Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Zusammenfassung

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Zusammenfassung

Studieren Wirt-Pathogen-Interaktion ermöglicht es uns, die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenität bei mikrobiellen Infektion zu verstehen. Die Prognose der Host davon abhängt, dass einer angepassten Immunantwort gegen das Pathogen ^1. Immunantwort ist komplex und Ergebnisse aus der Interaktion der Erreger und verschiedene Immun- oder Nicht-Immunzelltypen ^2. In-vitro-Studien kann nicht zeichnen diese Interaktionen und konzentrieren sich auf die Zell-Pathogen-Interaktionen. Darüber hinaus ist in dem Atemweg ^{3, besonders} bei Patienten mit eitrigen chronischen Lungenerkrankungen oder bei beatmeten Patienten, vorliegen polymicrobial Gemeinden und komplizieren Wirt-Pathogen-Interaktion. Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans sind beide Probleme Pathogene ^4, häufig tracheobronchial Proben isoliert, und bis schweren Infektionen, insbesondere in der Intensivstation ^5. Mikrobielle Interaktionenzwischen diesen Erregern in vitro berichtet worden, aber die klinische Bedeutung dieser Wechselwirkungen bleibt unklar ^6. Die Wechselwirkungen zwischen C. Albicans und P. studieren aeruginosa, ein Mausmodell der C albicans airways Kolonisierung, gefolgt von einem P. aeruginosa- vermittelten akuten Lungeninfektion durchgeführt wurde.

Einleitung

Tiermodelle, vor allem Mäuse, wurden ausgiebig verwendet, um Immunantworten gegen Pathogene zu erkunden. Obwohl angeborenen und erworbenen Immunität unterscheiden zwischen Nagern und Menschen ^7, die Leichtigkeit in der Züchtung und der Entwicklung von Knockouts für zahlreiche Gene, stellen Mäusen ein hervorragendes Modell, um Immunantworten ⁸ studieren. Die Immunreaktion ist komplex und resultiert aus der Wechselwirkung eines Erregers, die ansässigen mikrobiellen Flora und mehrere Immun (Lymphozyten, Neutrophilen, Makrophagen) und nicht-immune (Epithelzellen, Endothelzellen) ^{Zelltypen. 2} In vitro-Untersuchungen erlauben nicht beobachtet Diese komplexen Interaktionen und vor allem auf einmalige zell Pathogen-Interaktionen. Während Tiermodelle müssen mit Vorsicht verwendet und auf sehr spezifische und relevante Fragen beschränken, bieten Mausmodellen einen guten Einblick in den Säuger-Immunantwort in vivo und können Teile der wichtigen klinischen Fragen ⁷ anzugehen.

in den Atemwegen ist die Mikrobengemeinschaft komplexe Bindung einer großen Anzahl von verschiedenen Mikroorganismen ^6. Während, was eine "normale" Atemwegs microbiome noch bestimmt werden, ansässig sind Gemeinden häufig polymikrobiellen, und stammen aus verschiedenen ökologischen Quellen. Patienten mit eitriger chronischer Lungenerkrankung (zystische Fibrose, bronchectasis) oder beatmeten Patienten weisen eine besondere Flora aufgrund der Besiedelung der Atemwege durch umwelt erworbene Mikroorganismen ^9. Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans sind beide Problemerreger ^5, häufig tracheobronchial Proben zusammen isoliert und verantwortlich für schwere opportunistische Infektion bei diesen Patienten, insbesondere in der Intensivstation (ICU) ^4.

Isolation dieser Mikroorganismen während einer akuten Lungenentzündung auf der Intensivstation führt antimikrobielle Behandlung gegen P. aeruginosa but Hefe werden normalerweise nicht an dieser ^Stelle 5 als pathogen angesehen. In vitro Wechselwirkungen zwischen P. aeruginosa und C. albicans wurden weithin berichtet und gezeigt, dass diese Mikroorganismen das Wachstum und das Überleben von einander beeinflussen, aber Studien konnte nicht schließen, wenn die Anwesenheit von C. albicans ist schädlich oder nützlich für den Host ^10. Mausmodelle wurden entwickelt, um dieses Relevanz von P. Adresse aeruginosa und C. albicans in vivo, aber die Wechselwirkung zwischen Mikroorganismen war nicht der entscheidende Punkt. In der Tat wurde das Modell etabliert, um die Beteiligung von C. bewerten albicans in Wirtsimmunantwort und Ergebnis.

Eine Vorgängermodell von Roux et al fest bereits eine erste Besiedlung mit C eingesetzt albicans, gefolgt von einer akuten Lungeninfektion durch P. induzierte aeruginosa. Mit ihrem Modell, fanden die Autoren eine schädliche Rolle von prior C. albicans Kolonisation ^11. Allerdings verwendet Roux et al eine hohe Belastung von C. albicans in ihrem Modell mit ² × 10 6 CFU / Maus während 3 aufeinanderfolgenden Tagen. Wir haben eine 4-Tage-Modell der C albicans Atemwege Kolonisierung oder zumindest Persistenz ohne Lungenverletzung, in diesem Modell C. albicans wurde bis zu 4 Tage nach einer einzelnen Instillation ^von 10 5 CFU pro Maus (2B) ^12,13 abgerufen. Nach 4 Tagen wurden keine Beweise von entzündlichen Zellrekrutierung, entzündliche Zytokin-Produktion noch Epithelschädigung beobachtet. Bei 24 - 48 h, auf dem Höhepunkt Vorhandensein von C. albicans, obwohl eine zelluläre und Zytokin angeborenen Immunantwort beobachtet wurde, gab es keine Anzeichen einer Lungenverletzung. Überraschenderweise Mäusen so mit C. kolonisiert albicans 48 h vor dem Einträufeln der P. intranasale aeruginosa-Infektion hatte abgeschwächt im Vergleich zu Mäusen, die mit P. aeruginosa-Infektion allein. ichndeed zeigten Mäuse geringere Lungenschädigung und verminderte Bakterienlast ^12,13.

Mehrere Hypothesen könnte diese positive Wirkung von vor Besiedlung mit C. erklären albicans auf P. aeruginosa vermittelten akuten Lungeninfektion. Zunächst wird eine Interspezies-Übersprechen mit jeweils Mikroorganismen Quorum-Sensing-Systeme, die homoserinelactone basierte P. aeruginosa-System und das Farnesol basierten C. albicans System wurden ausgewertet. Zweitens C. albicans als "Lockvogel" Ziel für P. aeruginosa Umleitung des Erregers aus Lungenepithelzellen handeln untersucht. Beide Hypothesen (unveröffentlichte Daten) für ungültig erklärt. Die dritte Hypothese war, dass der "Priming" des angeborenen Immunsystems durch C. albicans für eine verbesserte Folge angeborenen Antwort gegen P. verantwortlich aeruginosa. Diese letzte Hypothese wurde bestätigt. Tatsächlich C. albicans Kolonisierung führte zu einem Priming der angeborenen Immunität through IL-22, vor allem von angeborenen lymphoiden Zellen sezerniert wird, was zu einer erhöhten bakteriellen Clearance und einer verminderten Lungenverletzung ^12.

Zusammenfassend ist der Host ein zentraler Akteur in der Interaktion zwischen Mikroorganismen Modulation der angeborenen Immunantwort und die verschiedene Entzündungszelltypen. Während diese komplexe Immun Wechselwirkungen können in vitro präpariert werden die anfänglichen Hypothesen kann nur durch geeignete In-vivo-Modellen zur Verfügung gestellt werden. Das folgende Protokoll zeigt ein Beispiel der in vivo-Untersuchung von Wirt-Pathogen-vermittelte Wechselwirkung, um andere Mikroorganismen angepasst werden kann.

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Protokoll

Die regionale Ethik-Regionalkomitee für Tierversuche hat diese Methode zugelassen, in Übereinstimmung mit nationalen und internationalen Tierpflege und die Verwendung in experimentellen Forschungs Richtlinien.

1. Probenentnahme

1. Probenlagerung
   1. Sammeln Sie alle Proben und sofort speichern bei - 20 ° C oder auf Eis, bis Tiefkühllagerung, um eine Verschlechterung zu vermeiden. Platzieren steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf Eis zu bronchoalveoläre Lavage (BAL) Leistung zu verbessern.
2. Chirurgie
   1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräten unter Verwendung eines Autoklaven.
      HINWEIS: Wenn möglich, empfiehlt es sich, zwei verschiedene Sätze von Instrumenten für die Bauch- und Brust Schritte verwenden, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Erforderlich Dissektion Ausrüstung ist in 4A detailliert

2. Mäuse, Bakterien- und Hefestämmen

1. Hausmäuse unter Beachtung der örtlichen Verwendung von Tieren in reFindungsausschuss Richtlinien in einem belüfteten Rack, ohne mehr als 5 Mäuse pro Käfig mit Futter und Wasser ad lib, in einer biologischen Sicherheitsstufe 2 Gehäuse Anlage durch den Einsatz von Biosicherheitsstufe 2 Mikroorganismen: P. aeruginosa und C. albicans.
2. Halten die Bakterienstämme bei -80 ° C in 40% Glycerin-Medium.
   1. In Bakterien direkt aus der Tiefkühllagerung in Kulturröhrchen mit 3 ml sterilem Luria-Bertani-Brühe unter Verwendung einer 10 & mgr; Impföse. Lassen Sie O / N bei 37 ° C mit kreisförmigem Schütteln (400 rpm) am Tag vor dem Einträufeln.
   2. Ernte Bakterien durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min.
   3. Den Überstand aspirieren in einen geeigneten geschlossenen biohazard Abfallentsorgung. Beobachten weißen haft Pellet am Boden des Kulturröhrchen.
   4. Waschen und das Pellet mit 5 ml PBS suspendieren.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2, ein zweites Mal, um einen zweiten Waschführen 2.2.3.
   6. Resuspendieren der pelletierten Bakterien unter Verwendung von 1 ml PBSund kurzem Vortexen.
   7. Bestimmen Sie die Inokulumdichte mit optischen Densitometer bei 600 nm unter Verwendung eines optischen Dichtemessgerät. Eine Dichte von 0,9 entspricht 10 ⁹ CFU / ml für PAO1, verdünnter entsprechend.
      Hinweis: Dieses Ergebnis ist für jede verwendete Stamm durch Bestimmen der Dichte von aufeinanderfolgenden Verdünnungen einer kalibrierten Impfkultur erhalten werden.
   8. Stellen Sie sicher, das Inokulum durch serielle logarithmische Verdünnungen und Platte 100 ul jeder Verdünnung auf Bromkresolpurpur Agar (BCP) Platten und O / N-Kultur. Verwalten jeder Maus intranasal 50 ul der Lösung, die 1 x ^8-02 Oktober x10 ⁸ CFU pro ml (5 ^× 10 6, um 1 × 10 ⁷ KBE pro Maus).
3. Verwenden C. albicans SC5314 als Referenzstamm. Erhaltung der Spannung in 40% Glycerin-Medium bei -80 ° C.
   1. Ergänzen Hefe-Pepton-Dextrose-Brühe mit 0,015% Amikacin, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden und erleichtern die weitere Zählung.
   2. In Hefe unter Verwendung von 10 &# 181; l Impföse in vorbereitete YPD-Brühe mit Amikacin O / N ergänzt bei 37 ° C.
   3. Ernte Hefe durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min.
   4. Überstand entfernen, in einen geeigneten bioharzard Abfallentsorgung. Weiße haft Pellet sollte im Boden des Kulturröhrchen zu beobachten.
   5. Waschen und suspendieren die pelletierten Bakterien unter Verwendung von 5 ml PBS und kurzem Vortexen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2, ein zweites Mal, um einen zweiten Waschführen 2.2.3.
   7. Das Pellet mit 1 ml PBS und kurzem Vortexen.
   8. Bestimmen Sie die Größe des Inokulums durch Zählen auf einem Mallassez Zählkammer mit einem Standard-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung.
      HINWEIS: (Anzahl der Hefe x ¹⁰ & sup5;) / (Anzahl der gezählten Gitterrechtecke auf der Mallassez Zählkammer): Konzentration (in KBE / ml) wird mit der folgenden Formel erhalten.
   9. Stellen Sie sicher, durch serielle logarithmische Verdünnung auf ¹⁰ -5 und ¹⁰ -6 zu bestätigen, dass Lösung enthält 2 x 1⁰ 6 CFU / ml.
   10. Platte auf YPD-Agarplatten mit 0,015% Amikacin ergänzt.

3. Airways Colonization von C. albicans

HINWEIS: Nach der Umweltanpassung werden die Mäuse zweimal täglich gewogen.

1. Unter einer Abzugshaube, Kaution 500 ul Sevofluran auf einen 4 cm x 4 cm Gaze (open-Drop-Technik) ^14.
   1. Sofort platzieren die Gaze auf dem Boden eines etwa 750 ml Induktionskammer. Unmittelbar danach ist ein maschen erhöhten Plattform oberhalb der Gaze, um direkten Kontakt zwischen dem Tier und der Gaze zu vermeiden.
   2. Schließen luftdicht verschlossen, und warten Sie 1 bis 2 min, um die Diffusion von Sevofluran in der Kammer zu ermöglichen.
   3. Übertragen Sie die Maus von Käfig zu Plattform und Deckel schließen Netz. Licht Anästhesie mit konservierten Spontanatmung ist in 30 bis 45 Sekunden erreicht werden.
   4. Monitor für Hypotonie durch Beobachtung Verlust des Stellreflexes, an welchem ​​Punkt die Maus f entfernt werdenROM Die Box und eingeflößt.
2. Intranasale Instillation (Kann in 10 Sekunden von einem geschulten Bediener durchgeführt werden).
   1. Halten Sie die Maus einer Hand auf dem Rücken aufrecht gehalten (4B) gelegen.
   2. Verwendung Zeigefinger, unterstützen den Kopf und verwenden Sie den Daumen, um den Kiefer geschlossen zu halten, um Auswurf (4C) zu vermeiden.
   3. Wie es in Schritt 2.3.8 beschrieben ist, sicherzustellen, dass die hergestellte C. albicans Lösung enthält 2 x10 ⁶ KBE pro ml für eine 50 & mgr; eingeflößt Volumen.
      HINWEIS: Der zweite kritische Punkt ist die eingeträufelten Volumen. Ein Volumen von weniger als 50 & mgr; l könnte zu einer unzureichenden Besiedelung oder inhomogene Einträufeln von Atemwegs Ergebnis kann ein größeres Volumen Ertrinken / Ersticken und Tod verursachen.
   4. Vermitteln die Maus intranasal durch Annäherung an die Pipette, um die Nasenlöcher.
   5. Pipettieren von 50 ul Tropfen bildet eine Blase, die die Lösung auf die Nasenlöcher, anschließend vom spontaneousl inhalierty Atmung Maus.
   6. Bewegen Sie die Maus in einem Recovery-Bereich (zB eine große, gut belüftet nackten Käfig mit einem Overhead-Wärmelampe). Mäuse müssen bis zum vollständigen Aufwachen überwacht werden. Haben ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend Bewusstsein Brustlage und Aufrichtungsreflexes aufrechtzuerhalten wiedererlangt. An dieser Stelle können Sie die Maus auf eine normale Gehäusekäfig zurückgebracht werden.

4. P. aeruginosa induzierten akuten Lungenentzündung

HINWEIS: Die Mäuse werden während der vier folgenden Tagen gewogen. Normalerweise Mäuse an Gewicht während C. albicans -vermittelte Atemwege Kolonisierung (2A).

1. Bereiten Sie die Suspension, die P. aeruginosa der Tag der Instillation nach O / N-Wachstum (Abschnitt 2.2).
2. Kurzzeitig betäuben Verwendung inhaliert Sevofluran, wie oben (Abschnitt 3.1) beschrieben.
   WICHTIG: Um akute Lungenentzündung durchzuführen, empfiehlt bakterielle Belastung in vorgeschlagenTabelle 1.
3. Vermitteln die Maus wie oben (Abschnitt 3.2) mit besonderem Augenmerk auf post-Instillation Recovery beschrieben.

5. Messen der Lungenschädigung Index

1. Bereiten Sie eine Lösung, die FITC-markierten Albumin. Spritzen Sie diese Lösung 2 h vor der Einschläferung.
   1. Man wiegt 0,2 mg Albumin-FITC mit der entsprechenden Ausrüstung.
   2. In 0,2 mg in 1 ml PBS. Vortexen. Wenn es nicht sofort verwendet wird, legen Sie die Lösung in der Folie, um die Exposition gegenüber Umgebungslicht zu vermeiden.
   3. Injizieren intraperitoneal 200 ul FITC-markiertem Albumin-Lösung in jede Maus.
2. Euthanasie
   1. Wiegen der Mäuse für die letzte Gewichtsdaten.
   2. Euthanize eine einzige Maus in Übereinstimmung mit den örtlichen Einsatz von Tieren in der Forschung Ausschuss Leitlinien mit einer intraperitonealen Injektion einer tödlichen Überdosis Pentobarbital: 300 ul 5,47% Pentobarbital.
   3. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und nimmt lEthal Injektion durch Bediener.
   4. Nach der Injektion, übertragen Sie die Maus alleine an einen anderen Käfig, von anderen Tieren versteckt. Beachten Sie die Maus, bis Abwesenheit von Bewegung. Tod zu bestätigen ist durch Abwesenheit von Bewegung, vor allem Atembewegung, mangelnde Impuls.
   5. Chirurgische Entnahme von Proben auf tote Tiere, also ohne Betäubung oder Schmerzmittel.
3. Chirurgische Probensammlung: Thoracic Bühne.
   WICHTIG: Um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden alle Operationen durchgeführt unter Verwendung von sterilen Geräten in einem biologischen Sicherheitsstufe 2 Umwelt.
   1. Gelten Ethanol zu der Haut. Führen Sie eine Mittellinie Hautschnitt vom Brustbein bis Mitte Leib mit einer Schere. Von der Mittellinie incise entlang der Brustkorb auf beiden Seiten. Klappen Sie die Haut auf beiden Seiten des Brustkorbes, den Brustkorb zu visualisieren.
   2. Führen Sie eine vertikale Inzision des Brustkorbs auf beiden Seiten hinauf in Richtung der Schlüsselbeine, um in der Lage, den gesamten vorderen Brustwand mit dem Heck zurücklehnen seinum so die perfekte Visualisierung von Herz und Lunge (Abbildung 5A, 5B).
   3. Blutentnahme mit einem Pre-heparined Spritze durch Punktieren das Herz neben dem interventrikulären Arterie. Zurückzuziehen mindestens 500 & mgr; l auf mindestens 100 & mgr; l Plasma zu erhalten. Legen Sie die Blutprobe auf Eis.
   4. Führen Sie eine Mittellinie Hals-Schnitt, um die Luftröhre (5B und 5C) zu visualisieren. Sorgfältig sezieren die Faszie rund um die Luftröhre. Legen Sie eine Naht hinter der Luftröhre (Abbildung 5C und 5D). Anschließend wird das Nahtmaterial wird rund um die Kanülierung Nadel geschlossen werden, um die ordnungsgemäße Spülung zu gewährleisten.
   5. Katheterisieren die Luftröhre mit Hilfe der 20-G modifizierten Sondennadel (5D und 4A). Binden Sie einen chirurgischen Knoten um den kanülierten Luftröhre mit dem zuvor platzierten Naht.
   6. Um BAL (BAL) durchzuführen, sanft und progressiv zu injizieren und zeichnen 500 ul eiskaltem PBS in die / aus der Lunge. Legen Sie die Probe auf ice, zelluläre Lyse zu vermeiden.
   7. Wiederholen Sie Schritt 5.3.6, 3-mal, um insgesamt 1500 ul BAL-Flüssigkeit und Pool Spülungsproben in ein 2 ml-Zentrifugenröhrchen (5E) zu erhalten.
   8. Entfernen Sie die Lunge aus der Brust. Legen Sie ein Lungensegment in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen (Größe sollte auf die Hälfte der eine Lunge oder eine Keule entsprechen) und schnell speichern bei - 80 ° C.
   9. Legen Sie ein Lungensegment in ein vorher gewogenes Hämolyse Röhrchen mit PBS, um bakterielle Belastung zu bestimmen, und legen Sie es auf Eis.
4. Chirurgische Probensammlung: Bauch Bühne.
   1. Erneute Einschnitt auf der linken Seite des Bauches. Beachten Sie die Milz durch das Peritoneum.
   2. Entfernen Sie die Milz und in einen zweiten Hämolyse Röhrchen mit 1 ml PBS und auf Eis.
5. Lungenschädigung Index
   HINWEIS: Alveolar-Kapillar-Membrandurchlässigkeit wird durch Messung beurteilt FITC-markierten Albuminverlust aus dem Gefäßraum in den Alveolar-interstentbindet Fach.
   1. Centrifuge Blutprobe und BAL-Flüssigkeit für 10 Minuten bei 1500 x g. Sammeln Sie die Überstände in neue Zentrifugenröhrchen. Die Pellets entsprechen rekrutiert Plasma oder BAL-Zellen und sollte auf Eis gelegt werden.
   2. Zugabe von 100 ul von jeder Blutüberstand (Plasma, gelb) oder BAL Stand bis zu einer 96-Well-transparente Platte (300 ul wells). Legen Sie eine Folie auf der Platte, wenn es nicht sofort verwendet.
   3. Messen Fluoreszenzwerte im Plasma und BAL Überständen unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (Anregung 487 nm; Emission, 520 nm).
   4. Bestimmen Sie die Lungenschädigung Index durch die Berechnung der Fluoreszenzverhältnis [(BAL Stand / Blutüberstand) x 100].
6. Bronchiallavage (BAL) Differentialzellzählung.
   HINWEIS: Verwenden Sie das Zellpellet aus der Zentrifugation der BAL-Flüssigkeit erhalten in Schritt 5.5.1.
   1. Verwenden Sie bei Bedarf roten Zelllysepuffer. Gib 500 ul Erythrozyten Lysepuffer in das Zentrifugenröhrchen, das die cell Pellets. Vortexen und lassen Sie 10 Minuten auf Eis. Fügen Sie 500 ul PBS bis rot-Zell-Lyse zu stoppen.
   2. Ernten der Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 1.500 x g. Überstand entfernen und die Aussetzung der Zellpellet in 1 ml sterilem PBS. Aufzuzählen Zellen auf einem Mallassez Zählkammer. Mit einem Hämacytometer um Zellen zu zählen. Konzentrat-Zellen auf einem Objektträger mit einer Cytospin.
   3. Stain-Zellen unter Verwendung Färbung Kit ermöglicht Zellidentifikation und count (Makrophagen, Lymphozyten, Neutrophile).
7. Lung bakterielle Belastung und bakteriellen Verbreitung
   ANMERKUNG: Um Lungen bakterielle Belastung und Verbreitung von Bakterien, Lunge und Milz zu beurteilen, wurden jeweils aufgefangen und in vorgewogene Hämolyseröhrchen mit 1 ml PBS (Schritt 5.3.9) gespeichert.
   1. Wiegen Hämolyse Röhrchen mit 1 ml PBS und entweder Lunge oder Milz. Homogenisierung der Proben mit einem Gewebe-Homogenisator, um Lungenhomogenaten und Milz Homogenaten zu erhalten.
   2. Zahlen Sie 100 ul Gewebe homogenates in Zentrifugenröhrchen mit 900 ul sterilem PBS bis zur Serien logarithmische Verdünnungen erhalten.
   3. Platte die beiden letzten geeigneten verdünnten Proben (10 ^{-3 und 10 -2)} entweder auf BCP-Agar für P. aeruginosa oder YPD-Amikacin-Agar ergänzt für C. albicans Lunge und Milz Belastung Bestimmung.
   4. Die Platten O / N bei 37 ° C. Am folgenden Tag, aufzuzählen, die Kolonien auf Platten.
   5. Index das Ergebnis zu Lungengewicht, um eine CFU pro Gramm Lungen erhalten. Lungenprobe Größen nicht gleich sind, die Ergebnisse sind in CFU pro Gramm Lungen ausgedrückt werden.
      Formel für den Index: [CFU] x [Gewicht der Hämolyse Röhre und der Lunge] - [Gewicht der Hämolyse Rohr].

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Ergebnisse

Wie während der Protokollbeschreibung zuvor gesehen, muss das Experiment 5 Tage auf (Abbildung 1: Experiment Timeline) zu vervollständigen. Ein Bediener während der gesamten Lauf des Experiments angeforderter und die Prozesse bis zu einem Maximum von 10 Mäusen Griff nach oben. Wenn mehrere Tiere erforderlich ist, werden zwei Personen besonders für chirurgische Probennahme erforderlich ist. In der Tat alle Proben müssen in weniger als 2 Stunden gesammelt werden, um eine erhöhte passive alveolären...

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Diskussion

Tiermodelle, insbesondere Säugetieren, nützlich sind, um komplexe Mechanismen der Wirt-Pathogen-Wechselwirkung in den Bereichen Immunität aufzuklären. Natürlich ist der Informationsbedarf, erhältlich nur aus Tiermodellen müssen wesentlich sein; Andernfalls muss die Verwendung von Tieren durch In-vitro-Modelle ersetzt werden. Dieses Tiermodell zeigt die Erkenntnis, dass nur von einem Tiermodell zur Verfügung gestellt werden kann, da die Wechselwirkung zwischen Pathogene wird durch Reaktion eines mehrkomp...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevorane, Sevoflurane	Abott	05458-02	250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940	Berthold Technologies	reference in first column	no comment
Bromo-cresol purple agar	Biomerieux	43021	20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47%	CEVA	6742145	100 ml plastic bottle
2-headed valve	Distrimed	92831	no comment
Sterile inoculation loop 10 µl	Dutscher	10175	x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml	Dutscher	30003	per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml	Dutscher	64300	no comment
Ultrospec 10	General Electric life sciences	80-2116-30	no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Life technologies	10010023	packaged in 500 ml
amikacin 1 g	Mylan	62516778	per 10
Heparin 10,000 UI in 2 ml	Pan pharma	9128701	10x per unit
RAL 555 coloration kit	RAL Diagnostics	361550	3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube	Sarstedt	55.526.006	x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate	Sarstedt	82 1581500	no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth	Sigma	95763	in powder
FITC-albumin	Sigma	A9771	in powder
Luria Bertani Broth	Sigma	L3022	in powder
25-gauge needle	Terumo or unisharp	A231	x 100 conditioning
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	no comment