Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Resumo

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Resumo

Estudar interação patógeno-hospedeiro nos permite compreender os mecanismos subjacentes da patogenicidade durante a infecção microbiana. O prognóstico do hospedeiro depende do envolvimento de uma resposta imune contra o patógeno adaptado ^1. A resposta imune é complexo e os resultados a partir da interação dos agentes patogénicos e vários tipos celulares imunes ou não imunes ^2. Os estudos in vitro não pode caracterizar essas interações e foco em interações celulares-patógeno. Além disso, nas vias aéreas ^3, particularmente em doentes com doença pulmonar crônica supurativa ou em pacientes sob ventilação mecânica, comunidades polimicrobianas estão presentes e complicar interação patógeno-hospedeiro. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans são tanto problema patógenos ^4, freqüentemente isolado de amostras traqueobrônquicas, e associado a infecções graves, especialmente na unidade de cuidados intensivos ^5. Interações microbianas temfoi relatado entre esses patógenos in vitro, mas o impacto clínico destas interações ainda não está claro ^6. Para estudar as interações entre C. Albicans e P. aeruginosa, um modelo de murino de C. colonização albicans vias aéreas, seguido de um p infecção pulmonar aguda mediada aeruginosa- foi realizada.

Introdução

Os modelos animais, especialmente ratinhos, têm sido extensivamente utilizados para explorar as respostas imunitárias contra os agentes patogénicos. Embora a imunidade inata e adquirida diferem entre roedores e humanos ^7, a facilidade na criação e no desenvolvimento de nocautes para numerosos genes, fazer camundongos um excelente modelo para estudar as respostas imunes ^8. A resposta imune é complexo e resulta da interacção de um agente patogénico, da flora residente microbianas e vários imune (linfócitos, neutrófilos, macrófagos) e não-imune (células epiteliais, células endoteliais) tipos celulares ^2. Os estudos in vitro não permitem observar essas interações complexas e centrar-se principalmente nas interações célula-patógeno únicas. Enquanto modelos animais deve ser utilizado com precaução e limitada a questões muito específicas e relevantes, modelos de ratos proporcionam uma boa perspectiva sobre a resposta imune mamífero in vivo e pode dirigir peças de questões clínicas importantes ^7.

Nas vias respiratórias, a comunidade microbiana é complexo que associa um grande número de diferentes microrganismos ^6. Enquanto que constitui um microbiome "normal" via aérea continua a ser determinado, comunidades residentes são frequentemente polimicrobiana, e originam a partir de diversas fontes ecológicos. Os pacientes com doença crônica supurativa pulmonar (fibrose cística, bronchectasis) ou pacientes sob ventilação mecânica apresentam uma flora especial devido à colonização das vias aéreas por microrganismos ambientalmente adquiridos ^9. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans são ambos problema patógenos ^5, freqüentemente isolado em conjunto a partir de amostras traqueobrônquicos , e responsável de infecção oportunista grave nesses pacientes, especialmente na unidade de terapia intensiva (UTI) ^4.

O isolamento desses microrganismos durante pneumonia aguda em resultados de UTI no tratamento anti-microbiano contra P. b aeruginosaut levedura geralmente não são considerados patogênicos neste local ^5. in vitro interações entre P. aeruginosa e C. albicans têm sido amplamente relatado e mostraram que esses microrganismos podem afectar o crescimento e a sobrevivência de outro, mas estudos não foi possível concluir se a presença de C. albicans é prejudicial ou benéfica para o hospedeiro ^10. Mouse modelos foram desenvolvidos para abordar esta relevância do P. aeruginosa e C. albicans in vivo, mas a interação entre microrganismos não foi o ponto-chave. De facto, o modelo foi estabelecido para avaliar o envolvimento da C. albicans na resposta imune do hospedeiro, e resultado.

Um modelo anterior estabelecida por Roux et ai já utilizada uma colonização inicial com C. albicans seguido de uma infecção pulmonar aguda induzida por P. aeruginosa. Usando seu modelo, os autores encontraram um papel deletério da prior C. albicans colonização ^11. No entanto Roux et al utilizaram uma carga elevada de C. albicans em seu modelo com 2 x ¹⁰ 6 CFU / rato durante 3 dias consecutivos. Nós estabelecemos um modelo de 4 dias de C. colonização das vias aéreas albicans, ou pelo menos persistência sem lesão pulmonar, Neste modelo C. albicans foi recuperado até 4 dias após uma única instilação de 10 ⁵ CFU por ratinho (Figura 2B) ^12,13. Após 4 dias, não se observou qualquer evidência de recrutamento de células inflamatórias, a produção de citoquinas inflamatórias, nem dano epitelial. Em 24-48 horas, na presença de pico de C. albicans, apesar de uma resposta imune inata celular e de citoquina foi observada, não houve evidência de lesão pulmonar. Surpreendentemente, os murganhos assim colonizada com C. albicans 48 horas antes da instilação intranasal de P. aeruginosa tinham infecção atenuada em comparação com ratinhos com P. aeruginosa infecção sozinho. Euom efeito, os ratinhos exibiram menor lesão pulmonar e diminuição da carga bacteriana ^12,13.

Várias hipóteses poderiam explicar o efeito benéfico da colonização prévia com C. albicans em P. aeruginosa mediada por infecção pulmonar aguda. Primeiro, um cross-talk entre espécies envolvendo cada microorganismos sistemas de sensoriamento quorum, o P. baseada homoserinelactone sistema aeruginosa e C.-base de farnesol sistema albicans, foram avaliados. Em segundo lugar, C. foi estudada albicans agindo como um alvo "chamariz" para P. aeruginosa desviar o agente patogénico a partir de células epiteliais do pulmão. Ambas as hipóteses foram invalidados (dados não publicados). A terceira hipótese era a de um "priming" do sistema imune inato por C. albicans responsável por uma resposta inata subsequente reforçada contra P. aeruginosa. Esta última hipótese foi confirmada. Na verdade C. colonização albicans levou a uma iniciação da imunidade inata atraGH IL-22, segregada principalmente pelas células linfóides inatos, resultando num aumento da depuração bacteriana e reduziu a lesão pulmonar ^12.

Em conclusão, o anfitrião é um ator central na interação entre microrganismos modulação da resposta imune inata e que envolvam diferentes tipos de células inflamatórias. Embora estas interacções imunes complexas podem ser dissecados in vitro as hipóteses iniciais só pode ser fornecida por adequado em modelos in vivo. O protocolo seguinte fornece um exemplo de estudo in vivo de interacção hospedeiro-patogénio mediada que pode ser adaptado a outros microrganismos.

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Protocolo

A ética regionais comitê regional de experimentos com animais aprovou este método, de acordo com atenção nacional e internacional de animais e uso de diretrizes de pesquisa experimentais.

Coleção 1. Amostra

1. Armazenamento das amostras
   1. Colher todas as amostras e imediatamente armazenar a - 20 ° C ou em gelo até o armazenamento do congelador para evitar a deterioração. Coloque fosfato estéril tamponado salino (PBS) em gelo para melhorar lavagens bronco-alveolar desempenho (BAL).
2. Cirurgia
   1. Esterilizar todos os equipamentos cirúrgico usando um autoclave.
      NOTA: Se possível, recomenda-se usar dois diferentes conjuntos de instrumentos para as etapas abdominal e torácica para evitar a contaminação cruzada. Equipamento de dissecção necessárias é detalhado na Figura 4A

2. Mice, bacterianas e de levedura Estirpes

1. Os ratos domésticos em conformidade com a utilização de animais em locais reDirectrizes do comitê de pesquisa em um rack ventilado sem exceder 5 ratos por gaiola, com comida e água ad lib, em uma instalação de alojamento nível de biossegurança 2 devido ao uso de Nível de Biossegurança 2 microrganismos: P. aeruginosa e C. albicans.
2. Manter as estirpes bacterianas a -80 ° C em 40% de meio de glicerol.
   1. Adicionar bactérias diretamente do estoque congelado em tubo de cultura contendo 3 ml de caldo de Luria estéril-Bertani usando um loop de inoculação de 10 ul. Deixar O / N a 37 ° C com agitação orbital (400 rpm) no dia antes da instilação.
   2. Colheita bactérias por centrifugação a 2000 xg durante 5 min.
   3. Aspirar o sobrenadante para uma eliminação de resíduos perigosos fechado apropriado. Observar aderente sedimento branco no fundo do tubo de cultura.
   4. Lavar e suspender o sedimento utilizando 5 ml de PBS.
   5. Repita os passos 2.2.2 a 2.2.3 uma segunda vez para efectuar uma segunda lavagem.
   6. Ressuspender as bactérias sedimentadas utilizando 1 mL de PBSe breve vórtice.
   7. Determinar a densidade de inoculo usando densitómetro óptica a 600 nm utilizando um medidor de densidade óptica. Uma densidade de 0,9 corresponde a 10 ⁹ CFU / ml para PAO1, dilui-se em conformidade.
      NOTA: Este resultado tem que ser obtida para cada estirpe utilizada por determinação da densidade de diluições sucessivas de um inoculo calibrado.
   8. Verifique se o inóculo por diluições logarítmicas em série e placa 100 ul de cada diluição em agar roxo bromocresol (BCP) placas e cultura O / N. Administrar cada ratinho por via intranasal a 50 ul de solução contendo 1 x 10 ⁸ para 2 x10 ⁸ CFU por ml (5 x 10 ⁶ para 1 x 10 ⁷ CFU por ratinho).
3. Use C. albicans SC5314 como uma estirpe de referência. Conserve a estirpe em 40% de meio de glicerol a -80 ° C.
   1. Suplemento caldo de levedura-peptona-Dextrose com 0,015% de amicacina para evitar a contaminação bacteriana e facilitar ainda mais a contagem.
   2. Adicione o fermento usando 10 &# 181; l laço inoculação em caldo preparado YPD-suplementado com amicacina O / N a 37 ° C.
   3. Levedura colheita por centrifugação a 2000 xg durante 5 min.
   4. Remover o sobrenadante em uma eliminação de resíduos bioharzard apropriado. Branco aderente sedimento deve ser observado na parte inferior do tubo de cultura.
   5. Lave e suspender as bactérias peletizadas usando 5 ml de PBS e breve vórtice.
   6. Repita os passos 2.2.2 a 2.2.3 uma segunda vez para efectuar uma segunda lavagem.
   7. Ressuspender o sedimento utilizando 1 mL de PBS e breve vórtice.
   8. Determinar o tamanho do inoculo pela contagem num hematocytometer Mallassez usando um microscópio padrão em ampliação de 40x.
      NOTA: A concentração (em UFC / ml) é obtido usando a seguinte fórmula: (número de levedura ⁵ x 10) / (número de rectângulos de grelha contados no hematocytometer Mallassez).
   9. Verifique por diluição em série logarítmica a 10 ^-5 e ^-6 10 para confirmar que a solução contém 2 x 10 ⁶ CFU / mL.
   10. Placa em placas de YPD-agar suplementado com 0,015% de amicacina.

3. Airways Colonização por C. albicans

NOTA: Depois de adaptação ambiental, os ratos são pesados ​​duas vezes por dia.

1. Sob um exaustor, para depósito de 500 mL de sevoflurano em um 4 cm x 4 cm de gaze (técnica-drop aberto) ^14.
   1. Colocar imediatamente a gaze sobre o chão de uma câmara de aproximadamente 750 ml de indução. Imediatamente coloque uma plataforma elevada de malha acima da gaze para evitar o contato direto entre o animal ea gaze.
   2. Feche tampa hermética e esperar 1-2 min para permitir a difusão do sevoflurano na câmara.
   3. Transferir o mouse de gaiola em malha plataforma e feche a tampa. Anestesia leve com respiração espontânea conservado deve ser alcançado em 30 a 45 seg.
   4. Monitor para hipotonia, observando a perda do reflexo de endireitamento altura em que o rato pode ser removido from da caixa e incutiu.
2. Instilação intranasal (pode ser realizada em 10 segundos por um operador treinado).
   1. Segure o mouse com uma mão situado em sua parte traseira em posição vertical (Figura 4B).
   2. Usando o dedo indicador, o apoio de cabeça e usar o polegar para manter a mandíbula fechada para evitar a expectoração (Figura 4C).
   3. Conforme descrito no passo 2.3.8, garantir que o preparado C. albicans solução contém 2 x10 ⁶ CFU por ml durante 50 ul incutidos volume.
      NOTA: O segundo ponto crítico é o volume instilado. Um volume menor do que 50 ul poderia resultar em uma colonização insuficiente ou instilação não homogêneo de vias aéreas, um volume maior pode induzir afogamento / asfixia e morte.
   4. Incutir o mouse intra-nasal, abordando a pipeta para as narinas.
   5. Pipetar uma gota de 50 ul a formação de uma bolha contendo a solução sobre as narinas, posteriormente inalada pelo spontaneously do mouse respiração.
   6. Coloque o rato em uma área de recuperação (por exemplo, uma gaiola grande nu bem arejada com uma lâmpada de aquecimento em cima). Os ratos devem ser monitorizados até despertar completo. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal e reflexo de endireitamento. Neste ponto, o rato pode ser retornado para uma gaiola de habitação normal.

4. P. aeruginosa induzida por infecção pulmonar aguda

NOTA: Os ratos são pesados ​​durante os quatro dias seguintes. Normalmente, os ratos ganhar peso durante C. colonização das vias aéreas mediada albicans (Figura 2A).

1. Preparar a suspensão contendo P. aeruginosa o dia da instilação depois de O crescimento / N (ponto 2.2).
2. Anestesiar brevemente utilizando inalado sevoflurano como descrito acima (seção 3.1).
   NOTA: Para executar infecção pulmonar aguda, recomenda carga bacteriana são sugeridas emTabela 1.
3. Incutir o rato como descrito acima (seção 3.2), com especial atenção à recuperação pós-instilação.

5. Meça do Índice de Lesão Pulmonar

1. Prepara-se uma solução contendo albumina marcado com FITC. Injectar a solução 2 h antes de eutanásia animal.
   1. Pesar 0,2 mg de albumina-FITC com o equipamento apropriado.
   2. Adicionar 0,2 mg em 1 ml de PBS. Vortex brevemente. Se não for utilizado imediatamente, colocar a solução em papel alumínio para evitar a exposição à luz ambiente.
   3. Injectar intraperitonealmente 200 ul de solução de albumina marcada com FITC a cada rato.
2. Eutanásia
   1. Pesa-se a ratinhos para o último os dados de peso.
   2. Euthanize um único rato de acordo com o uso local de animais em orientações do comitê de investigação que usam uma injeção intra-peritoneal de uma overdose letal de pentobarbital: 300 � de 5,47% pentobarbital.
   3. Remover rato da gaiola e recebe linjeção Ethal pelo operador.
   4. Após a injecção, transferir o mouse sozinho para outra gaiola, escondido de todos os outros animais. Observe o mouse até ausência de movimento. Confirmar a morte é por falta de movimento, movimento particularmente respiratória, falta de pulso.
   5. Realizar a coleta cirúrgica de amostras em animais mortos, portanto, sem anestesia nem analgésicos.
3. Coleta de amostra cirúrgica: Estágio Torácica.
   NOTA: Para manter condições estéreis, toda a cirurgia é realizada utilizando equipamento estéril em um ambiente de nível de biossegurança 2.
   1. Aplicar etanol para a pele. Realize uma incisão na pele da linha média do esterno até meados abdômen com uma tesoura. De incise linha média ao longo da caixa torácica em ambos os lados. Dobra-se a pele de ambos os lados do tórax para visualizar a caixa torácica.
   2. Realizar uma incisão vertical da caixa torácica em ambos os lados subindo em direcção ao clavícula, a fim de ser capaz de reclinar a parede torácica anterior com toda a popaUM permitindo a visualização perfeita do coração e pulmões (Figura 5A, 5B).
   3. Recolha de sangue com uma seringa pré-heparined através de punção do coração próxima à artéria interventricular. Retirar um mínimo de 500 ul para se obter, pelo menos, 100 uL de plasma. Coloque a amostra de sangue no gelo.
   4. Realize uma incisão cervical na linha média para visualizar a traquéia (Figura 5B e 5C). Dissecar cuidadosamente a fáscia em torno da traquéia. Coloque um sutura atrás da traqueia (Figura 5C e 5D). Posteriormente, a sutura será fechada em torno da agulha canulação para assegurar a lavagem adequada.
   5. Cateterize a traqueia usando a 20-G modificado agulha de gavagem (Figura 5D e 4A). Dê um nó cirúrgico em torno da traqueia canulada com a sutura previamente colocado.
   6. Para executar lavagens broncoalveolares (LBA), suavemente e progressivamente injectar e extrair 500 ul de PBS gelado no / do pulmão. Colocar a amostra no ice para evitar a lise celular.
   7. Repetir o passo 5.3.6, 3 vezes para se obter um total de 1500 ul de fluido BAL e piscina amostras de lavagem para um tubo de centrífuga de 2 ml (Figura 5E).
   8. Remova os pulmões do peito. Coloque um segmento do pulmão (o tamanho que correspondem à metade de um pulmão ou um lóbulo) em 1,5 ml tubo de centrífuga e armazenar rapidamente a - 80 ° C.
   9. Coloque um segmento de pulmão em um tubo de hemólise pré-pesado contendo PBS para determinar a carga bacteriana e colocá-lo em gelo.
4. Coleta de amostra cirúrgica: Estágio abdominal.
   1. Execute outra incisão no lado esquerdo do abdômen. Observe o baço através do peritônio.
   2. Remover o baço e coloque em um segundo tubo de hemólise contendo 1 ml PBS e colocar no gelo.
5. Lung índice de lesão
   NOTA: a permeabilidade da membrana alvéolo-capilar é avaliada por medição marcado com FITC-albumina vazamento do compartimento vascular para o alvéolo-interstcompartimento itial.
   1. Centrifugar amostra de sangue e fluido BAL durante 10 min a 1.500 x g. Recolher os sobrenadantes para novos tubos de centrífuga. As pelotas de células de plasma correspondem a ou BAL recrutados e deve ser colocado sobre gelo.
   2. Adiciona-se 100 ul de cada sobrenadante de sangue (plasma, amarelo) ou BAL sobrenadante para uma placa de 96 poços transparentes (300 ul poços). Coloque uma folha sobre a placa se não for usado imediatamente.
   3. Medir os níveis de fluorescência do plasma e em sobrenadantes de BAL utilizando um leitor de microplacas de fluorescência (excitação, 487 nm; emissão, 520 nm).
   4. Determinação do índice de lesão pulmonar por meio do cálculo da taxa de fluorescência [(BAL sobrenadante / sangue sobrenadante) x 100].
6. Lavagem (BAL) contagem de células broncoalveolares diferencial.
   NOTA: Use o agregado de células obtidas a partir de centrifugação do LBA no passo 5.5.1.
   1. Se necessário, use-tampão de lise de glóbulos vermelhos. Adicionar 500 ul de tampão de lise de células vermelhas no tubo de centrífuga contendo o cell pellet. Resumidamente vórtice e deixar 10 min em gelo. Adicionar 500 mL PBS para parar de lise de células vermelhas.
   2. Células colheita por centrifugação durante 10 min a 1.500 x g. Remover o sobrenadante e suspender o sedimento de células em 1 ml de PBS estéril. Enumerar as células em um hematocytometer Mallassez. Usando um hemocitômetro para contagem de células. Concentre-se as células em um slide com uma cytospin.
   3. Células mancha usando kit coloração permitindo a identificação e contagem de células (macrófagos, linfócitos, neutrófilos).
7. Lung carga bacteriana e disseminação bacteriana
   NOTA: Para avaliar a carga bacteriana pulmão e disseminação de bactérias, pulmões e baço foram, respectivamente, recolhidos e armazenados em tubos de hemólise pré-pesadas contendo 1 ml de PBS (passo 5.3.9).
   1. Pesar tubos de hemólise contendo 1 ml PBS e ou pulmonares ou do baço. Homogeneizar as amostras com um homogeneizador de tecidos para se obter tecidos de pulmão homogeneizados de baço e homogeneizados.
   2. Deposite 100 l de homo tecidogenates em tubos de centrífuga contendo 900 ul de PBS estéril para obter diluições logarítmicas em série.
   3. Placa das duas últimas amostras diluídas adequadas (10 ^-3 e 10 ^-2) em ambos BCP-agar para P. aeruginosa ou agar YPD-amicacina suplementado para C. albicans pulmão e baço determinação carga.
   4. Incubar as placas de O / N a 37 ° C. No dia seguinte, enumerar as colónias em placas.
   5. Índice o resultado ao peso do pulmão para obter uma CFU por grama de pulmão. O tamanho das amostras de pulmão não são os mesmos, os resultados são expressos em CFU por grama de pulmão.
      Fórmula para o índice é: [UFC] x [peso do tubo de hemólise e de pulmão] - [peso do tubo de hemólise].

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Resultados

Como visto anteriormente durante a descrição do protocolo, o experimento precisa de cinco dias para ser concluído (Figura 1: Experiência linha do tempo). Um operador é solicitado durante toda a execução do experimento e pode lidar com os processos até um máximo de 10 ratos. Se forem necessários mais animais, duas pessoas são necessários particularmente para coleta de amostras cirúrgico. Na verdade todas as amostras devem ser recolhidos em menos de 2 horas para evitar um aumento da fuga de a...

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Discussão

Modelos animais, particularmente mamíferos, são úteis para elucidar os mecanismos complexos de interacção hospedeiro-patogénio nas áreas de imunidade. Claro, a necessidade de informações obtidas somente a partir de modelos animais deve ser essenciais; caso contrário, a utilização de animais devem ser substituídos por modelos in vitro. Este modelo animal ilustra a percepção de que só pode ser fornecida por um modelo animal uma vez que a interacção entre agentes patogénicos é mediada por uma r...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevorane, Sevoflurane	Abott	05458-02	250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940	Berthold Technologies	reference in first column	no comment
Bromo-cresol purple agar	Biomerieux	43021	20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47%	CEVA	6742145	100 ml plastic bottle
2-headed valve	Distrimed	92831	no comment
Sterile inoculation loop 10 µl	Dutscher	10175	x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml	Dutscher	30003	per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml	Dutscher	64300	no comment
Ultrospec 10	General Electric life sciences	80-2116-30	no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Life technologies	10010023	packaged in 500 ml
amikacin 1 g	Mylan	62516778	per 10
Heparin 10,000 UI in 2 ml	Pan pharma	9128701	10x per unit
RAL 555 coloration kit	RAL Diagnostics	361550	3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube	Sarstedt	55.526.006	x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate	Sarstedt	82 1581500	no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth	Sigma	95763	in powder
FITC-albumin	Sigma	A9771	in powder
Luria Bertani Broth	Sigma	L3022	in powder
25-gauge needle	Terumo or unisharp	A231	x 100 conditioning
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	no comment