Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Riepilogo

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Abstract

Studiare interazione ospite-patogeno ci permette di comprendere i meccanismi alla base della patogenicità microbica durante l'infezione. La prognosi di accoglienza dipende dal coinvolgimento di una risposta immunitaria adeguata contro l'agente patogeno ^1. La risposta immunitaria è complesso e risultati di interazione degli agenti patogeni e diversi tipi cellulari del sistema immunitario o non immuni ^2. Studi in vitro non possono caratterizzare queste interazioni e concentrarsi su interazioni delle cellule-patogeno. Inoltre, nelle vie respiratorie ^3, in particolare nei pazienti con malattia polmonare cronica suppurativa o nei pazienti in ventilazione meccanica, le comunità polimicrobiche sono presenti e complicano interazione ospite-patogeno. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans sono entrambi problema patogeni ^4, spesso isolati da campioni tracheobronchiale, e associato a gravi infezioni, soprattutto nel reparto di terapia intensiva ^5. Interazioni microbiche hannostato segnalato tra questi agenti patogeni in vitro, ma l'impatto clinico di queste interazioni non è chiara ^6. Per studiare le interazioni tra C. Albicans e P. aeruginosa, un modello murino di C. colonizzazione albicans vie respiratorie, seguita da una P. è stata eseguita infezione polmonare acuta aeruginosa- mediata.

Introduzione

Modelli animali, soprattutto topi, sono stati ampiamente utilizzati per esplorare risposte immunitarie contro gli agenti patogeni. Anche se l'immunità innata e acquisita diversa tra roditori e nell'uomo ^7, la facilità di allevamento e lo sviluppo di fori per numerosi geni, i topi fanno un ottimo modello per studiare le risposte immunitarie ^8. La risposta immunitaria è complesso e può derivare dalla interazione di un agente patogeno, la flora residente microbica e diversi immunitarie (linfociti, neutrofili, macrofagi) e non immunitarie (cellule epiteliali, cellule endoteliali) tipi cellulari ^2. Studi in vitro non consentono l'osservazione queste interazioni complesse e si concentrano principalmente sulle interazioni uniche cellula-patogeno. Mentre modelli animali devono essere usati con cautela e limitate a domande molto specifiche e pertinenti, modelli murini forniscono una buona conoscenza della risposta immunitaria mammifero in vivo e possono riguardare parti di importanti quesiti clinici ^7.

Nelle vie aeree, la comunità microbica è complesso associando un gran numero di diversi microrganismi ^6. Mentre ciò che costituisce un "normale" microbioma vie aeree rimane da stabilire, le comunità residenti sono spesso polimicrobiche, e provengono da diverse fonti ecologiche. I pazienti con malattia suppurativa cronica polmonare (fibrosi cistica, bronchectasis) o pazienti in ventilazione meccanica presentano una particolare flora dovuta alla colonizzazione delle vie aeree da parte di microrganismi dell'ambiente acquisite ^9. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans sono entrambi problema patogeni ^5, spesso isolata insieme da campioni tracheobronchiali , e responsabile di una grave infezione opportunistica in questi pazienti, in particolare nel reparto di terapia intensiva (ICU) ^4.

L'isolamento di questi microrganismi durante polmonite acuta nei risultati di terapia intensiva in trattamento antimicrobico contro P. aeruginosa blievito ut non sono di solito considerato patogeno in questo sito ^5. le interazioni in vitro tra P. aeruginosa e C. albicans sono state ampiamente riportate e ha dimostrato che questi microrganismi possono influenzare la crescita e la sopravvivenza di loro ma studi non avrebbero potuto concludere se la presenza di C. albicans è dannosa o benefica per l'host ^10. Modelli di topo sono stati sviluppati per affrontare questa rilevanza di P. aeruginosa e C. albicans in vivo, ma l'interazione tra i microrganismi non era il punto chiave. In effetti, il modello è stato istituito per valutare il coinvolgimento di C. albicans in risposta immunitaria, e il risultato.

Un modello precedente stabilito dalla Roux et al già utilizzato un colonizzazione iniziale con C. albicans seguito da un'infezione polmonare acuta indotta da P. aeruginosa. Usando il loro modello, gli autori hanno trovato un ruolo deleterio di prior C. albicans colonizzazione da ^11. Tuttavia Roux et al ha utilizzato un carico elevato di C. albicans nel loro modello con 2 x 10 ^{6 CFU} / topo durante 3 giorni consecutivi. Abbiamo stabilito un modello di 4 giorni di C. albicans colonizzazione delle vie aeree, o almeno la persistenza senza danno polmonare, in questo modello C. albicans è stato recuperato fino a 4 giorni dopo una singola instillazione di 10 ⁵ CFU per mouse (Figura 2B) ^12,13. Dopo 4 giorni, è stata osservata alcuna evidenza di reclutamento di cellule infiammatorie, la produzione di citochine infiammatorie né danno epiteliale. A 24 - 48 ore, in presenza di C. picco albicans, anche se è stata osservata una risposta immunitaria innata cellulare e citochine, non vi era alcuna evidenza di danno polmonare. Sorprendentemente, i topi così colonizzato con C. albicans 48 ore prima endonasale instillazione di P. aeruginosa era attenuato infezione rispetto ai topi con P. infezione aeruginosa da solo. ioel resto, i topi esposti danno polmonare minore e una diminuzione della carica batterica ^12,13.

Diverse ipotesi potrebbe spiegare questo effetto benefico della colonizzazione prima con C. albicans su P. aeruginosa mediata infezione polmonare acuta. In primo luogo, un cross-talk interspecie che coinvolge ogni microrganismi sistemi quorum sensing, il P. basato homoserinelactone- Sistema aeruginosa e la base farnesolo-C. Sistema albicans, sono stati valutati. Second, C. albicans agisce come bersaglio "esca" per P. aeruginosa deviare patogeno da cellule epiteliali polmonari è stata studiata. Entrambe le ipotesi sono state invalidate (dati non pubblicati). La terza ipotesi è quella di un "priming" del sistema immunitario innato da C. albicans responsabile di una successiva risposta innata maggiore contro P. aeruginosa. Quest'ultima ipotesi è stata confermata. Infatti C. colonizzazione albicans ha portato ad un adescamento di immunità innata through IL-22, secreta principalmente dalle cellule linfoidi innate, con conseguente aumento della clearance batterica e riduce il danno polmonare ^12.

In conclusione, il padrone di casa è un attore centrale nell'interazione tra microrganismi che modulano la risposta immunitaria innata e che coinvolgono diversi tipi di cellule infiammatorie. Mentre queste interazioni immunitario complessi possono essere sezionato in vitro le ipotesi iniziali possono essere forniti unicamente da appropriati modelli in vivo. Il protocollo che segue fornisce un esempio di studio in vivo del patogeno host-mediata, che può essere adattato per altri microrganismi.

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Protocollo

Il comitato regionale etico regionali per esperimenti su animali ha approvato questo metodo, in accordo con cura nazionale e internazionale degli animali e l'uso di linee di ricerca in fase di sperimentazione.

1. Raccolta dei campioni

1. Conservazione del campione
   1. Raccogliere tutti i campioni e immediatamente conservare a - 20 ° C o su ghiaccio fino magazzini frigoriferi per evitare il deterioramento. Posizionare fosfato sterile salina tamponata (PBS) su ghiaccio per migliorare lavaggi bronco-alveolare (BAL) di prestazioni.
2. Chirurgia
   1. Sterilizzare tutti apparecchi chirurgici in autoclave.
      NOTA: Se possibile, si consiglia di utilizzare due diversi tipi di strumenti per i passaggi addominale e toracica per evitare la contaminazione incrociata. Attrezzature dissezione richiesto è dettagliata in figura 4A

2. I topi, batteriche e lievito Ceppi

1. Topi Casa in conformità con l'uso locale di animali in reDirettive del comitato di ricerca in un rack ventilato senza superiore a 5 topi per gabbia, con cibo e acqua ad lib, in una struttura alloggiativa livello di biosicurezza 2 a causa dell'uso di livello di biosicurezza 2 microrganismi: P. aeruginosa e C. albicans.
2. Mantenere i ceppi batterici a -80 ° C in 40% glicerolo medio.
   1. Aggiungere i batteri direttamente dal magazzino congelato in provetta contenente 3 ml di sterile Luria-Bertani brodo usando un ciclo inoculazione 10 ml. Lasciare O / N a 37 ° C con scuotimento orbitale (400 rpm) il giorno prima instillazione.
   2. Batteri Harvest per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min.
   3. Aspirare il surnatante in un appropriato smaltimento dei rifiuti a rischio biologico chiuso. Osservare bianco pellet aderenti al fondo della provetta.
   4. Lavare e di sospendere il pellet con 5 ml di PBS.
   5. Ripetere i passaggi da 2.2.2 a 2.2.3 una seconda volta per eseguire un secondo lavaggio.
   6. Risospendere i batteri pellet con 1 ml di PBSe breve vortex.
   7. Determinare la densità di inoculo con densitometro ottico a 600 nm utilizzando un misuratore di densità ottica. Una densità di 0,9 corrisponde a 10 ⁹ CFU / ml per PAO1, diluire conseguenza.
      NOTA: Questo risultato deve essere ottenuto per ogni ceppo utilizzato determinando la densità di diluizioni successive di un inoculo calibrato.
   8. Verificare l'inoculo per diluizioni logaritmiche seriali e piastra 100 ml di ogni diluizione su agar viola bromocresolo (BCP) piatti e cultura O / N. Somministrare ogni topo intranasale 50 microlitri della soluzione contenente 1 x 10 ⁸ al 2 x10 ⁸ CFU per ml (5 x 10 ⁶ al 1 x10 ⁷ CFU per topo).
3. Usa C. albicans SC5314 come un ceppo di riferimento. Conservare il ceppo nel 40% medio glicerolo a -80 ° C.
   1. Supplemento Lievito-peptone-destrosio brodo con 0,015% amikacina per evitare la contaminazione batterica e facilitare ulteriormente conteggio.
   2. Aggiungete il lievito utilizzando 10 &# 181; l 'inoculazione del ciclo in preparato YPD-brodo integrato con amikacina O / N a 37 ° C.
   3. Lievito raccolta per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min.
   4. Rimuovere il surnatante in un appropriato smaltimento dei rifiuti bioharzard. Bianco pellet aderente deve osservare nel fondo della provetta.
   5. Lavare e sospendere i batteri pellet con 5 ml di PBS e breve vortex.
   6. Ripetere i passaggi da 2.2.2 a 2.2.3 una seconda volta per eseguire un secondo lavaggio.
   7. Risospendere il pellet con 1 ml di PBS e breve vortex.
   8. Determinare la dimensione dell'inoculo contando su un hematocytometer Mallassez utilizzando un microscopio standard al 40x.
      NOTA: Concentrazione (in CFU / ml) è ottenuto utilizzando la seguente formula: (numero di lievito ⁵ x 10) / (numero di rettangoli griglia contati sulla hematocytometer Mallassez).
   9. Verifica mediante diluizione logaritmica seriale 10 ^-5 e 10 ^-6 confermare che soluzione contiene 2 x 10 ⁶ CFU / ml.
   10. Piatto su piastre di agar YPD integrato con 0,015% amikacina.

3. Airways colonizzazione di C. albicans

NOTA: Dopo adattamento ambientale, i topi sono pesate due volte al giorno.

1. Sotto cappa, deposito 500 ml di sevoflurano SU UN 4 cm x 4 cm di garza (tecnica open-drop) ^14.
   1. Immediatamente collocare la garza sul pavimento di una camera di circa 750 ml di induzione. Porre immediatamente una piattaforma maglia sollevata sopra la garza per evitare il contatto diretto tra l'animale e la garza.
   2. Chiudere coperchio ermetico e aspettare 1-2 minuti per consentire la diffusione di Sevorane nella camera.
   3. Trasferire il mouse dalla gabbia a maglie piattaforma e chiudere il coperchio. Anestesia leggera con la respirazione spontanea conservato dovrebbe essere realizzato in 30-45 secondi.
   4. Monitor per ipotonia osservando perdita del riflesso di raddrizzamento a questo punto il mouse può essere rimosso fRom la scatola e instillato.
2. Instillazione intranasale (può essere eseguita in 10 secondi da un operatore qualificato).
   1. Tenete il mouse con una sola mano situato sul dorso tenuto in posizione verticale (Figura 4B).
   2. Usando il dito indice, sostenere la testa e usare il pollice per mantenere la mascella chiusa per evitare espettorazione (Figura 4C).
   3. Come descritto al punto 2.3.8, in modo che il preparato C. soluzione albicans contiene 2 x10 ⁶ CFU per ml per un volume di 50 ml instillato.
      NOTA: Il secondo punto critico è il volume infuso. Un volume inferiore a 50 ml potrebbe tradursi in una colonizzazione insufficiente o instillazione disomogeneo di vie aeree, un volume maggiore può indurre annegamento / soffocamento e di morte.
   4. Instillare il mouse intra-nasale avvicinando la pipetta alle narici.
   5. Pipettare una goccia 50 ml formando una bolla contenente la soluzione sulle narici, poi inalato dal spontaneously del mouse respirazione.
   6. Posto del mouse in una zona di recupero (ad esempio, una grande gabbia nuda ben aerato con una lampada di riscaldamento in testa). I topi deve essere monitorato fino a completa risveglio. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale e riflesso di raddrizzamento. A questo punto, il mouse può essere restituito a un normale gabbia di alloggiamento.

4. P. aeruginosa indotta acuta polmonare Infezione

NOTA: I topi sono pesati durante i quattro giorni successivi. Normalmente, i topi aumentano di peso durante C. colonizzazione delle vie aeree albicans mediata (Figura 2A).

1. Preparare la sospensione contenente P. aeruginosa il giorno della instillazione dopo O / N crescita (sezione 2.2).
2. Anestetizzare brevemente utilizzando inalato Sevoflurane come descritto in precedenza (punto 3.1).
   NOTA: Per eseguire l'infezione polmonare acuto, raccomandato carica batterica sono suggeriti inTabella 1.
3. Instillare il mouse come descritto in precedenza (punto 3.2), con particolare attenzione al recupero post-instillazione.

5. Misura di Lung Injury Index

1. Preparare una soluzione contenente albumina coniugati con fluoresceina. Iniettare questa soluzione 2 ore prima l'eutanasia degli animali.
   1. Pesare 0,2 mg di albumina-FITC con l'attrezzatura adeguata.
   2. Aggiungere 0,2 mg in 1 ml di PBS. Brevemente vortice. Se non utilizzato immediatamente, mettere la soluzione in stagnola per evitare l'esposizione alla luce ambientale.
   3. Iniettare intra-peritoneally 200 ml di soluzione di albumina coniugati con fluoresceina per ogni mouse.
2. Eutanasia
   1. Pesare i topi per gli ultimi dati di peso.
   2. L'eutanasia un singolo mouse secondo l'uso locale di animali nelle linee guida del comitato di ricerca che utilizzano una iniezione intraperitoneale di overdose letale di pentobarbital: 300 ml di 5,47% pentobarbital.
   3. Rimuovere il mouse dalla gabbia e riceve liniezione Ethal dall'operatore.
   4. Dopo l'iniezione, trasferire il mouse solo a un'altra gabbia, nascosto da tutti gli altri animali. Osservare il mouse fino assenza di movimento. Confermare la morte è per mancanza di movimento, il movimento particolare delle vie respiratorie, la mancanza di impulsi.
   5. Eseguire la raccolta di campioni chirurgici su animali morti, quindi senza anestesia né analgesici.
3. Raccolta del campione chirurgica: fase toracica.
   NOTA: Per mantenere condizioni di sterilità, tutta la chirurgia viene eseguita utilizzando materiale sterile in un ambiente di livello di biosicurezza 2.
   1. Applicare etanolo sulla pelle. Eseguire una incisione cutanea mediana da sterno a metà addome con le forbici. Dalla linea mediana incise lungo la gabbia toracica su entrambi i lati. Ripiegare la pelle su entrambi i lati del torace per visualizzare la gabbia toracica.
   2. Eseguire un'incisione verticale della gabbia toracica ai lati salendo verso clavicole per poter reclinare l'intera parete anteriore petto con la poppaum permettendo la visualizzazione perfetta del cuore e dei polmoni (Figura 5A, 5B).
   3. Raccogliere il sangue con una siringa pre-heparined perforando il cuore accanto all'arteria interventricolare. Prelevare un minimo di 500 microlitri di ottenere almeno 100 ml di plasma. Posizionare il campione di sangue su ghiaccio.
   4. Eseguire un'incisione mediana cervicale per visualizzare la trachea (Figura 5B e 5C). Sezionare con cura la fascia intorno alla trachea. Collocare una sutura dietro la trachea (Figura 5C e 5D). Successivamente la sutura sarà chiusa intorno all'ago cannulating per garantire il corretto lavaggio.
   5. Cateterizzarla trachea utilizzando l'ago 20-G modificato gavage (Figura 5D e 4A). Un nodo chirurgico intorno alla trachea cannulato con la sutura precedentemente posizionato.
   6. Per eseguire lavaggi broncoalveolare (BAL), dolcemente e progressivamente iniettare e disegnare 500 ml di PBS ghiacciato nel / dal polmone. Mettere il campione sul ice per evitare lisi cellulare.
   7. Ripetere il passaggio 5.3.6, 3 volte per ottenere un totale di 1.500 campioni microlitri BAL fluido e piscina di lavaggio in un tubo da centrifuga da 2 ml (Figura 5E).
   8. Rimuovere i polmoni dal petto. Collocare un segmento polmonare (dimensione dovrebbe corrispondere alla metà di un polmone o un lobo) in 1,5 ml provetta da centrifuga e memorizzare rapidamente a - 80 ° C.
   9. Posizionare un segmento del polmone in un tubo emolisi pre-pesato contenente PBS per determinare la carica batterica e posizionarlo sul ghiaccio.
4. Raccolta del campione chirurgica: fase addominale.
   1. Eseguire un'altra incisione sul lato sinistro dell'addome. Osservare la milza attraverso il peritoneo.
   2. Rimuovere la milza e posto in un secondo tubo emolisi contenente 1 ml di PBS e posto sul ghiaccio.
5. Indice danno polmonare
   NOTA: la membrana alveolo-capillare permeabilità viene valutata misurando coniugati con fluoresceina-albumina perdita dal compartimento vascolare al alveolo-interstVano itial.
   1. Centrifugare campione di sangue e fluido BAL per 10 min a 1500 x g. Raccogliere i surnatanti in nuove provette. Il pellet corrispondono a plasmacellule o BAL assunti e dovrebbero essere immessi sul ghiaccio.
   2. Aggiungere 100 ml di ogni surnatante del sangue (plasma, giallo) o BAL surnatante in una piastra a 96 pozzetti trasparente (300 pozzi microlitri). Posizionare un foglio sulla piastra, se non utilizzato immediatamente.
   3. Misurare i livelli di fluorescenza nel plasma e sovranatanti BAL utilizzando un lettore a fluorescenza micropiastre (eccitazione, 487 nm, emissione, 520 nm).
   4. Determinare l'indice di danno polmonare calcolando il rapporto di fluorescenza [(BAL surnatante surnatante / sangue) x 100].
6. Lavaggio broncoalveolare (BAL) conta cellulare differenziale.
   NOTA: utilizzare il pellet cellulare ottenuto dalla centrifugazione di BAL al punto 5.5.1.
   1. Se necessario, utilizzare un tampone di lisi rosso-cellulare. Aggiungere 500 pl di tampone di lisi eritrociti nel tubo da centrifuga contenente il cell pellet. Brevemente vortex e lasciare 10 minuti in ghiaccio. Aggiungere 500 microlitri di PBS per fermare lisi rosso-cellulare.
   2. Celle di raccolta per centrifugazione per 10 min a 1500 x g. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS sterile. Enumerare le cellule su un hematocytometer Mallassez. Utilizzando un emocitometro Conteggio di celle. Concentratevi cellule su un vetrino con un cytospin.
   3. Cellule macchia con kit di colorazione che consenta l'identificazione delle cellule e la conta (macrofagi, linfociti, dei neutrofili).
7. Polmone carica batterica e la diffusione batterica
   NOTA: Per valutare polmone carica batterica e la diffusione di batteri, i polmoni e la milza sono stati, rispettivamente, raccolto e conservato in provette pre-pesati emolisi contenenti 1 ml di PBS (fase 5.3.9).
   1. Pesare i tubi emolisi contenenti 1 ml di PBS e sia polmonari o milza. Omogeneizzare i campioni con un omogeneizzatore tessuto per ottenere omogenati polmonari e omogenati milza.
   2. Deposita 100 ml di homo tessutogenates in provette contenenti 900 ml di PBS sterile per ottenere diluizioni logaritmiche seriali.
   3. Piastra le ultime due campioni diluiti appropriati (10 ^-3 e 10 ^-2) su entrambi BCP-agar per P. aeruginosa o agar YPD-amikacina-integrato per C. albicans polmone e della milza determinazione degli oneri.
   4. Incubare le piastre O / N a 37 ° C. Il giorno seguente, enumerare le colonie su piastre.
   5. Indice il risultato al peso del polmone per ottenere un CFU per grammo di polmone. Dimensioni del campione polmone non sono gli stessi, i risultati sono espressi in CFU per grammo di polmone.
      Formula per l'indice è: [CFU] x [peso del tubo emolisi e polmoni] - [peso del tubo emolisi].

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Risultati

Come visto in precedenza durante la descrizione del protocollo, l'esperimento ha bisogno di 5 giorni a completare (Figura 1: esperimento temporale). Un operatore viene sollecitato durante l'intera esecuzione dell'esperimento e può gestire i processi fino ad un massimo di 10 topi. Se sono necessari più animali, sono necessarie due persone in particolare per la raccolta del campione chirurgico. In effetti tutti i campioni devono essere raccolti in meno di 2 ore al fine di evitare un aumento ...

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Discussione

I modelli animali, in particolare i mammiferi, sono utili per chiarire i meccanismi complessi di interazione ospite-patogeno nei campi di immunità. Naturalmente, la necessità di informazioni ottenibili solo dai modelli animali devono essere essenziale; altrimenti, l'uso di animali deve essere sostituito da modelli in vitro. Questo modello animale illustra l'intuizione che può essere fornita solo da un modello animale in quanto l'interazione tra gli agenti patogeni è mediata da una rispo...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevorane, Sevoflurane	Abott	05458-02	250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940	Berthold Technologies	reference in first column	no comment
Bromo-cresol purple agar	Biomerieux	43021	20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47%	CEVA	6742145	100 ml plastic bottle
2-headed valve	Distrimed	92831	no comment
Sterile inoculation loop 10 µl	Dutscher	10175	x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml	Dutscher	30003	per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml	Dutscher	64300	no comment
Ultrospec 10	General Electric life sciences	80-2116-30	no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Life technologies	10010023	packaged in 500 ml
amikacin 1 g	Mylan	62516778	per 10
Heparin 10,000 UI in 2 ml	Pan pharma	9128701	10x per unit
RAL 555 coloration kit	RAL Diagnostics	361550	3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube	Sarstedt	55.526.006	x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate	Sarstedt	82 1581500	no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth	Sigma	95763	in powder
FITC-albumin	Sigma	A9771	in powder
Luria Bertani Broth	Sigma	L3022	in powder
25-gauge needle	Terumo or unisharp	A231	x 100 conditioning
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	no comment