A السريع المظهري العصبية نظام تسجيل النقاط لتقييم مرض في التقدم SOD1-G93A نموذج الفأر من ALS

Summary

This video protocol describes a sensitive, reliable, and quick method for evaluating the neuromuscular deficits in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.

Abstract

The SOD1-G93A transgenic mouse is the most widely used animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). At ALS TDI we developed a phenotypic screening protocol, demonstrated in video herein, which reliably assesses the neuromuscular function of SOD1-G93A mice in a quick manner. This protocol encompasses a simple neurological scoring system (NeuroScore) designed to assess hindlimb function. NeuroScore is focused on hindlimb function because hindlimb deficits are the earliest reported neurological sign of disease in SOD1-G93A mice. The protocol developed by ALS TDI provides an unbiased assessment of onset of paresis (slight or partial paralysis), progression and severity of paralysis and it is sensitive enough to identify drug-induced changes in disease progression. In this report, the combination of a detailed manuscript with video minimizes scoring ambiguities and inter-experimenter variability thus allowing for the protocol to be adopted by other laboratories and enabling comparisons between studies taking place at different settings. We believe that this video protocol can serve as an excellent training tool for present and future ALS researchers.

Introduction

منذ ذلك الحين تم تطويره في منتصف عام 1990 SOD1-G93A نموذج الفأر وراثيا النموذج الحيواني الأكثر استخداما على نطاق واسع من التصلب الوحشي الضموري (ALS) ^1. تم تصميم هذا النموذج الماوس المعدلة وراثيا وراثيا لبإفراط عن شكل متحولة من البشر النحاس / الزنك الفائق 1 (SOD1) الجين إيواء الجلايسين ALS المصاحب لطفرة ألانين في الأحماض الأمينية 93 (G93A). طفرة G93A هي واحدة من العديد من الطفرات في الجين SOD1 أن الماكياج بشكل جماعي ما يقرب من خمس حالات ALS العائلية ^2.

أصبح نموذج SOD1-G93A العمود الفقري للبحوث تطوير الأدوية ALS لأنه بالإضافة إلى الارتباط الجيني واضح لALS، فإنه يلخص العديد من الميزات المرضية من ALS في البشر مثل المحرك فقدان الخلايا العصبية، وضعف العضلات التدريجي وضمور، مع نهائي الشلل والموت ^3. رغم ذلك، كما هو الحال مع النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا في كثير من الأحيان، هناك ثنائية الأصيلتقلب استثارة المرتبطة الفئران SOD1-G93A. سكوت وآخرون. عقدت العزم على أن هناك حاجة إلى أفواج من 24 على الأقل الفئران متوازن بين الجنسين المطابقة القمامة في التصاميم دراسة نجاعة الأدوية من أجل التغلب على الضوضاء التي أنشأتها التغير البيولوجي ^4. عدد كبير من الحيوانات المطلوبة في هذه الدراسات في تركيبة مع تطور المرض عدوانية وضرورة المتابعة اليومية يحظر استخدام تقنيات تستغرق وقتا طويلا وربما المجهدة متقنة لقياس قوة العصبية والعضلية وظيفة (على سبيل المثال، الكهربائي، قوة قبضة، rotorod ، وما إلى ذلك). بدلا من ذلك، يسلط الضوء على الحاجة إلى المجراة الفحص أداة تقييم موثوق وظيفة العصبية والعضلية الفئران SOD1-G93A بطريقة سريعة.

في ALS TDI وضع بروتوكول يسمح لتقييم موثوق من وظيفة العصبية والعضلية الفئران SOD1-G93A في أقل من 30 ثانية في الماوس في المتوسط. هذا encompa بروتوكولSSES التقييم اليومي وظيفة hindlimb باستخدام نظام بسيط للجهاز العصبي التهديف (NeuroScore) الذي يوصف في هذا التقرير في الصحافة والفيديو. وتركز NeuroScore على وظيفة hindlimb بسبب العجز hindlimb هي أقرب ذكرت إشارة عصبية من المرض في الفئران SOD1-G93A ^5،6. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول التي وضعتها ALS TDI يقدم تقييما غير متحيز للظهور شلل جزئي (شلل خفيف أو الجزئي) والتقدم وشدة الشلل وأنها حساسة بما فيه الكفاية لتحديد التغيرات الناجمة عن المخدرات في تطور المرض.

Protocol

وتجرى جميع التجارب وفقا للبروتوكولات التي وصفها المعاهد الوطنية للصحة الدليل للرعاية واستخدام الحيوانات وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسي واستخدام ALS TDI و(IACUC).

1. الحيوانات، والإسكان، وتصميم الدراسة

ملاحظة: وقد اشتق الماوس مستعمرة SOD1-G93A من نسخة عالية B6SJLTgN (SOD1G93A) 1Gur سلالة تنتج في الأصل من قبل غرني ⁷ آخرون. ويجري حاليا الحفاظ على مستعمرة طريق عبور المعدلة وراثيا الذكور C57BL / 6-SJL مع من النوع البري الإناث C57BL / 6-SJL F1. يتم إنشاؤها الحيوانات F1 عن طريق عبور الذكور مع الإناث SJL B6. يتم شحن الفئران لأسبوعيا TDI ALS في 35-45 يوما من العمر.

1. السماح الفئران واحدة على الأقل في الأسبوع ليتأقلم إلى منشأة الحيوان (12 ساعة ضوء / دورة الظلام عند درجة حرارة من 18-23 درجة مئوية، والرطوبة 40-60٪) قبل تعيين لدراسة.
2. بيت الذكور SOD1-G93A هيئة التصنيع العسكريالبريد الماوس واحد في القفص، منذ كان يضم مجموعة من الذكور تميل للقتال. الفئران منزل الإناث SOD1-G93A ما يصل الى اثنين في القفص. توفير تخصيب البيئي، في شكل أكواخ بلاستيكية. توفير الغذاء والمياه الإعلانية بالمال وبالشهرة أيضا، إلا أن الفئران هي جزء من دراسة تتطلب إدارة المخدرات في مياه الشرب / الغذاء. في هذه الحالات، التموينية وسجل الغذاء والماء.
3. بدء دراسة فعالية الدواء اليوم حوالي سن 50 سنة، وتشمل 64 يقابل القمامة المتوازن بين الجنسين الفئران (32 في الجماعة). أخيرا، تأكد من أن يتمكن الباحثون الذين يجرون الدراسات وأعمى لظروف تجريبية.
   ملاحظة: من المستحسن أن تبدأ دراسة لفعالية الدواء نموذجية في اليوم سن 50 ولكن على أساس النوع من التدخل العلاجي أنه قد يكون من الأفضل أن تبدأ الدراسة في وقت سابق أو في وقت لاحق.
   ملاحظة: الدراسة هو مدعوم من 32 الفئران في فوج للكشف عن آثار المخدرات على أساس نوع الجنس. إذا ليس هناك حاجة لإجراء مقارنات على أساس نوع الجنس، وينبغي أن 24 الفئران في فوج تكفي للكشف عن آثار المخدرات عموما.

2. وزن الجسم

1. وزن الجسم قياسية لجميع الفئران في دراسات يوميا مع دقة عشر من الغرام. ملاحظة: وزن الجسم هو مؤشر حساس من تطور المرض وبأي توعك التي قد تنتج عن العلاج من تعاطي المخدرات المزمن.
2. وزن الجسم الماوس تختلف إلى حد كبير خلال يوم واحد، كانت أعلى في الصباح، وبالتالي تسجل لهم في نفس الوقت تقريبا كل يوم.

3. العصبية نظام تسجيل النقاط (NeuroScore)

1. أداء تقييم عشرات العصبية (NS) لكل فأر يوميا من خلال مراقبة الماوس وفقا للشروط الثلاثة التالية بالتتابع: أ) يتم تعليق الماوس بواسطة ذيله، ب) يسمح الماوس على المشي، وبعد ظهور شلل جزئي ج) يتم وضع الماوس على جانبها.
   1. لاختبار الذيل تعليق، مع الاستمرار على الماوس ما يقرب من 1.5 "من قاعدة الذيل على الجزء العلوي من سلك القفص وطنهم لمدة 1-2 ثانية، بعيدا عن حوض الطعام، في حين التوليدerving وhindlimbs. كرر الاختبار تعليق 3 مرات وتسجيل نتائج أكثر اتساقا.
   2. لاختبار المشي، ضع الماوس على سطح نظيف أن يوفر بعض الجر وعلى مسافة قريبة من 25 سم (على سبيل المثال، مسجلة منشفة ورقية لأسفل لمنع الانزلاق). السماح للماوس على المشي ما مجموعه 75 سم (طول 3X من منشفة ورقية) مع مراعاة مشية لها.
   3. ل"لا ارادي المقوم" اختبار، ضع الماوس على الجانب الأيسر أو الأيمن وباستخدام توقف ساعة قياس الوقت الذي يستغرقه لتصحيح نفسها دون مساعدة من كلا الجانبين. ملاحظة: تجربة واحدة فقط من هذا الاختبار هو مطلوب.
2. تحديد NS كل hindlimb (اليمين أو اليسار) بشكل مستقل على مقياس من 0 إلى 4. ملاحظة: على سبيل المثال على درجة من 0، 1 يشير إلى أن hindlimb اليسار NS هو 0، بينما الصحيح hindlimb NS هو 1.
3. تعيين عشرات العصبية (0-4) المقابلة ليلي مجموعة من الملاحظات (ملخص المنصوص عليها في الجدول رقم 1):
   1. تعيين NS 0 (قبل ظهور الأعراض) إذا لوحظ ما يلي: عندما يتم تعليق الماوس من ذيله، ويعرض hindlimb على تباعد العادي أي تمدد بشكل كامل بعيدا عن خط الوسط الأفقي ويبقى في هذا المنصب لمدة 2 ثانية أو لفترة أطول. عندما يسمح للماوس على المشي، لوحظ مشية طبيعية.
   2. تعيين NS 1 (الأعراض الأولى) إذا لوحظ ما يلي: عندما يتم تعليق الماوس من ذيله، ويعرض hindlimb وتباعد غير طبيعي، أي وانهارت أو جزئيا انهار نحو خط الوسط الجانبي أو فترتعد خلال الذيل تعليق أو يتم سحب ذلك / شبك. عندما يسمح للماوس على المشي، لوحظ مشية عادية أو بطيئة قليلا.
   3. تعيين NS 2 (بداية ظهور شلل جزئي) إذا لوحظ ما يلي: عندما يتم تعليق الماوس من ذيله، وhindlimb هو انهار جزئيا أو كليا، عدم تمديد بكثير. (قد يكون لا يزال هناك حركة المفاصل). عندما يسمح للماوس على المشي، يتم استخدام hindlimb ليذكره إلى الأمامايون إلا أن أصابع حليقة أسفل مرتين على الأقل خلال 90 سم مشيا على الأقدام أو أي جزء من القدم وسحب على طول أسفل القفص / الجدول. عندما يتم وضع الماوس على جانبها الأيسر والأيمن، وأنها قادرة على تصحيح نفسها في غضون 10 ثانية من كلا الجانبين.
   4. تعيين NS 3 (الشلل) إذا لوحظ ما يلي: عندما يتم تعليق الماوس من ذيله، وهناك شلل جامدة في hindlimb أو الحد الأدنى من حركة المفاصل. عندما يسمح للماوس على السير إلى الأمام هناك حركة لكن لا يتم استخدام hindlimb للحركة إلى الأمام. عندما يتم وضع الماوس على جانبها الأيسر والأيمن، وأنها قادرة على تصحيح نفسها في غضون 10 ثانية من كلا الجانبين. ملاحظة: نادرا، بعد ظهور شلل، قد يبدو البول الرطوبة على hindlimbs. تركت دون علاج رطوبة البول قد يؤدي إلى البول "الحرق" والآفات الجلدية. علاج البول الرطوبة عن طريق قص الشعر، وتطبيق تتسرب الماء الدافئ لإزالة البول، وصمة عار بلطف الجافة. إذا الآفات الجلدية موجودة تطبيق المضاداتمرهم التشنج.
   5. تعيين NS 4 (إنسانية نقطة النهاية) إذا لوحظ ما يلي: عندما يتم تعليق الماوس من ذيله، وهناك شلل جامدة في hindlimbs. عندما يسمح للماوس على المشي، لا يوجد أي حركة إلى الأمام. عندما يتم وضع الماوس على جانبها الأيسر والأيمن أنها ليست قادرة على تصحيح نفسها في غضون 10 ثانية من الجانب سواء. أي غياب المنعكس التقويمي.

4. دخول وتحليل البيانات

1. أثناء دراسة فعالية الدواء، أدخل البيانات التي تم جمعها عن كل فأر في مختبر نظام إدارة المعلومات (LIMS) أو إلى برنامج جداول البيانات المتاحة تجاريا.
   ملاحظة: LIMS البرمجيات المتقدمة TDI-ALS هو مستودع مركزي لجميع البيانات التي تم جمعها من الدراسات الداخلية، مما يجعل هذه البيانات يمكن الوصول إليها بسهولة مع مرور الوقت للمحققين ALS TDI. LIMS يتتبع أي فأر الفردية، مع ID فريدة من نوعها، والعودة إلى النسب، ووزن الجسم، أو النتيجة العصبية في جميع أيام الدراسة،ويشمل ذلك أي ملاحظات أخرى لاحظت أثناء ديمومته. LIMS يولد في نهاية المطاف جدول الذي يستخدم للتحليلات لاحقة.
2. عند الانتهاء من دراسة المخدرات فعالية، أي عندما تصل جميع الفئران إنسانية نقطة النهاية، والبرمجيات استخدام جداول البيانات (انظر الجدول من المواد) لحساب NS مجتمعة لكل الماوس، عن كل يوم عن طريق حساب متوسط ​​hindlimb اليسار واليمين NS . بعد ذلك، حساب متوسط ​​العمر في كل NS لكل الماوس وعدد الأيام تنفق كل الماوس في NS معين.
3. تحليل التغيرات الشاملة في NS مع مرور الوقت عن طريق استيراد البيانات من برنامج جداول البيانات إلى البرنامج الإحصائي (انظر جدول المواد). تناسب هذه البيانات باستخدام نموذج الانحدار اللوجستي الترتيبي الذي يقدر المتوقع NS، مع متوسط ​​العمر في NS والعلاج من تعاطي المخدرات عن الآثار في الانحدار. باستخدام سجل رتبة اختبار مربع كاي تقدير احتمال تأثير احتمال وتحديد ما إذا كان تأثير العلاج من تعاطي المخدرات في NS التقدم هو الإحصائيهام لاي (انظر ملف التعليمات البرمجية التكميلي للخطوة بخطوة تعليمات).
   ملاحظة: يعتبر A-قيمة P <0.05 دلالة إحصائية.
   ملاحظة: هذه الطريقة في التحليل الإحصائي يحترم طبيعة التراتبية البيانات NS والطبيعة المتغيرة لمسارات NS للفئران الفردية. يفضل بسبب الفردية مسارات NS يمكن أن تكون مختلفة بشكل ملحوظ مما أدى إلى NS المتوسطات مجموعة المرتبط الوقت الذي لا يعكس ردود NS بما فيه الكفاية. بالإضافة إلى ذلك، في بعض الحالات NS يمكن أن تتقلب، ولا سيما عندما تكون في نطاق صفر إلى واحد.
4. وأخيرا، استخدام البرمجيات الرسوم البيانية (انظر الجدول من المواد) لتوليد "ترتيبي المتوقعة NS مقابل متوسط ​​العمر عند NS" الرسوم البيانية للحيوانات المعالجة المخدرات والسيطرة (الشكل 2، وانظر ملف التعليمات البرمجية التكميلي للخطوة بخطوة تعليمات). استخدام هذه الرسوم البيانية لتقدير ملائم التحولات بين المجموعات المعالجة المخدرات وسيطرة التحريف من المحور الصادي متوسط ​​العمر من بداية ظهور أعراض المرض (ط.ه.، NS 2) على محور س.
   ملاحظة: الفرق في متوسط ​​العمر بين المجموعتين يمثل تحولا المخدرات التي يسببها ويتم التعامل كإجراء عملي لحجم تأثير.
   ملاحظة: التحولات اليمين في NS مقابل منحنى متوسط ​​العمر المتوقع تشير إلى تباطؤ تطور المرض أعراض. على العكس من ذلك، والتحولات نحو اليسار في NS مقابل منحنى متوسط ​​العمر المتوقع تشير إلى تسارع تطور المرض أعراض.

النتائج

درس البيانات نتيجة العصبية لمدة 90 ذكور و 94 إناث الفئران غير المعالجة SOD1-G93A في ALS TDI خلال قيمت 2014. وأظهرت النتائج أن الفئران الذكور وعادة ما يكون تطور المرض أكثر عدوانية من إناث الفئران، كما يتضح من نسبة أكبر من حياتها في NS 1 مقارنة مع الإناث. NS 2 و 3 NS تحدث مع تردد يساوي تقر...

Discussion

في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول الفيديو سريعة وبسيطة والتي، إذا ما طبقت بشكل صحيح، غير قادرة على تقييم موثوق تطور المرض في الفئران SOD1-G93A وتحديد التغيرات التي يسببها الدواء. بينما الجماعات المختلفة قد وضعت أنظمة التهديف المظهرية للفئران SOD1-G93A ^10/08، فإنهم غالبا ما...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	002726	Strain of mice used in this study
Breeders	Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA		Colony maintainance
Scale	Navigator OHAUS, Parsippany, NJ	Model N14120	Used to weigh mice
Nutra-GelH	Bio-Serv, Flemington, NJ	#S4798	Wet food provided to sick mice
Irradiated Lab Animal Diet	Harlan, Indianapolis, IN	2918-111914M	Chow diet
Lab-grade Sani-chips	Harlan Teklad, Indianapolis, IN	7090	Bedding
JMPH	SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC	v10.0.2	Statistical software
Microsoft Excel	Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA	Excel 2013 (v 15.0)	Spreadsheet software
GraphPad Prism 5	GraphPad software Inc., La Jolla, CA	v5.4	Graphing software
Mouse Huts	Bio-Serv, Flemington, NJ	K3272	For environmental enrichment