שיטת ניקוד מהירה פנוטיפי נוירולוגיות להערכת מחלת התקדמות בSOD1-G93A מודל העכבר של ALS

Summary

This video protocol describes a sensitive, reliable, and quick method for evaluating the neuromuscular deficits in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.

Abstract

The SOD1-G93A transgenic mouse is the most widely used animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). At ALS TDI we developed a phenotypic screening protocol, demonstrated in video herein, which reliably assesses the neuromuscular function of SOD1-G93A mice in a quick manner. This protocol encompasses a simple neurological scoring system (NeuroScore) designed to assess hindlimb function. NeuroScore is focused on hindlimb function because hindlimb deficits are the earliest reported neurological sign of disease in SOD1-G93A mice. The protocol developed by ALS TDI provides an unbiased assessment of onset of paresis (slight or partial paralysis), progression and severity of paralysis and it is sensitive enough to identify drug-induced changes in disease progression. In this report, the combination of a detailed manuscript with video minimizes scoring ambiguities and inter-experimenter variability thus allowing for the protocol to be adopted by other laboratories and enabling comparisons between studies taking place at different settings. We believe that this video protocol can serve as an excellent training tool for present and future ALS researchers.

Introduction

מאז הפיתוח שלה באמצע שנתי ה -1990 דגם העכבר מהונדס SOD1-G93A היה מודל החיה הנפוצה ביותר של מחלת ניוון (ALS) ^1. מודל עכבר מהונדס זה מהונדס גנטי לביטוי יתר טופס מוטציה של גן סופראוקסיד דיסמוטאז Cu / Zn האנושי 1 (SOD1) חסת גליצין קשור-ALS למוטצית אלאנין בחומצת אמינו 93 (G93A). המוטציה G93A היא אחד של מוטציות רבות בגן SOD1 שהאיפור באופן קולקטיבי כחמישית ממקרי ה- ALS המשפחתיים ^2.

מודל SOD1-G93A הפך סוס עבודה מחקר לפיתוח תרופות ALS כי בנוסף לקשר הגנטי הברור שלה לALS, היא דומה רבות של התכונות פתולוגיים של ALS בבני אדם כגון אובדן מוטורי נוירון, חולשת שרירים מתקדמת וניוון, עם סופו של דבר שיתוק ומוות ^3. אם כי, כפי שקורה לעתים קרובות עם מודלים של בעלי חיים מהונדסים, יש דו טבועהשתנות ological קשורות עם SOD1 לעכברים-G93A. סקוט ואח '. קבע כי קבוצות של לפחות 24 עכברי מין מאוזן בהתאמה המלטה יש צורך במחקר עיצובי סמים יעילות כדי להתגבר על הרעש שנוצר על ידי השונות הביולוגיות ^4. המספר הגדול של בעלי חיים הנדרשים במחקרים אלה, בשילוב עם התקדמות המחלה האגרסיבית ואת הצורך בניטור יומי אוסר על השימוש בטכניקות משוכללות, גוזל זמן ופוטנציאל דחק למדידת כוח ותפקוד עצבית-שרירית (לדוגמא, electromyography, כוח אחיזה, rotorod , וכיוצא בזה.). במקום זאת, הוא מדגיש את הצורך בin vivo כלי הקרנה שבאופן מהימן מעריך את התפקוד העצבית-שרירית של SOD1 לעכברים-G93A באופן מהיר.

בALS TDI פרוטוקול פותח שמאפשר ההערכה אמינה של התפקוד העצבית-שרירית של SOD1 לעכברים-G93A בפחות מ -30 שניות לכל עכבר בממוצע. encompa פרוטוקול זהsses הערכה יומית של פונקצית hindlimb באמצעות מערכת פשוטה נוירולוגיות ניקוד (NeuroScore) אשר מתוארת בדוח זה בעיתונות ובוידאו. על תפקוד hindlimb NeuroScore מתמקד בגלל גירעונות hindlimb הם המוקדם ביותר שדווחו סימן נוירולוגיות של מחלה בעכברי SOD1-G93A ^5,6. יתר על כן, הפרוטוקול שפותח על ידי ALS TDI מספק הערכה בלתי מוטה של ​​תחילת paresis (שיתוק קל או חלקי), התקדמות והחומרה של שיתוק והוא רגיש מספיק כדי לזהות שינויים בהשפעת סמים בהתקדמות מחלה.

Protocol

כל הניסויים שנערכו בהתאם לפרוטוקולים שתוארו על ידי המכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בבעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה של ALS TDI טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש (IACUC).

1. בעלי חיים, שיכון, ועיצוב הלימוד

הערה: המושבה עכבר SOD1-G93A נגזרה מB6SJLTgN המתח הגבוה 1Gur עותק (SOD1G93A) המיוצר במקור על ידי et al גורני ^7.. המושבה כיום מתוחזק על ידי חציית זכרים C57BL / 6-SJL מהונדסים עם נקבות C57BL / 6-SJL F1 wild-type. בעלי החיים F1 נוצרים על ידי חציית זכרים SJL עם נקבות B6. עכברים נשלחים לשבועון TDI ALS ב35-45 ימים של גיל.

1. לאפשר עכברים לפחות אחד שבוע להסתגל למתקן בעלי החיים (מחזור אור / חושך של 12 שעות בטמפרטורה של C ° 18-23 ולחות 40-60%) לפני הקצאה למחקר.
2. SOD1-G93A זכר בית מיקרופוןדואר עכבר אחד בכל כלוב, מאז הקבוצה שוכנו זכרים נוטים להילחם. עכברי הבית הנקבה SOD1-G93A עד שני לכלוב. לספק העשרה סביבתית, בצורה של בקתות פלסטיק. לספק כרצונך מזון ומי מודעה, אלא אם העכברים הם חלק ממחקר הדורש מתן תרופה במי שתייה / אוכל. במקרים אלה, מנה ומזון שיא ומים.
3. בגין מחקר סמים יעילות סביב גיל 50 יום וכולל 64 עכברי מין מאוזן בהתאמה המלטה (32 לכל מחזור). לבסוף, להבטיח כי החוקרים עורכים המחקרים עיוורו לתנאי ניסוי.
   הערה: מומלץ כי מחקר סמים יעילות טיפוסי מתחיל בגיל 50 יום אך המבוסס על הסוג של התערבות טיפולית שזה עשוי להיות עדיף להתחיל המחקר מוקדם או במאוחר.
   הערה: מחקר עם 32 עכברים למחזור הוא מופעל כדי לזהות סמים לוואי מין ספציפי. אם אין השוואות בין המינים ספציפיים נדרשות, 24 עכברים למחזור צריכים להספיק כדי לזהות סמים השפעות הכוללות.

2. משקל גוף

1. משקל גוף רשומה לכל העכברים בלימוד יומי עם דיוק של עשירית גרם. הערה: משקל גוף הוא אינדיקטור רגיש להתקדמות מחלה ושל כל חולשה שעלולה להיגרם כתוצאה מטיפול תרופתי כרוני.
2. משקל גוף העכבר להשתנות במידה ניכרת במהלך יום, להיות גבוה יותר בבקרים, ובכך לרשום אותם בערך באותו הזמן בכל יום.

3. מערכת נוירולוגיות ניקוד (NeuroScore)

1. להעריך ציוני נוירולוגיות (NS) עבור כל עכבר יומי על ידי התבוננות בעכבר תחת שלושה התנאים הבאים מבוצעים ברצף:) העכבר מושעה בזנבו, ב) העכבר מותר ללכת, ולאחר תחילת paresis ג) עכבר ממוקם על צידו.
   1. לבדיקת ההשעיה זנב, להחזיק את העכבר כ 1.5 "מבסיס הזנב מעל החוט של הכלוב בביתם במשך 1-2 שניות, הרחק מאגן המזון, ואילו הערהארווינג hindlimbs. חזור על בדיקת ההשעיה 3 פעמים ולהקליט את התוצאה העקבית ביותר.
   2. למבחן ההליכה, הנח את העכבר על משטח נקי שמספק כמה מתיחה ומרחק הליכה של 25 סנטימטר (למשל., מגבת נייר מודבקת למטה למניעת החלקה). אפשר העכבר כדי ללכת כולל של 75 סנטימטר (אורך 3X של מגבת נייר) תוך התבוננות בהליכה שלה.
   3. למבחן "רפלקס ליישר", הצב את העכבר על צדו ימני או השמאלי ובאמצעות תחנה-שעון למדוד את הזמן שלוקח לתקן את עצמו עד ללא עזרה משני הצדדים. הערה: רק משפט אחד של מבחן זה נדרש.
2. לקבוע NS של כל hindlimb (ימין או שמאל) באופן עצמאי בסולם מ 0 עד 4. הערה: לדוגמא ציון של 0, 1 מציין כי hindlimb עזבה NS הוא 0, ואילו hindlimb NS הנכון הוא 1.
3. להקצות עשרות נוירולוגיות (0-4) המתאימות לקבוצה של תצפיות (סיכום שנקבעו בלוח 1) הבאה:
   1. הקצאת NS 0 (Pre-סימפטומטי) אם הבא הוא ציין: כאשר העכבר הוא מושעה בזנב, hindlimb מציגה נוטה החוצה נורמלי כלומר, הוא מוארך מקו האמצע לרוחב באופן מלא והוא נשאר בתפקיד זה במשך 2 שניות או ארוך יותר. כאשר העכבר מותר ללכת, הליכה נורמלית הוא ציין.
   2. הקצאת 1 NS (סימפטומים ראשונים) אם הבא הוא ציין: כאשר העכבר הוא מושעה בזנב, hindlimb מציגה נוטה החוצה נורמלי, כלומר, הוא התמוטט או באופן חלקי התמוטט לכיוון קו האמצע לרוחב או שרועד בהשעית זנב או שהוא חזר בו / שלובות. כאשר העכבר מותר ללכת, הליכה רגילה או מעט איטית הוא ציין.
   3. הקצאת NS 2 (Onset של paresis) אם הבא הוא ציין: כאשר העכבר הוא מושעה בזנב, hindlimb היא באופן חלקי או לחלוטין התמוטט, לא להאריך הרבה. (יש עדיין עשויה להיות תנועה משותפת). כאשר העכבר מותר ללכת, hindlimb משמשת לmot קדימהיון עם זאת הבהונות כלפי מטה להתכרבל לפחות פעמיים במהלך הליכה של 90 סנטימטר או כל חלק של כף הרגל גורר לאורך תחתית כלוב / שולחן. כאשר העכבר ממוקם בצדו הימני והשמאלי, הוא מסוגל לתקן את עצמו בתוך 10 שניות משני הצדדים.
   4. הקצאת 3 NS (שיתוק) אם הבא הוא ציין: כאשר העכבר הוא מושעה בזנב, יש שיתוק נוקשה בhindlimb או תנועה משותפת מינימאלית. כאשר העכבר מותר ללכת קדימה יש תנועה עם זאת hindlimb לא נמצאת בשימוש לתנועה קדימה. כאשר העכבר ממוקם בצדו הימני והשמאלי, הוא מסוגל לתקן את עצמו בתוך 10 שניות משני הצדדים. הערה: לעתים רחוקות, לאחר תחילת השיתוק, לחות שתן עלולה להופיע בhindlimbs. לחות שתן שלא טופלה עלולה לגרום לשמאל שתן "לשרוף" ונגעים בעור. פנק את לחות שתן על ידי גזירת השיער, להחיל מים חמים סופג להסיר את השתן, ובעדינות למחוק יבש. אם נגעים בעור נמצאים תחול antibioמשחה טיק.
   5. הקצאת 4 NS (נקודת סיום הומנית) אם הבא הוא ציין: כאשר העכבר הוא מושעה בזנב, יש שיתוק נוקשה בhindlimbs. כאשר העכבר מותר ללכת, אין תנועה קדימה. כאשר העכבר ממוקם בצדו הימני והשמאלי הוא לא מסוגל לתקן את עצמו בתוך 10 שניות מצד או. כלומר, היעדר ליישר רפלקס.

4. הזנת נתונים וניתוח

1. במהלך מחקר יעילות תרופה, להזין נתונים שנאספו עבור כל עכבר למערכת ניהול מידע מעבדה (LIMS) או לתוכנת גיליון אלקטרוני זמינה באופן מסחרי.
   הערה: תוכנת LIMS המפותחת TDI ALS היא מאגר מרכזי לכל הנתונים שנאספו ממחקרים פנימיים, מה שהופך את הנתונים הללו בנוחות נגישה לאורך זמן לחוקרי ALS TDI. LIMS עוקב כל עכבר בודד, עם זיהוי הייחודי שלה, חזרה לשושלת, משקל הגוף או ציון הנוירולוגיות בכל הימים העיון,וכולל את כל תצפיות אחרות ציינו במהלך חייו. LIMS סופו של דבר יוצר גיליון אלקטרוני המשמש לניתוחים שלאחר מכן.
2. עם השלמת מחקר סמים יעילות, כלומר, כאשר כל העכברים להגיע לנקודת הסיום ההומנית, תוכנת גיליון אלקטרוני שימוש (ראה טבלה של חומרים) כדי לחשב את NS המשולב לכל עכבר, עבור כל יום על ידי ממוצעי hindlimb ימין ועל שמאל NS . בשלב הבא, לחשב את הגיל החציוני בכל NS לכל עכבר ומספר הימים בכל עכבר מבלה בNS מסוים.
3. ניתוח שינויים הכוללים בNS לאורך זמן על ידי יבוא נתונים מהתוכנה הגיליון האלקטרוני לתוכנה הסטטיסטית (ראה טבלה של חומרים). להתאים את הנתונים הללו באמצעות מודל של רגרסיה לוגיסטית סודר האומד את NS הצפוי, עם גיל החציונים בNS ותרופה לטיפול בתופעות ברגרסיה. שימוש במבחן כיכר צ'י יומן הדרגה להעריך את הסתברות סבירות השפעה ולקבוע אם אפקט תרופה-טיפול על התקדמות NS הוא סטטיסטיly משמעותי (ראה קובץ קוד נוסף להוראות צעד-אחר-צעד).
   הערה: p-value <0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית.
   הערה: שיטה זו של ניתוח סטטיסטי מכבדת את הטבע הסידורי של נתונים NS והטבע המשתנה של מסלולי NS לעכברים בודדים. הוא העדיף משום מסלולי NS בודדים יכולים להיות שונים במידה ניכרת וכתוצאה מכך ממוצעי קבוצה הקשורים זמן NS שאינם מספיק רעיוני של תגובות NS. בנוסף, בחלק מהמקרים NS יכול להשתנות, במיוחד כאשר בטווח אפס-על-אחד.
4. לבסוף, תוכנת גרפים שימוש (ראה טבלה של חומרים) כדי ליצור "סודר צפוי NS לעומת חציון גיל בNS" גרפים לבעלי חיים שטופל בתרופה ושליטה (איור 2; ראה נוסף קוד קובץ להוראות צעד-אחר-צעד). השתמש בגרפים אלה כדי להעריך נוחות משמרות בין קבוצות שטופלה בתרופה ושליטה על ידי ביון מהציר y הגיל החציוני של תחילת מחלה (i.דואר., NS 2) על ציר x.
   הערה: ההבדל בגיל החציוני בין שתי הקבוצות מייצג שינוי תוצאת משימוש בסמים ומטופל כאמצעי מעשי של סדר הגודל של השפעה.
   הערה: משמרות ימינה בלעומת העקומה הצפויה NS חציון הגיל מצביע על האטת התקדמות מחלה סימפטומטית. לעומת זאת, משמרות שמאלה בעיקול לעומת הגיל החציוני הצפוי NS מצביעות מואצות התקדמות מחלה סימפטומטית.

תוצאות

נתוני ציון הנוירולוגית של 90 גברים ו -94 נקבות עכברים שאינם מטופלים SOD1-G93A למדו בALS TDI בשינה 2014 הוערכו. התוצאות מראות כי יש לי עכברי זכרים בדרך כלל התקדמות מחלה אגרסיבית יותר מאשר נקבות עכברים, כפי שמעידים חלק גדול יותר של תוחלת החיים שלהם ליום 1 בNS בהשוואה לנשים. NS 2 וNS 3 להת...

Discussion

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול וידאו מהיר ופשוט, שאם מיושם כהלכה, מסוגל באופן מהימן הערכת התקדמות המחלה בעכברי SOD1-G93A וזיהוי שינויים בהשפעת סמים. בעוד קבוצות שונות פיתחו מערכות ניקוד פנוטיפי לSOD1 לעכברי ^G93A-8-10, הם לעתים קרובות לא מספקים פרטים מספיקים על ההליך ואי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	002726	Strain of mice used in this study
Breeders	Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA		Colony maintainance
Scale	Navigator OHAUS, Parsippany, NJ	Model N14120	Used to weigh mice
Nutra-GelH	Bio-Serv, Flemington, NJ	#S4798	Wet food provided to sick mice
Irradiated Lab Animal Diet	Harlan, Indianapolis, IN	2918-111914M	Chow diet
Lab-grade Sani-chips	Harlan Teklad, Indianapolis, IN	7090	Bedding
JMPH	SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC	v10.0.2	Statistical software
Microsoft Excel	Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA	Excel 2013 (v 15.0)	Spreadsheet software
GraphPad Prism 5	GraphPad software Inc., La Jolla, CA	v5.4	Graphing software
Mouse Huts	Bio-Serv, Flemington, NJ	K3272	For environmental enrichment