Быстрый Фенотипическая Неврологические система подсчета очков для оценки прогрессирования заболевания в SOD1-G93A мышиной модели СЛА

Резюме

This video protocol describes a sensitive, reliable, and quick method for evaluating the neuromuscular deficits in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.

Аннотация

The SOD1-G93A transgenic mouse is the most widely used animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). At ALS TDI we developed a phenotypic screening protocol, demonstrated in video herein, which reliably assesses the neuromuscular function of SOD1-G93A mice in a quick manner. This protocol encompasses a simple neurological scoring system (NeuroScore) designed to assess hindlimb function. NeuroScore is focused on hindlimb function because hindlimb deficits are the earliest reported neurological sign of disease in SOD1-G93A mice. The protocol developed by ALS TDI provides an unbiased assessment of onset of paresis (slight or partial paralysis), progression and severity of paralysis and it is sensitive enough to identify drug-induced changes in disease progression. In this report, the combination of a detailed manuscript with video minimizes scoring ambiguities and inter-experimenter variability thus allowing for the protocol to be adopted by other laboratories and enabling comparisons between studies taking place at different settings. We believe that this video protocol can serve as an excellent training tool for present and future ALS researchers.

Введение

С тех пор ее развитие в середине 1990-х годов модель трансгенной мыши СОД1-G93A была наиболее широко используется для животных модель боковой амиотрофический склероз (БАС) ^1. Это модели трансгенных мышей была генной инженерии сверхэкспрессии мутантной формы в человеческой Cu / Zn супероксиддисмутазы 1 (СОД1) гена АЛС, несущих ассоциированный-глицин аланин у аминокислоты 93 (G93A). Мутация G93A является одним из многих мутаций в гене SOD1, которые в совокупности макияжа примерно пятую часть семейных случаев БАС ^2.

СОД1-G93A модель стала рабочей лошадкой исследования развития БАС препарат, потому что в дополнение к своей очевидной генетической связи с БАС, это повторяет многие патологические черты БАС у людей, такие как потеря нейронов двигателя, прогрессивной мышечной слабости и атрофии, с возможными паралич и смерть ^3. Хотя, как это часто бывает с трансгенными животных моделях, существует внутреннее бигические изменения, связанные с СОД1-G93A мышей. Скотт и др. определили, что когорты по крайней мере, 24 мусорных соответствием пола сбалансированный мышей необходимы конструкций исследуемого препарата, эффективности, чтобы преодолеть шум, создаваемый биологической изменчивости ^4. Большое количество животных, необходимых в этих исследованиях в сочетании с прогрессированием агрессивной болезни и необходимости ежедневного мониторинга запрещает использование сложных, трудоемких и потенциально стрессовых методик для измерения нервно-мышечной силы и функции (например, электромиографии, сила захвата, rotorod , и т.д.). Вместо этого, он подчеркивает необходимость в естественных условиях скрининга, которые надежно оценивает нервно функцию СОД1-G93A мышей в быстрой манере.

В БАС TDI был разработан протокол, который позволяет для достоверной оценки нервно-мышечной функции СОД1-G93A мышей в менее чем 30 сек на мышь в среднем. Этот протокол encompaГоссанэпиднадзора ежедневно оценку функции задних конечностей, используя простой нервную систему скоринга (NeuroScore), который описан в настоящем докладе в прессе и в видео. NeuroScore ориентирована на функции задних конечностей из-за дефицита задней конечности являются раннее сообщалось неврологических признаков болезни в СОД1-G93A мышей ^5,6. Кроме того, протокол, разработанный БАС TDI обеспечивает объективную оценку наступления пареза (слабая или частичный паралич), прогрессирования и тяжесть паралича, и это достаточно чувствительны, чтобы определить изменения наркотиков индуцированных в прогрессировании заболевания.

протокол

Все эксперименты проводятся в соответствии с протоколами, описанными Национальных Институтов Здоровья Руководства по уходу и использованию животных и были одобрены уходу институциональная животных и использование комитета ALS TDI в (IACUC).

1. Животные, дома, и Дизайн исследования

Примечание: В колонии мыши СОД1-G93A была получена из высокого копирования B6SJLTgN (SOD1G93A) 1Gur деформации первоначально производимого Герни и др. ^7. Колонии в настоящее время поддерживается пересечения трансгенных самцов мышей C57BL / 6-SJL дикого типа C57BL / 6-SJL F1 самок. В F1 животные генерируются путем скрещивания самцов с SJL В6 женщин. Мышей отправлены в ALS TDI еженедельно в 35-45-дневном возрасте.

1. Разрешить мышей по крайней мере, одну неделю, чтобы акклиматизироваться к вивария (12-часовой циклом свет / темнота, при температуре 18-23 ° С и 40-60% влажности) перед назначением в исследовании.
2. Дом мужчины СОД1-G93A микрофоне одна мышь в клетке, так как группа размещается мужчины, как правило, чтобы бороться. Мышей Дом женщина СОД1-G93A до двух в клетке. Обеспечить экологическую обогащения, в виде пластиковых хижинах. Обеспечить продовольственную и вода вволю, если мышей не являются частью исследования, требующего введения наркотиков в питьевой воде / еду. В этих случаях, рацион и записи пищи и воды.
3. Начните с наркотиками исследования эффективности возрасте около 50 дня и включают в себя 64 помет соответствием гендерных сбалансированный мышей (32 в группе). Наконец, убедитесь, что исследователи, проводящие исследования ослеплены условиям эксперимента.
   Примечание: Рекомендуется, что типичный исследование наркотиков эффективность начинается в возрасте 50 день, однако в зависимости от типа лечебного вмешательства было бы предпочтительнее, чтобы начать исследование раньше или позже.
   Примечание: исследование с 32 мышей в группе работает выявить гендерные конкретных наркотиков эффекты. Если нет гендерные сравнения не требуется, 24 мышей на когорте должно хватить для обнаружения наркотиков общие эффекты.

2. Масса тела

1. Запись массы тела для всех мышей в исследованиях ежедневно с точностью до одной десятой грамма. Примечание: Масса тела является чувствительным индикатором прогрессирования заболевания и недомогания любого, возникшие в результате хронического медикаментозного лечения.
2. Веса тела мыши значительно изменяются в течение суток, будучи выше по утрам, таким образом, записать их в то же самое время каждый день.

3. Неврологические система подсчета очков (NeuroScore)

1. Оценивать неврологические оценки (NS) для каждой мыши ежедневно, наблюдая мыши при следующих трех условий выполняется последовательно: а) мышь приостановлено хвоста, б) мышь разрешается ходить, а после наступления парез; в) мыши находится на его стороне.
   1. Для теста подвешивания за хвост, держать мышь примерно 1.5 "от основания хвоста по проводам вершине своей домашней клетке в течение 1-2 сек, от пищевой бассейна, в то время как наблИрвинг задних конечностей. Повторите тест подвеска в 3 раза и записывать самый последовательный результат.
   2. Для теста ходьбы, поместите курсор на чистую поверхность, что обеспечивает некоторую тягу и пешком 25 см (например,., Бумажное полотенце тесьмой, чтобы предотвратить скольжение). Разрешить мыши, чтобы ходить в общей сложности 75 см (3X длина бумажным полотенцем), наблюдая его походку.
   3. Для теста «рефлекса», поместите курсор мыши над левой или правой стороны и с помощью секундомера измерить время, необходимое, чтобы исправить себя до без посторонней помощи с обеих сторон. Примечание: Только одно испытание этого теста не требуется.
2. Определить NS каждого задней конечности (левой или правой) независимо по шкале от 0 до 4. Примечание: Например оценка 0, 1 указывает, что оставили задних конечностей Н.С. 0, в то время как правая задних конечностей Н.С. 1.
3. Связать неврологические счеты (0-4), соответствующие следующим набором наблюдений (кратких, приведенных в таблице 1):
   1. Связать Н.С. 0 (Pre-симптоматическая), если выполнены следующие наблюдается: Когда мышь подвешивали за хвост, задних конечностей представляет нормальную перекос то есть он полностью выдвинут от боковой линии и он остается в этом положении в течение 2 секунд больше. Когда мышь разрешено ходить, нормально походка наблюдается.
   2. Связать NS 1 (Первые симптомы), если наблюдается следующее: Когда мышь подвешивали за хвост, задних конечностей представляет аномальное перекос, т.е., он рухнул или частично рухнул к боковой средней линии или дрожит во время подвешивания за хвост или его втянут / всплеснула. Когда мышь разрешено ходить, нормальный или слегка медленно походка наблюдается.
   3. Связать NS 2 (начало пареза), если после наблюдается: Когда мышь подвешивали за хвост, задней конечности частично или полностью рухнул, не расширяя много. (Там все еще может быть совместное движение). Когда мышь разрешено ходить, задних конечностей используется для прямого словцоионная однако пальцы локон вниз, по крайней мере дважды в течение 90 см прогулку или любую часть стопы таща клетка нижней / таблицы. Когда мышь находится на левой и правой стороны, он способен верно себя в течение 10 секунд с обеих сторон.
   4. Связать NS 3 (паралич), если выполнены следующие наблюдается: Когда мышь подвешивали за хвост, есть жесткая паралич задних конечностей в ИЛИ минимальной совместного движения. Когда мышь разрешено ходить там движение вперед, однако задних конечностей не используется для движения вперед. Когда мышь находится на левой и правой стороны, он способен верно себя в течение 10 секунд с обеих сторон. Примечание: Редко, после начала паралича, влажность мочи может появиться на задних конечностях. При отсутствии лечения влаги мочи может привести к моче "ожог" и поражения кожи. Лечить влаги мочи, закрепляя волосы, нанесите теплую воду впитывает удалить мочу и осторожно промокните насухо. Если поражения кожи присутствуют применять antibioкрестики мазь.
   5. Связать NS 4 (Гуманное конечных точек), если после наблюдается: Когда мышь подвешивали за хвост, есть жесткая паралич задних конечностей в. Когда мышь разрешено пройти, нет движения вперед. Когда мышь находится на левой и правой стороне это не в состоянии верно себя в течение 10 секунд с каждой стороны, т. Е, отсутствие рефлекса.

4. ввода и анализа данных

1. В ходе исследования эффективности препарата, введите данные, собранные для каждой мыши в лаборатории системы управления информацией (LIMS) или в коммерчески доступного программного обеспечения с электронными таблицами.
   Примечание: БАС TDI развитая LIMS программного обеспечения является центральным хранилищем для всех данных, собранных из внутренних исследований, что делает эти данные доступными удобно с течением времени для БАС TDI следователей. LIMS отслеживает любую индивидуальную мышь, с ее уникальным ID, вернуться к своей родословной, массы тела или неврологические счетом на все дни исследования,и включает в себя любые другие замечания, сделанные во время его жизни. LIMS, в конечном счете порождает таблицу, которая используется для последующих анализов.
2. По завершении исследования эффективности препарата, т.е., когда все мыши достижения гуманного конечную точку, использование электронных таблиц программного обеспечения (см таблицу материалов), чтобы вычислить комбинированный NS для каждой мыши, за каждый день путем усреднения левой и правой задней конечности NS , Далее, вычислить средний возраст на каждом NS для каждой мыши и числа дней каждой мыши тратит на определенном NS.
3. Анализ общих изменений в NS течением времени за счет импорта данных из программного обеспечения электронных таблиц в статистического программного обеспечения (см таблицу материалов). Установите эти данные, используя модель логистической регрессии порядковый который оценивает ожидаемый NS, с средним возрастом в NS и наркотиков лечения как эффектов в регрессии. Использование хи-квадрат тест лог-рангового оценить вероятность эффект правдоподобия и определить, является ли действие препарата обращение на прогрессирование NS статистическаяLY значительным (см Дополнительный код файла для шаг за шагом инструкции).
   Примечание: р-значение <0,05 считается статистически значимым.
   Примечание: Этот метод статистического анализа уважает порядковый характер данных, NS и переменной природы NS траекторий для отдельных мышей. Это является предпочтительным, поскольку отдельные траектории NS может быть заметно отличается в результате NS времени соответствующей группы средних, которые недостаточно отражает ответы NS. Кроме того, в некоторых случаях NS может колебаться, особенно когда в диапазоне от нулевой до одного.
4. Наконец, использование графиков программного обеспечения (см таблицу) Материалы для создания "Порядковый Ожидаемое NS против Средний возраст NS" графиков наркотиков лечение и контрольных животных (рис 2, см Справочная код файла шаг за шагом инструкции). Используйте эти графики, чтобы удобно оценить сдвиги между обработанными наркотиками и контрольных групп путем интерполяции с оси у средний возраст начала заболевания (я.э., С. 2) на оси х.
   Примечание: Разница в возрасте между срединной двумя группами представляет собой переход медикаментозного и обрабатывают в качестве практической меры величины эффекта.
   Примечание: вправо сдвиги в ожидаемой NS против средней кривой возраста указывают замедлился прогрессии заболевания симптоматическое. Наоборот, влево сдвиги в ожидаемой NS против средней кривой возраста указывают ускоряется прогрессирование болезни симптоматическое.

Результаты

Неврологические данные балл для 90 мужчин и 94 женщин необработанной СОД1-G93A мышей учился в БАС TDI в течение 2014 были оценены. Результаты показывают, что мужчины, как правило, мышей имеют более агрессивный прогрессирование заболевания, чем самок мышей, о чем свидетельствует более высокая д?...

Обсуждение

В этом докладе мы описываем быстрый и простой протокол видео, которые, если правильно применять, способна надежно оценить прогрессирование заболевания в СОД1-G93A мышей и выявления изменений, вызванных наркотиками. В то время как различные группы разработали фенотипические системы скор...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	002726	Strain of mice used in this study
Breeders	Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA		Colony maintainance
Scale	Navigator OHAUS, Parsippany, NJ	Model N14120	Used to weigh mice
Nutra-GelH	Bio-Serv, Flemington, NJ	#S4798	Wet food provided to sick mice
Irradiated Lab Animal Diet	Harlan, Indianapolis, IN	2918-111914M	Chow diet
Lab-grade Sani-chips	Harlan Teklad, Indianapolis, IN	7090	Bedding
JMPH	SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC	v10.0.2	Statistical software
Microsoft Excel	Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA	Excel 2013 (v 15.0)	Spreadsheet software
GraphPad Prism 5	GraphPad software Inc., La Jolla, CA	v5.4	Graphing software
Mouse Huts	Bio-Serv, Flemington, NJ	K3272	For environmental enrichment