis 20 & mgr; g DNA aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten. Abhängig von der Qualität, Umlagerung Muster und ...

Diskussion

Aufgrund der nahezu unbegrenzten Anzahl von Iterationen der Sequenzinformation von VDJ Umlagerung und SHM am IGH-Locus der humanen B-Zellen kodiert, Untersuchung des gesamten IGH Repertoire von Hochdurchsatz-deep-Sequenzierung erwies sich als eine effiziente und umfassende Weise zu umreißen klonalen sein und Sub-klonale B-Zellpopulationen. Darüber hinaus kann diese Strategie verwendet, um die klonale Entwicklungspfad von B-Zell-Tumor-Entwicklung, Remission, und Rückfall durch Vergleich der klonalen und Unter klonalen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	89125-170	200 proof, for molecular biology
TE buffer	Life Technologies	12090-015	10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
Xylenes	VWR	EM-XX0055-6	500 ml
Proteinase K	Life Technonogies	25530-015	100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix	Promega	U1515	10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer	Roche	11699105001	Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2	Life Technonogies	4311806	50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder	Invivoscribe Technologies	2-096-0020	33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	5-101-0030	33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	1-101-0020	33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8291	20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer	Corning (cellgro)	46-011-CM	6x1 L
50x TAE BUFFER	VWR	101414-298	1 L
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich	E1510	10 mg/ml
25 bp DNA Ladder	Life Technologies	10597011	1 µg/µl
100 bp DNA Ladder	Life Technologies	15628-019	1 µg/µl
UltraPure Agarose	Life Technologies	16500-500	500 g
40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad Laboratories	1610144	500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	50 columns
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Life Technologies	Q32854
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
MiSeq	Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Magnetic stand	Life Technologies	4457858
Gel imaging system	Bio-Rad Laboratories	170-8370