دراسة المجتمعات الميكروبية<em&gt; في فيفو</em&gt;: نموذج من التفاعل بوساطة بين المضيف<em&gt; المبيضات البيض</em&gt; و<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في الخطوط الجوية

Summary

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Abstract

دراسة التفاعل المضيف الممرض تمكننا من فهم الآليات الكامنة وراء المرضية خلال العدوى الميكروبية. التكهن المضيف يعتمد على ضلوع الاستجابة المناعية تكييفها ضد الممرض ^1. استجابة مناعية معقدة وينتج عن التفاعل بين مسببات الأمراض وعدة أنواع الخلوية المناعية أو غير محصنة ^2. وفي الدراسات المختبرية لا يمكن تميز هذه التفاعلات والتركيز على التفاعلات خلية الممرض. وعلاوة على ذلك، في مجرى الهواء ^3، وخاصة في المرضى الذين يعانون من مرض الرئة المزمن القيحي أو في المرضى الذين يعانون التهوية الميكانيكية، هي المجتمعات متعدد المكروبات الحالية وتعقد التفاعل المضيف الممرض. الزائفة الزنجارية والمبيضات البيض على حد سواء مشكلة مسببات ^4، في كثير من الأحيان معزولة من العينات الرغامية القصبية، و المرتبطة التهابات شديدة، وخاصة في وحدة العناية المركزة ^5. التفاعلات الميكروبية لهاتم الإبلاغ بين هذه الجراثيم في المختبر ولكن التأثير الطبي لهذه التفاعلات لا يزال غير واضح ^6. لدراسة التفاعلات بين C. البيض وP. الزنجارية، وهذا نموذج الفئران من C. البيض الهوائية الاستعمار، تليها P. تم تنفيذ التهاب في الرئتين الحاد بوساطة aeruginosa-.

Introduction

النماذج الحيوانية، وخاصة الفئران، وقد استخدمت على نطاق واسع لاستكشاف الاستجابات المناعية ضد المسببات المرضية. على الرغم من الحصانة الفطرية والمكتسبة تختلف بين القوارض والبشر ^7، وسهولة في تربية وتنمية بالضربة القاضية للعديد من الجينات، وجعل الفئران نموذجا ممتازا لدراسة الاستجابات المناعية ^8. الاستجابة المناعية معقدة والنتائج من التفاعل بين العوامل المسببة للأمراض، والفلورا الميكروبية والعديد من المناعة (الخلايا الليمفاوية، العدلات، الضامة) وغير المناعية (الخلايا الظهارية، وخلايا بطانة الأوعية الدموية) أنواع الخلوية ^2. وفي الدراسات المختبرية لا تسمح مراقبة هذه التفاعلات المعقدة وتركز أساسا على فريدة التفاعلات الخلية من مسببات الأمراض. في حين أن النماذج الحيوانية يجب أن تستخدم بحذر وتقتصر على أسئلة محددة للغاية وذات الصلة، ونماذج الماوس توفر نظرة ثاقبة إلى الاستجابة الثدييات المناعة في الجسم الحي، وقد تتناول أجزاء من الأسئلة السريرية المهمة ^7.

"jove_content"> في الشعب الهوائية، والمجتمع الميكروبي معقد ربط عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة المختلفة ^6. في حين أن ما يشكل "العادي" microbiome الهوائية لا يزال يتعين تحديدها والمجتمعات المقيمة هي متعدد المكروبات في كثير من الأحيان، وتأتي من مصادر بيئية متنوعة. المرضى الذين يعانون من القيحي أمراض الرئة المزمنة (التليف الكيسي، bronchectasis) أو المرضى التهوية الميكانيكية تظهر على النباتات معينة بسبب الاستعمار في الشعب الهوائية بواسطة الكائنات الحية الدقيقة المكتسبة بيئيا ^9. الزائفة الزنجارية والمبيضات البيض على حد سواء مشكلة مسببات الأمراض ^5، في كثير من الأحيان معزولة معا من العينات الرغامية القصبية ، ومسؤولة من العدوى الانتهازية شديد في هؤلاء المرضى، وخاصة في وحدة العناية المركزة (ICU) ^4.

عزل هذه الكائنات الدقيقة أثناء الالتهاب الرئوي الحاد في نتائج ICU في العلاج المضاد للميكروبات ضد P. الزنجارية بوفي العادة لا تعتبر التحرير الخميرة الممرضة في هذا الموقع ^5. في المختبر التفاعلات بين P. الزنجارية وC. تم الإبلاغ على نطاق واسع البيض وأظهرت أن هذه الكائنات الدقيقة يمكن أن تؤثر على نمو وبقاء بعضها البعض ولكن الدراسات لا يمكن أن يستنتج إذا وجود C. البيض هو ضار أو مفيد للمضيف ^(10). وقد وضعت نماذج الماوس للتصدي لهذا أهمية P. الزنجارية وC. وكان البيض في الجسم الحي، ولكن التفاعل بين الكائنات الحية الدقيقة يست النقطة الرئيسية. في الواقع، تم إنشاء نموذج لتقييم مشاركة C. البيض في الاستجابة المناعية، والنتيجة.

A النموذج السابق الذي أنشأه رو وآخرون تستخدم بالفعل الاستعمار الأولي مع C. يتبع البيض من قبل التهاب في الرئتين الحاد الناجم عن P. الزنجارية. عن طريق نموذجهم، وجد الباحثون دورا الضار لصrior C. البيض الاستعمار ^11. ومع ذلك تستخدم رو وآخرون حمولة عالية من C. البيض في نموذجهم مع 2 × 10 ⁶ خلية / الماوس خلال 3 أيام متتالية. أنشأنا نموذجا 4 أيام من C. الاستعمار الهوائية البيض، أو على الأقل استمرار دون وقوع إصابات الرئة، وفي هذا النموذج C. تم استرداد البيض تصل إلى 4 أيام بعد تقطير واحد ^من 10 5 كفو في الماوس (الشكل 2B) ^12،13. بعد 4 أيام، لم يكن هناك أي دليل على تجنيد خلية التهابات، وإنتاج السيتوكينات الالتهابية ولا ضرر الظهارية. في 24 - 48 ساعة، في وجود ذروة C. البيض، على الرغم من ولوحظ استجابة المناعية الفطرية الخلوية وخلوى، لم يكن هناك دليل على إصابة الرئة. والمثير للدهشة، وبالتالي الفئران مع المستعمر، C. البيض 48 ساعة قبل الأنف تقطير من P. قد الزنجارية الموهن العدوى مقارنة مع الفئران مع P. العدوى الزنجارية وحدها. أناndeed، أظهرت الفئران أقل إصابة الرئة وانخفاض عبء البكتيرية ^12،13.

عدة فرضيات يمكن أن يفسر هذا التأثير المفيد للاستعمار مسبق مع C. البيض على P. الزنجارية بوساطة التهاب في الرئتين الحاد. أولا، وهو عبر الحديث بين الأنواع التي تشمل كل الكائنات الحية الدقيقة أنظمة نصاب الاستشعار، وP. القائم على homoserinelactone نظام الزنجارية وC. القائم على فارنيسول نظام البيض، تم تقييمها. ثانيا، C. وقد درس البيض بوصفها هدفا "شرك" لP. الزنجارية تحويل الممرض من الخلايا الظهارية الرئة. تم إبطال كل من الفرضيات (بيانات غير منشورة). كانت الفرضية الثالثة التي ل"فتيلة" للنظام المناعة الفطرية التي كتبها C. البيض مسؤولة عن تعزيز استجابة فطرية لاحقة ضد P. الزنجارية. وقد أكد هذه الفرضية الأخيرة. في الواقع C. أدى البيض الاستعمار إلى فتيلة الحصانة الفطرية throuغ IL-22، يفرز أساسا من الخلايا اللمفاوية الفطرية، مما أدى إلى زيادة إزالة بكتيريا وخفض إصابة الرئة ^12.

في الختام، المضيف هو الفاعل المركزي في التفاعل بين الكائنات الحية الدقيقة تحوير الاستجابة المناعية الفطرية والتي تشمل أنواع مختلفة من الخلايا الالتهابية. في حين أن هذه التفاعلات المناعية المعقدة يمكن تشريح في المختبر الفرضيات الأولية لا يمكن إلا أن تقدمها مناسبة في النماذج الحية. وينص البروتوكول التالية مثال على الدراسة المجراة من بوساطة المضيف تفاعل العوامل المسببة للأمراض التي يمكن تكييفها لالكائنات الحية الدقيقة الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد وافقت اللجنة الإقليمية الأخلاق الإقليمية لالتجارب على الحيوانات هذا الأسلوب، وفقا لرعاية الحيوان الوطنية والدولية واستخدامها في المبادئ التوجيهية للبحوث الفحص.

مجموعة 1. عينة

1. تخزين عينة
   1. جمع كل العينات وعلى الفور تخزين في - 20 ° C أو على الجليد حتى التخزين المجمد لتجنب تدهور. ضع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) على الجليد لتحسين lavages-القصبية السنخية (BAL) الأداء.
2. العملية الجراحية
   1. تعقيم جميع المعدات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف.
      ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن استخدام مجموعتين مختلفتين من أدوات لخطوات البطن والصدر لتجنب التلوث المتبادل. وترد تفاصيل المعدات تشريح المطلوبة في الشكل 4A

2. الفئران، البكتيرية والخميرة سلالات

1. الفئران منزل في الامتثال مع استخدام المحلي الحيوانات في إعادةالمبادئ التوجيهية لجنة البحث في رفوف التهوية دون تجاوز 5 الفئران في قفص، مع الطعام وعفوي المياه، في منشأة سكنية مستوى السلامة الحيوية 2 بسبب استخدام مستوى السلامة الحيوية 2 الكائنات الحية الدقيقة: P. الزنجارية وC. البيض.
2. الحفاظ على السلالات البكتيرية في -80 ° C في 40٪ الجلسرين المتوسطة.
   1. إضافة البكتيريا مباشرة من الأسهم المجمدة في أنبوب الثقافة التي تحتوي على 3 مل من معقم لوريا، Bertani مرق باستخدام 10 ميكرولتر التلقيح الحلقة. ترك O / N عند 37 درجة مئوية مع الهز المداري (400 دورة في الدقيقة) قبل يوم واحد تقطير.
   2. البكتيريا الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
   3. نضح طاف إلى التخلص مغلقة المناسب نفايات بيولوجية. مراقبة بيليه ملتصقة الأبيض في الجزء السفلي من أنبوب الثقافة.
   4. غسل وتعليق بيليه باستخدام 5 مل من برنامج تلفزيوني.
   5. كرر الخطوات من 2.2.2 إلى 2.2.3 للمرة الثانية لإجراء غسيل الثاني.
   6. Resuspend والبكتيريا مكعبات باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيونيوvortexing لوجيزة.
   7. تحديد كثافة اللقاح باستخدام مقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر باستخدام مقياس الكثافة الضوئية. A كثافة 0.9 يناظر 10 ⁹ CFU / مل لPAO1، وتمييع وفقا لذلك.
      ملاحظة: هذه النتيجة لابد من الحصول عليها لكل سلالة يستخدمها تحديد كثافة التخفيفات المتعاقبة لقيحة معايرة.
   8. التحقق من اللقاح عن طريق التخفيفات لوغاريتمي التسلسلية وطبق 100 ميكرولتر من كل تخفيف على bromocresol أجار الأرجواني (BCP) لوحات وO / N الثقافة. إدارة كل فأر الأنف 50 ميكرولتر من محلول يحتوي على 1 × ^8-2 أكتوبر X10 ⁸ كفو لكل مل (5 × ^06-01 أكتوبر X10 ⁷ CFU في الماوس).
3. استخدام C. البيض SC5314 كما سلالة المرجعية. الحفاظ على السلالة في 40٪ الجلسرين المتوسطة في -80 ° C.
   1. تكملة-الخميرة ببتون-سكر العنب مرق مع 0.015٪ الأميكاسين لتجنب التلوث الجرثومي وتيسير مواصلة العد.
   2. إضافة الخميرة باستخدام 10 &# 181؛ ل التلقيح حلقة في إعداد YPD-مرق تستكمل مع الأميكاسين O / N عند 37 درجة مئوية.
   3. الخميرة الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
   4. إزالة طاف إلى التخلص من النفايات bioharzard المناسب. ينبغي مراعاتها بيليه ملتصقة الأبيض في الجزء السفلي من أنبوب الثقافة.
   5. غسل ووقف البكتيريا مكعبات باستخدام 5 مل من برنامج تلفزيوني وvortexing لوجيزة.
   6. كرر الخطوات من 2.2.2 إلى 2.2.3 للمرة الثانية لإجراء غسيل الثاني.
   7. resuspend الكرية باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني وvortexing لوجيزة.
   8. تحديد حجم اللقاح عن طريق يعول على الكريات Mallassez باستخدام مجهر القياسي في التكبير 40X.
      ملاحظة: التركيز (في كفو / مل) والحصول عليها باستخدام الصيغة التالية: (عدد من الخميرة × 10 ^{5) /} (عدد المستطيلات شبكة يعول على الكريات Mallassez).
   9. التحقق من قبل التسلسلي تخفيف وغاريتمي إلى 10 ^-5 و 10 ^-6 لتأكيد يحتوي هذا الحل 2 × 10 ⁶ كفو / مل.
   10. لوحة على لوحات YPD أجار تستكمل مع 0.015٪ الأميكاسين.

3. الخطوط الجوية الاستعمار التي كتبها C. البيض

ملاحظة: بعد التكيف البيئي، يتم وزن الفئران مرتين في اليوم.

1. تحت غطاء الدخان، إيداع 500 ميكرولتر من سيفوفلوران على 4 سم × 4 سم الشاش (تقنية مفتوحة انخفاض) ^14.
   1. المكان على الفور الشاش على الأرض من الغرفة حوالي 750 مل الاستقراء. المكان على الفور منصة التي أثيرت شبكة فوق الشاش لتجنب الاتصال المباشر بين الحيوان والشاش.
   2. إغلاق غطاء محكم والانتظار 1-2 دقائق للسماح للنشر سيفوفلوران في الغرفة.
   3. نقل الماوس من القفص لشبكة منصة وغطاء وثيق. وينبغي أن يتحقق التخدير الخفيف مع الحفاظ التنفس التلقائي في 30-45 ثانية.
   4. رصد لنقص التوتر من خلال مراقبة فقدان المنعكس التقويمي وعند هذه النقطة الماوس يمكن إزالتها وROM مربع وتغرس.
2. تقطير داخل الأنف (يمكن أن يؤديها في 10 ثانية من قبل مشغل المدربين).
   1. عقد الماوس بيد واحدة تقع على ظهرها مرفوعة (الشكل 4B).
   2. باستخدام السبابة، ودعم الرأس واستخدام الإبهام للحفاظ على الفك مغلقة لتجنب نخامة (الشكل 4C).
   3. كما هو موضح في الخطوة 2.3.8، تأكد من أن استعداد C. حل البيض يحتوي على 2 X10 ⁶ كفو لكل مل ل50 ميكرولتر تغرس الحجم.
      ملاحظة: النقطة الحاسمة الثانية هي حجم تبث الشعور. وحدة تخزين أقل من 50 ميكرولتر يمكن أن يؤدي إلى الاستعمار كافية أو تقطير غير متجانس من مجرى الهواء، وهو أكبر حجم يمكن أن تسبب الغرق / الاختناق والموت.
   4. غرس الماوس داخل أنفيا التي تقترب من ماصة إلى الخياشيم.
   5. ماصة انخفاضا بنسبة 50 ميكرولتر تشكيل فقاعة تحتوي على الحل على الخياشيم، استنشاقه في وقت لاحق من قبل spontaneouslذ التنفس الماوس.
   6. مكان الماوس في منطقة الانتعاش (على سبيل المثال، قفص عارية كبير الغازية بشكل جيد مع مصباح التدفئة النفقات العامة). يجب مراقبة الفئران حتى الصحوة كاملة. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية والمنعكس التقويمي. في هذه المرحلة، ويمكن إرجاع الماوس لقفص السكن العادي.

4. P. الزنجارية يسببها العدوى الحادة الرئة

يتم وزن الفئران خلال الأيام الأربعة التالية: ملاحظة. عادة، الفئران اكتساب الوزن خلال C. الاستعمار الهوائية البيض بوساطة (الشكل 2A).

1. إعداد تعليق يحتوي P. الزنجارية اليوم من تقطير بعد O / N النمو (القسم 2.2).
2. تخدير لفترة وجيزة باستخدام استنشاق سيفوفلوران كما هو موضح أعلاه (القسم 3.1).
   ملاحظة: لإجراء إصابة الرئة الحادة، وأوصى عبء البكتيرية واقترح فيالجدول 1.
3. غرس الماوس كما هو موضح أعلاه (القسم 3.2) مع إيلاء اهتمام خاص إلى الانتعاش بعد تقطير.

5. قياس مؤشر إصابة الرئة

1. تحضير محلول يحتوي على الألبومين FITC المسمى. حقن هذا الحل 2 ساعة قبل القتل الرحيم للحيوانات.
   1. تزن 0.2 ملغ من الألبومين FITC مع المعدات المناسبة.
   2. إضافة 0.2 ملغ في 1 مل PBS. لفترة وجيزة الدوامة. إذا لم يتم استخدامها فورا، ووضع الحل في احباط لتجنب التعرض للضوء المحيط.
   3. حقن داخل peritoneally 200 ميكرولتر من FITC المسمى حل الألبومين إلى كل فأر.
2. قتل رحيم
   1. وزن الفئران للبيانات الوزن الماضي.
   2. الموت ببطء ماوس واحدة وفقا للاستخدام المحلي الحيوانات في المبادئ التوجيهية لجنة البحوث باستخدام أحد الحقن داخل الصفاق من جرعة زائدة قاتلة من بنتوباربيتال: 300 ميكرولتر من 5.47٪ بنتوباربيتال.
   3. إزالة الماوس من القفص ويتلقى لحقن إيثال من قبل المشغل.
   4. بعد الحقن، نقل الماوس وحدها إلى قفص آخر، كانت مخبأة من أي حيوانات أخرى. مراقبة الماوس حتى غياب الحركة. تأكيد الوفاة التي كتبها غياب حركة، حركة التنفس بشكل خاص، عدم وجود النبض.
   5. أداء جمع العينات الجراحية على الحيوانات الميتة، وبالتالي دون التخدير ولا المسكنات.
3. الجراحية جمع العينات: المرحلة الصدر.
   ملاحظة: للحفاظ على ظروف معقمة، يتم تنفيذ كل عملية جراحية باستخدام معدات معقمة في بيئة مستوى السلامة الحيوية 2.
   1. تطبيق الإيثانول على الجلد. إجراء شق الجلد خط الوسط من القص إلى منتصف البطن مع مقص. من شق خط الوسط على طول القفص الصدري على أي من الجانبين. طي الظهر الجلد على جانبي القفص الصدري لتصور القفص الصدري.
   2. إجراء شق عمودي من القفص الصدري على جانبي الصعود نحو الترقوة من أجل أن تكون قادرة على اتكأ كامل جدار الصدر الأمامي مع المؤخرةأم السماح التصور المثالي من القلب والرئتين (الشكل 5A، 5B).
   3. جمع الدم باستخدام حقنة قبل heparined التي كتبها ثقب القلب بجانب الشريان البطينين. سحب ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من الحصول على ما لا يقل عن 100 ميكرولتر من البلازما. ضع عينة من الدم على الجليد.
   4. إجراء شق عنق الرحم خط الوسط لتصور القصبة الهوائية (الشكل 5B و5C). تشريح بعناية لفافة حول القصبة الهوائية. وضع خياطة وراء القصبة الهوائية (الشكل 5C و5D). وفي وقت لاحق سيتم إغلاق خياطة حول الإبرة cannulating لضمان غسيل مناسب.
   5. يقثطر القصبة الهوائية باستخدام 20-G تعديل إبرة التغذية الأنبوبية (الشكل 5D و4A). ربط عقدة الجراحية حول القصبة الهوائية مقنى مع خياطة وضعت سابقا.
   6. لأداء lavages القصبات (BAL)، برفق وتدريجيا حقن ورسم 500 ميكرولتر من PBS الجليد الباردة إلى / من الرئة. ضع العينة على طم لتجنب تحلل الخلوية.
   7. كرر الخطوة 5.3.6، و 3 مرات للحصول على ما مجموعه 1500 ميكرولتر BAL السائل وحوض غسيل عينات إلى 2 مل أنبوب الطرد المركزي (الشكل 5E).
   8. إزالة الرئتين من الصدر. ضع شريحة الرئة (حجم يجب أن تتوافق مع نصف رئة واحدة أو الفص) إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي وتخزينها بسرعة في - 80 ° C.
   9. ضع شريحة الرئة في أنبوب انحلال الدم وزنه قبل تحتوي على برنامج تلفزيوني لتحديد عبء البكتيرية ووضعه على الجليد.
4. الجراحية جمع العينات: المرحلة البطن.
   1. أداء شق آخر على الجانب الأيسر من البطن. مراقبة الطحال من خلال الغشاء البريتوني.
   2. إزالة الطحال ووضعها في أنبوب انحلال الدم الثاني يحتوي على 1 مل PBS ومكان على الجليد.
5. مؤشر إصابة الرئة
   ملاحظة: يتم تقييم السنخية-الشعرية نفاذية الغشاء عن طريق قياس FITC المسمى الألبومين تسرب من المقصورة الوعائية إلى السنخية-إينتيرستمقصورة itial.
   1. عينة من الدم الطرد المركزي والسوائل BAL لمدة 10 دقيقة في 1500 ز س. جمع supernatants في أنابيب الطرد المركزي الجديدة. الكريات تتوافق مع البلازما أو BAL خلايا تجنيد ويجب أن توضع على الجليد.
   2. إضافة 100 ميكرولتر من كل طاف الدم (البلازما، أصفر) أو BAL طاف لوحة 96-جيدا شفافة (300 بئر ميكرولتر). وضع رقائق على لوحة اذا لم تستخدم على الفور.
   3. قياس مستويات مضان في البلازما وsupernatants بال باستخدام قارئ مضان صفيحة ميكروسكوبية (الإثارة، 487 نانومتر؛ الانبعاثات، 520 نانومتر).
   4. تحديد مؤشر إصابة الرئة عن طريق حساب نسبة مضان [(BAL طاف طاف / الدم) × 100].
6. الشعبى غسيل (BAL) عدد خلايا التفاضلية.
   ملاحظة: استخدم بيليه الخلية التي تم الحصول عليها من الطرد المركزي من السوائل BAL في خطوة 5.5.1.
   1. إذا لزم الأمر، استخدام الخلايا الحمراء تحلل العازلة. إضافة 500 ميكرولتر من الخلايا الحمراء تحلل العازلة في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على سلل بيليه. دوامة لفترة وجيزة وتترك مدة 10 دقيقة على الجليد. إضافة 500 ميكرولتر PBS لوقف تحلل الخلايا الحمراء.
   2. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1500 ز س. إزالة طاف ووقف بيليه خلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. تعداد الخلايا على الكريات Mallassez. باستخدام عدادة الكريات إلى عدد الخلايا. تركيز الخلايا على شريحة مع cytospin.
   3. خلايا وصمة عار باستخدام عدة تلوين السماح تحديد الخلية وعدد (الضامة، الخلايا الليمفاوية، العدلات).
7. الرئة عبء البكتيرية ونشر البكتيرية
   ملاحظة: لتقييم الرئة عبء البكتيرية ونشر البكتيرية والرئتين والطحال تم جمعها على التوالي وتخزينها في أنابيب انحلال الدم وزنه قبل يحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني (الخطوة 5.3.9).
   1. تزن أنابيب انحلال الدم التي تحتوي على 1 مل PBS وإما الرئة أو الطحال. تجانس العينات مع الخالط الأنسجة للحصول على الخليط الرئة والطحال الخليط.
   2. إيداع 100 ميكرولتر من وطي الأنسجةgenates في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة للحصول على التخفيفات لوغاريتمي التسلسلية.
   3. لوحة اثنين من مشاركة عينات المخفف المناسب (10 ^-3 و 10 ^-2) على أي BCP أجار لP. الزنجارية أو أجار YPD-الأميكاسين تستكمل لC. البيض الرئة وتحديد عبء الطحال.
   4. احتضان لوحات O / N عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، تعداد المستعمرات على لوحات.
   5. مؤشر النتيجة لوزن الرئة للحصول على كفو في كل غرام من الرئة. أحجام العينات الرئة ليست هي نفسها، ينبغي التعبير عن النتائج في كفو في كل غرام من الرئة.
      صيغة للمؤشر هي: [كفو] س [وزن أنبوب انحلال الدم والرئة] - [وزن أنبوب انحلال الدم].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كما رأينا سابقا خلال وصف البروتوكول، تحتاج التجربة 5 أيام لاستكمال (الشكل 1: الجدول الزمني التجربة). والتمست مشغل واحد خلال الفترة السابقة كاملة من التجربة ويمكن التعامل مع العمليات تصل إلى حد أقصى قدره 10 الفئران. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من الحيوانات، و?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

النماذج الحيوانية، وخاصة الثدييات، هي مفيدة لتوضيح الآليات المعقدة للتفاعل المضيف الممرض في مجالات الحصانة. بطبيعة الحال، فإن الحاجة إلى المعلومات التي يمكن الحصول عليها فقط من النماذج الحيوانية يجب أن تكون ضرورية. خلاف ذلك، لا بد من استبدال استخدام الحيوانات عن ط?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevorane, Sevoflurane	Abott	05458-02	250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940	Berthold Technologies	reference in first column	no comment
Bromo-cresol purple agar	Biomerieux	43021	20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47%	CEVA	6742145	100 ml plastic bottle
2-headed valve	Distrimed	92831	no comment
Sterile inoculation loop 10 µl	Dutscher	10175	x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml	Dutscher	30003	per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml	Dutscher	64300	no comment
Ultrospec 10	General Electric life sciences	80-2116-30	no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Life technologies	10010023	packaged in 500 ml
amikacin 1 g	Mylan	62516778	per 10
Heparin 10,000 UI in 2 ml	Pan pharma	9128701	10x per unit
RAL 555 coloration kit	RAL Diagnostics	361550	3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube	Sarstedt	55.526.006	x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate	Sarstedt	82 1581500	no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth	Sigma	95763	in powder
FITC-albumin	Sigma	A9771	in powder
Luria Bertani Broth	Sigma	L3022	in powder
25-gauge needle	Terumo or unisharp	A231	x 100 conditioning
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	no comment