לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Summary

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Abstract

לימוד אינטראקציה מארח הפתוגן מאפשר לנו להבין את המנגנון הבסיסי של פתוגניות במהלך זיהום חיידקים. הפרוגנוזה של המארח תלוי במעורבות של תגובה חיסונית מותאמת נגד הפתוגן ^1. תגובה חיסונית היא מורכבת ותוצאות מהאינטראקציה של פתוגנים וכמה סוגים חיסוניים תאיים או אי-חיסון ^2. מחקרים במבחנה לא יכולים לאפיין אינטראקציות אלה ולהתמקד באינטראקציות תא-הפתוגן. יתר על כן, בדרך הנשימה ^3, במיוחד בחולים עם מחלת ריאות כרונית מוגלתית או בחולי מאוורר מכאני, קהילות polymicrobial נמצאים ולסבך אינטראקציה מארח הפתוגן. אלביקנס Pseudomonas aeruginosa וקנדידה שניהם הבעיה פתוגנים ^4, לעתים קרובות מבודדת מדגימות tracheobronchial, ו קשורים לזיהומים חמורים, במיוחד ביחידה לטיפול נמרץ ^5. יש אינטראקציות חיידקיםדווח בין פתוגנים אלה במבחנה, אך ההשפעה הקלינית של אינטראקציות אלה נותרה ⁶ לא ברורים. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין C. אלביקנס ופ aeruginosa, מודל עכברי של ג קולוניזציה אלביקנס דרכי הנשימה, ואחריו פ דלקת ריאות חריפה בתיווך aeruginosa- בוצעה.

Introduction

מודלים של בעלי חיים, בעיקר עכברים, נעשו שימוש נרחב כדי לחקור את תגובה חיסונית נגד פתוגנים. למרות חסינות מולדת ונרכשת שונה בין מכרסמים ובני האדם ^7, הקלות בגידול והפיתוח של knockouts לגנים רבים, להפוך עכברי מודל מצוין ללמוד תגובות חיסוני ^8. התגובה החיסונית היא מורכבת ותוצאות מהאינטראקציה של הפתוגן, (תאי האפיתל, תאי האנדותל) צמחיית תושב חיידקים וכמה (לימפוציטים, נויטרופילים, מקרופאגים) חיסוניים ואינם חסינים סוגים סלולריים ^2. במבחנה אינה מאפשרות התבוננות אינטראקציות המורכבות אלה ומתמקדים בעיקר באינטראקציות התא-פתוגן ייחודיים. בעוד מודלים של בעלי חיים יש להשתמש בזהירות ובמוגבלת לשאלות מאוד ספציפיות ורלוונטיות, מודלים עכבר מספקים תובנה טובה לתגובה החיסונית יונק in vivo ויכולים להתייחס לחלקים של שאלות קליניות חשובות ^7.

"Jove_content"> בדרכי הנשימה, קהילת החיידקים היא מורכבת שיוך מספר גדול של מיקרואורגניזמים שונים ^6. בעוד מה שמהווה Microbiome "נורמלי" בדרכי נשימה עדיין לא נקבע, קהילות תושב לעתים קרובות polymicrobial, ומקורן ממקורות אקולוגיים מגוונים. חולים עם מחלת ריאות כרונית מוגלתית (סיסטיק פיברוזיס, bronchectasis) או חולי מאוורר מכאני התערוכה צמחייה מסוימת בשל התישבות של דרכי הנשימה על ידי מיקרואורגניזמים לסביבה ^{שנרכשו-9.} אלביקנס Pseudomonas aeruginosa וקנדידה שניהם הבעיה פתוגנים ^5, לעתים קרובות מבודדת יחד מדגימות tracheobronchial , ואחראי לזיהום אופורטוניסטי חמור בחולים אלה, במיוחד ביחידה לטיפול הנמרצת (ICU) ^4.

בידוד של מיקרואורגניזמים אלה בדלקת ריאות חריפות בתוצאות טיפול נמרץ בטיפול אנטי-מיקרוביאלי נגד פ aeruginosa בשמרי ut בדרך כלל לא נחשבים פתוגניים באתר זה ^5. במבחנה אינטראקציות בין פ aeruginosa וג אלביקנס כבר דווח בהרחבה, והראה כי מיקרואורגניזמים אלה יכולים להשפיע על הצמיחה וההישרדות של אחד את השני, אבל מחקרים לא הצליחו להסיק אם נוכחותם של ג אלביקנס הוא מזיק או מועיל למארח ^10. מודלים העכבר פותחו כדי לטפל בזה רלוונטי של פ aeruginosa וג אלביקנס in vivo, אבל האינטראקציה בין מיקרואורגניזמים לא הייתה נקודת המפתח. ואכן, המודל הוקם כדי להעריך את מעורבותו של ג אלביקנס בתגובה מארח חיסוני, ותוצאה.

דגם קודם שנקבע על ידי רו et al כבר השתמש התישבות ראשונית עם ג אלביקנס אחרי דלקת ריאות חריפה הנגרמת על ידי פ ' aeruginosa. שימוש במודל שלהם, החוקרים מצאו תפקיד מזיק של prior ג אלביקנס קולוניזציה ^11. עם זאת רו et al משמש עומס גבוה של ג אלביקנס במודל שלהם עם 2 x 10 ⁶ CFU / עכבר במהלך 3 ימים רצופים. הקמנו מודל 4 ימים של ג קולוניזציה בדרכי הנשימה אלביקנס, או בהתמדה לפחות ללא פגיעת ריאות, במודל זה ג אלביקנס אוחזר עד 4 ימים לאחר החדרה יחידה של 10 ⁵ CFU לכל עכבר (איור 2) ^12,13. לאחר 4 ימים, אין עדות לגיוס דלקתי תא, ייצור ציטוקינים דלקתי ולא נזק אפיתל נצפתה. ב24 - 48 שעות, בנוכחות השיא של ג אלביקנס, למרות שתגובה חיסונית מולדת סלולרית וציטוקינים נצפתה, לא היה עדות לפגיעת ריאות. באופן מפתיע, עכברים וכך יישבו עם ג אלביקנס 48 שעות לפני intranasal החדרה של פ aeruginosa שנחלש זיהום בהשוואה לעכברים עם פ זיהום aeruginosa לבד. אניndeed, עכברים הציגו פציעת ריאות פחותה וירידה בניטל חיידקי ^12,13.

כמה השערות יכולות להסביר השפעה חיובית זו של התישבות מוקדמת עם ג אלביקנס על פ aeruginosa בתיווך דלקת ריאות חריפה. ראשון, שיחה בין-interspecies מעורב כל מיקרואורגניזמים מערכות חישת מניין, פ מבוסס homoserinelactone מערכת aeruginosa וג מבוסס פרנסול מערכת אלביקנס, הוערכה. שנית, ג אלביקנס פועל כמטרה "דמה" לפ aeruginosa הסטת הפתוגן מתאי האפיתל ריאות נחקר. שני ההשערות ביטלו (נתונים שלא פורסמו). ההשערה השלישית הייתה של "תחול" של מערכת החיסון המולדת על ידי ג אלביקנס האחראי לתגובה מולדת הבאה משופרת נגד פ aeruginosa. ההשערה האחרונה זו אושרה. אכן ג קולוניזציה אלביקנס הובילה ליחול חסינות מולדת throuGH IL-22, בעיקר מופרש על ידי תאי הלימפה מולדים, וכתוצאה מכך אישור חיידקים גדל ומופחת פגיעת ריאות ^12.

לסיכום, המארח הוא שחקן מרכזי ביחסי הגומלין בין מיקרואורגניזמים ויסות התגובה חיסונית המולדת ומעורבים סוגי תאים דלקתיים שונים. בעוד שניתן גזור אינטראקציות חיסוני המורכבות אלה במבחנה ניתן לספק השערות הראשוניות רק על ידי מתאים בדגמי vivo. הפרוטוקול הבא מספק דוגמא למחקר vivo של אינטראקציה הפתוגן בתיווך מארח שעשוי להיות מותאם למייקרו-אורגניזמים אחרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הוועדה המחוזית האתיקה האזורית לניסויים בבעלי החיים אישרה בשיטה זו, בהתאם לטיפול בבעלי חיים לאומי ובינלאומי ושימוש בקווי מנחים מחקר ניסיוניים.

אוסף 1. לדוגמא

1. אחסון מדגם
   1. לאסוף את כל הדגימות ומייד לאחסן ב-- 20 מעלות צלזיוס או על קרח עד אחסון במקפיא, כדי למנוע הידרדרות. הנח פוספט סטרילי שנאגרו (PBS) על קרח כדי לשפר lavages סימפונות מכתשי ביצועים (BAL).
2. כִּירוּרגִיָה
   1. לעקר את כל הציוד כירורגי באמצעות החיטוי.
      הערה: במידת האפשר, מומלץ להשתמש בשתי קבוצות שונות של מכשירים לצעדי בטן ובית חזה, כדי למנוע זיהום צולב. ציוד לנתיחה חובה מפורט באיור 4 א

2. עכברים, זני חיידקים ושמרים

1. עכברי בית בעמידה בשימוש מקומי של בעלי חיים מחדשהנחיות ועדת איתור במעמד מאוורר ללא עולה על 5 עכברים לכלוב, במזון ובמים lib מודעה, במתקן דיור ברמת בטיחות ביולוגית 2 עקב השימוש של 2 מיקרו-אורגניזמים ברמת בטיחות ביולוגית: פ aeruginosa וג אלביקנס.
2. שמור את זני החיידקים ב -80 ° C ב -40% בינוניים גליצרול.
   1. להוסיף חיידקים ישירות ממניות קפוא לתוך צינור תרבות המכיל 3 מיליליטר של המרק לוריא-Bertani סטרילי באמצעות חיסון לולאת 10 μl. השאר O ​​/ N ב 37 מעלות צלזיוס עם (סל"ד 400) רועד מסלולית היום לפני החדרה.
   2. חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות.
   3. לשאוב supernatant לסילוק פסולת הביולוגי מסוכן סגור מתאים. שים לב גלולה חסיד לבנה בחלק התחתון של צינור התרבות.
   4. לשטוף ולהשעות את גלולה באמצעות 5 מיליליטר של PBS.
   5. חזור על השלבים 2.2.2 ל2.2.3 בפעם שנייה כדי לבצע שטיפה שנייה.
   6. Resuspend חיידקי pelleted באמצעות 1 מיליליטר של PBSוvortexing הקצר.
   7. לקבוע את צפיפות הבידוד באמצעות מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר באמצעות מד צפיפות אופטי. צפיפות של 0.9 מתאים 10 ⁹ CFU / ml לPAO1, לדלל בהתאם.
      הערה: תוצאה זו יש כדי להתקבל לכל זן בשימוש על ידי קביעת צפיפות של דילולים רצופים של הבידוד מכויל.
   8. ודא הבידוד על ידי דילולים לוגריתמים סידוריים וצלחת של דילול כל 100 μl על bromocresol צלחות אגר סגול (BCP) ותרבות O / N. לנהל כל עכבר 50 intranasally μl של התמיסה המכילה 1 x ^08-02 אוקטובר x10 ⁸ CFU למ"ל (5 x ^06-01 אוקטובר x10 ⁷ CFU לכל עכבר).
3. השימוש ג אלביקנס SC5314 כזן התייחסות. לשמר את המתח ב- 40% בינוניים גליצרול ב -80 ° C.
   1. תוספת מרק שמרים-Peptone דקסטרוז עם אמיקצין 0.015%, כדי למנוע זיהום בקטריאלי ולהקל ספירה נוספת.
   2. להוסיף שמרים באמצעות 10 ו# 181; חיסון לולאת l לYPD-מרק מוכן להשלים עם O אמיקצין / N על 37 מעלות צלזיוס.
   3. שמרי קציר על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות.
   4. הסר supernatant לסילוק פסולת bioharzard מתאים. גלולה חסיד לבנה יש לשים לב שבתחתית צינור התרבות.
   5. לשטוף ולהשעות את חיידקי pelleted באמצעות 5 מיליליטר של PBS וvortexing הקצר.
   6. חזור על השלבים 2.2.2 ל2.2.3 בפעם שנייה כדי לבצע שטיפה שנייה.
   7. Resuspend גלולה באמצעות 1 מיליליטר של PBS וvortexing הקצר.
   8. לקבוע את הגודל של הבידוד על ידי סומך על hematocytometer Mallassez באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי ב40X הגדלה.
      הערה: ריכוז (בCFU / ml) מתקבלת באמצעות הנוסחא הבאה: (מספר השמרים x 10 ⁵⁾ / (מספר המלבנים רשת לספור על hematocytometer Mallassez).
   9. ודא ידי דילול לוגריתמים סידורי 10 ^-5 ו -10 ^-6 לאשר פתרון המכיל 2 x 10 ⁶ CFU / ml.
   10. צלחת על צלחות אגר YPD בתוספת אמיקצין 0.015%.

3. איירווייס התיישבות על ידי ג אלביקנס

הערה: לאחר הסתגלות סביבתית, עכברים הם שקלו פעמיים ביום.

1. מתחת למכסת מנוע קטר, 500 μl הפקדת sevoflurane על 4 סנטימטרים X 4 סנטימטר גזה (טכניקה פתוחה שחרר) ^14.
   1. מייד למקם את הגזה על הרצפה של תא כ 750 מיליליטר אינדוקציה. מייד למקם את הפלטפורמה העלתה רשת מעל הגזה, כדי למנוע מגע ישיר בין בעלי החיים והגזה.
   2. סגירת מכסה אטום ולחכות 1 עד 2 דקות, כדי לאפשר דיפוזיה של sevoflurane בתא.
   3. העבר את העכבר מכלוב לרשת פלטפורמה וקרובה מיכסה. הרדמה אור עם נשימה ספונטנית שימור צריכה להיות מושגת ב30 עד 45 שניות.
   4. לפקח על hypotonia על ידי התבוננות אובדן ליישר רפלקס שבו נקודת העכבר ניתן להסיר FROM התיבה והחדיר.
2. החדרת intranasal (ניתן לבצע בשניות 10 על ידי מפעיל מיומן).
   1. החזק את העכבר אחד בידיים שוכנות על גבה זקוף (איור 4).
   2. בעזרת אצבע, תומך בראש ולהשתמש באגודל כדי לשמור על הלסת סגורה כדי למנוע יריקה (איור 4C).
   3. כפי שתואר בשלב 2.3.8, להבטיח כי ג מוכן פתרון אלביקנס מכיל 2 x10 ⁶ CFU למ"ל לμl 50 החדיר נפח.
      הערה: הנקודה הקריטית השנייה היא הנפח החדיר. נפח נמוך מ -50 μl עלול לגרום לקולוניזציה מספיקה או החדרת הומוגניות של דרכי הנשימה, נפח גדול יותר עלול לגרום לטביעה / חנק ומוות.
   4. להחדיר את העכבר תוך מאנפף ידי מתקרב פיפטה לנחיריים.
   5. פיפטה ירידה של 50 μl יוצרת בועה המכילה את הפתרון בנחיריים, בשאיפה לאחר מכן על ידי spontaneouslעכבר נשימת y.
   6. מקום עכבר באזור התאוששות (למשל, כלוב חשוף מוגזים היטב גדול עם מנורת חימום מעל). עכברים חייבים להיות במעקב עד התעוררות מלאה. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal ורפלקס ליישר. בשלב זה, העכבר ניתן להחזיר לכלוב דיור רגיל.

4. פ הזיהום חריף ריאות -induced aeruginosa

הערה: עכברים הם שקלו במהלך ארבעה הימים הבאים. בדרך כלל, עכברים לעלות במשקל במהלך ג קולוניזציה תיווך אלביקנס בדרכי הנשימה (איור 2 א).

1. הכן את ההשעיה מכילה פ aeruginosa היום של החדרה לאחר O / צמיחת N (סעיף 2.2).
2. הרדימי בקצרה באמצעות שאיפת sevoflurane כפי שתואר לעיל (סעיף 3.1).
   הערה: כדי לבצע דלקת ריאות חריפה, מומלץ נטל חיידקים הם הציעו בטבלת 1.
3. להחדיר את העכבר כפי שתואר לעיל (סעיף 3.2) עם תשומת לב מיוחדת להתאוששות שלאחר החדרה.

5. מדוד של ריאות פגיעה אינדקס

1. הכן תמיסה המכילה אלבומין FITC שכותרתו. הזרק פתרון HR 2 זה לפני המתת חסד של בעלי החיים.
   1. שוקל 0.2 מ"ג של אלבומין-FITC עם הציוד המתאים.
   2. להוסיף 0.2 מ"ג למ"ל PBS 1. בקצרה מערבולת. אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, למקם את הפתרון בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור הסביבה.
   3. להזריק תוך-peritoneally 200 μl של פתרון אלבומין FITC שכותרתו לכל עכבר.
2. המתת חסד
   1. לשקול את העכברים לנתונים במשקל האחרונים.
   2. להרדים עכבר אחת בהתאם לשימוש מקומי של בעלי חיים בהנחיות ועדת מחקר באמצעות זריקה אחת תוך הצפק ממנת יתר קטלני של pentobarbital: 300 μl של pentobarbital 5.47%.
   3. הסר עכבר מהכלוב ומקבל lהזרקת ethal על ידי מפעיל.
   4. לאחר הזרקה, להעביר את העכבר לבד לכלוב אחר, נסתר מכל בעלי חיים אחרים. שים לב לעכבר עד היעדר התנועה. מוות הוא לאשר בהיעדר התנועה, תנועה במיוחד בדרכי הנשימה, חוסר הדופק.
   5. לבצע איסוף של דגימות כירורגית על חיות מתות, ולכן ללא הרדמה ולא משככי כאבים.
3. אוסף כירורגי מדגם: שלב בית חזה.
   הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים, כל הניתוח מתבצע תוך שימוש בציוד סטרילי בסביבת רמת בטיחות ביולוגית 2.
   1. החל אתנול לעור. לבצע חתך בעור קו האמצע מעצם החזה ועד אמצע בטן עם מספריים. לַחתוֹך קו האמצע לאורך בית החזה משני הצדדים. מקפלים בחזרה את העור בכל צד של בית החזה כדי להמחיש את כלוב הצלעות.
   2. בצע חתך אנכי של בית החזה משני הצדדים הולכים לכיוון עצם הבריח כדי שתוכל להישען על קיר החזה הקדמי כולו עם שטרןאממ מאפשר הדמיה המושלמת של לב וריאות (איור 5 א, 5).
   3. איסוף דם באמצעות מזרק מראש heparined על ידי ניקוב הלב ליד עורק interventricular. למשוך מינימום של 500 μl להשיג פלזמה לפחות 100 μl. מניחים את דגימת הדם על קרח.
   4. לבצע חתך בצוואר הרחם קו האמצע כדי להמחיש את קנה הנשימה (איור 5 ב ו -5 ג). זהירות לנתח את fascia סביב קנה הנשימה. מניחים תפר מאחורי קנה הנשימה (איור 5 ג ו5D). בהמשך לכך התפר ייסגר סביב מחט cannulating כדי להבטיח שטיפה נאותה.
   5. קטטר קנה הנשימה באמצעות מחט 20-G שונה gavage (איור 5D ו4A). לקשור קשר כירורגית סביב קנה הנשימה cannulated עם התפר ממוקם בעבר.
   6. כדי לבצע lavages רונכואלוואולרית (BAL), בעדינות ובהדרגה להזריק ולצייר 500 μl של PBS קר כקרח ל/ מהריאות. מניחים את המדגם עלייce להימנע תמוגה הסלולרית.
   7. חזור על שלב 5.3.6, 3 פעמים כדי לקבל סך של 1,500 דגימות μl נוזל BAL ושטיפת בריכה לתוך צינור צנטריפוגות 2 מיליליטר (איור 5E).
   8. הסר את הריאות מהחזה. הנח קטע ריאה (גודל צריך להתאים למחצית מריאה אחת או אונה) לתוך 1.5 מיליליטר צינור צנטריפוגות ולאחסן במהירות ב-- 80 מעלות צלזיוס.
   9. הנח קטע ריאות בצינור המוליזה שקל מראש המכיל PBS לקבוע נטל חיידקים ולמקם אותו על קרח.
4. אוסף כירורגי מדגם: שלב בטן.
   1. לבצע חתך נוסף בצד השמאל של הבטן. שים לב לטחול דרך הצפק.
   2. הסר את הטחול ואת המקום לתוך צינור שני המוליזה המכיל 1 מיליליטר PBS ומניחים על קרח.
5. מדד פציעת ריאות
   הערה: חדירות קרום מכתשי-נימים מוערכת על ידי מדידת FITC שכותרתו-אלבומין דליפה מהתא של כלי הדם למכתשים-interstתא itial.
   1. מדגם צנטריפוגה דם ונוזל BAL במשך 10 דקות ב 1500 x גרם. לאסוף את supernatants לתוך צינורות צנטריפוגות חדשים. כדורים מתאים לתאי פלזמה או BAL גויסו וצריכים להיות ממוקם על קרח.
   2. להוסיף כל supernatant דם (פלזמה, צהובה) או supernatant BAL 100 μl לצלחת 96-היטב שקופה (300 בארות μl). מניחים נייר כסף על הצלחת אם לא נעשה שימוש באופן מיידי.
   3. למדוד את רמות הקרינה בפלזמה וsupernatants BAL באמצעות קורא microplate פלואורסצנטי (עירור, 487 ננומטר; פליטה, 520 ננומטר).
   4. לקבוע את מדד פציעת ריאות על ידי חישוב יחס הקרינה [(supernatant supernatant / דם BAL) x 100].
6. ספירת רונכואלוואולרית שטיפה (BAL) תא ההפרש.
   הערה: השתמש בתא גלולה שהתקבל מצנטריפוגה של נוזל BAL בשלב 5.5.1.
   1. במידת הצורך, להשתמש במאגר תמוגה האדום-תא. הוסף 500 μl של חיץ תמוגה אדום תאים לתוך צינור צנטריפוגות מכיל celגלולה l. מערבולת ובקצרה להשאיר 10 דקות על קרח. הוסף 500 μl PBS להפסיק תמוגה האדום-תא.
   2. קציר תאים על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 1500 x גרם. הסר supernatant ולהשעות את התא גלולה ל1 מיליליטר של PBS סטרילי. ספירת תאים בhematocytometer Mallassez. באמצעות hemacytometer לספירת תאים. להתרכז תאים בשקופית עם cytospin.
   3. תאי כתם באמצעות ערכת צבעים המאפשרת זיהוי וספירת תאים (מקרופאגים, לימפוציטים, נויטרופילים).
7. נטל חיידקי ריאות והפצת חיידקים
   הערה: כדי להעריך נטל ריאות חיידקית והפצת חיידקים, ריאות וטחול נאספו בהתאמה ומאוחסנות לתוך צינורות המוליזה-שקל מראש המכילים 1 מיליליטר של PBS (צעד 5.3.9).
   1. לשקול צינורות המוליזה המכילים 1 מיליליטר PBS וגם ריאות או טחול. Homogenize הדגימות עם homogenizer רקמות להשיג homogenates ריאות והטחול homogenates.
   2. הפקדה של הומו רקמה 100 μlgenates לתוך צינורות צנטריפוגה המכילים 900 μl של PBS סטרילי כדי להשיג דילולים לוגריתמים סידוריים.
   3. צלחת שתי דוגמאות האחרונות המתאימות מדוללות (10 ^-3 ו -10 ^-2) משני BCP-אגר לפ aeruginosa או YPD-אמיקצין-בתוספת אגר לג אלביקנס ריאות ונחישות נטל טחול.
   4. דגירה צלחות O / N על 37 מעלות צלזיוס. למחרת, למנות את המושבות על צלחות.
   5. מדד התוצאה למשקל ריאות להשיג CFU לגרם של ריאות. גודל מדגם ריאות הם לא אותו הדבר, התוצאה היה צריך לבוא לידי ביטוי בCFU לגרם של ריאות.
      נוסחה למדד היא: [CFU] x [משקל של צינור המוליזה וריאות] - [משקל של צינור המוליזה].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כפי שניתן לראות בעבר בתיאור הפרוטוקול, הניסוי צריך 5 ימים כדי להשלים (איור 1: ציר זמן ניסוי). מפעיל אחד שידל במשך כל הריצה של הניסוי ויכול להתמודד עם התהליכים עד למקסימום של 10 עכברים. אם יותר בעלי חיים נדרשים, שני אנשים נדרשים במיוחד עבור אוסף מדגם כירורגית. ואכ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מודלים של בעלי חיים, במיוחד יונקים, שימושיים להבהיר מנגנונים מורכבים של אינטראקציה מארח הפתוגן בתחומי חסינות. כמובן, את הצורך במידע זמין רק ממודלים של בעלי החיים חייבים להיות חיוני; אחרת, שימוש בבעלי החיים חייב להיות מוחלף על ידי מודלים במבחנה. מודל חיה זה ממחיש ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevorane, Sevoflurane	Abott	05458-02	250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940	Berthold Technologies	reference in first column	no comment
Bromo-cresol purple agar	Biomerieux	43021	20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47%	CEVA	6742145	100 ml plastic bottle
2-headed valve	Distrimed	92831	no comment
Sterile inoculation loop 10 µl	Dutscher	10175	x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml	Dutscher	30003	per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml	Dutscher	64300	no comment
Ultrospec 10	General Electric life sciences	80-2116-30	no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Life technologies	10010023	packaged in 500 ml
amikacin 1 g	Mylan	62516778	per 10
Heparin 10,000 UI in 2 ml	Pan pharma	9128701	10x per unit
RAL 555 coloration kit	RAL Diagnostics	361550	3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube	Sarstedt	55.526.006	x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate	Sarstedt	82 1581500	no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth	Sigma	95763	in powder
FITC-albumin	Sigma	A9771	in powder
Luria Bertani Broth	Sigma	L3022	in powder
25-gauge needle	Terumo or unisharp	A231	x 100 conditioning
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	no comment