ALSのSOD1-G93Aマウスモデルにおける疾患進行を評価するためのクイック表現型の神経学的スコアリングシステム

要約

This video protocol describes a sensitive, reliable, and quick method for evaluating the neuromuscular deficits in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.

要約

The SOD1-G93A transgenic mouse is the most widely used animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). At ALS TDI we developed a phenotypic screening protocol, demonstrated in video herein, which reliably assesses the neuromuscular function of SOD1-G93A mice in a quick manner. This protocol encompasses a simple neurological scoring system (NeuroScore) designed to assess hindlimb function. NeuroScore is focused on hindlimb function because hindlimb deficits are the earliest reported neurological sign of disease in SOD1-G93A mice. The protocol developed by ALS TDI provides an unbiased assessment of onset of paresis (slight or partial paralysis), progression and severity of paralysis and it is sensitive enough to identify drug-induced changes in disease progression. In this report, the combination of a detailed manuscript with video minimizes scoring ambiguities and inter-experimenter variability thus allowing for the protocol to be adopted by other laboratories and enabling comparisons between studies taking place at different settings. We believe that this video protocol can serve as an excellent training tool for present and future ALS researchers.

概要

1990年代半ばにおけるその開発SOD1-G93Aトランスジェニックマウスモデルは、筋萎縮性側索硬化症^（ALS）1の最も広く使用される動物モデルとなっている以来。このトランスジェニックマウスモデルは、遺伝的に、アミノ酸93（G93A）のアラニンへの変異ALS関連グリシンを保有する人のCu / Znのスーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）遺伝子の変異型を過剰発現するように設計されました。 G93A変異を一括メイク家族性ALS症例²の約​​1/5 SOD1遺伝子の多くの変異の一つです。

ALSとの明らかな遺伝的リンクに加えて、このような運動ニューロンの損失、進行性の筋力低下や萎縮などのヒトでALSの病理学的特徴の多くを再現するため、SOD1-G93Aモデルは、最終的に、ALS創薬研究の主力となっています麻痺と死^3。多くの場合、トランスジェニック動物モデルの場合と同様にかかわらず、固有の双方向性がありますSOD1-G93Aマウスに関連する学的変動。スコットら 。少なくとも24ごみをマッチさせた男女バランスのマウスのコホートは^、4生物学的変動によって作成されたノイズを克服するために、薬剤の有効性の研究のデザインに必要とされていることを確認しました。攻撃的な疾患の進行、毎日モニタリングの必要性と組み合わせたこれらの研究に必要な動物の多くは、神経筋強度および機能を測定するための精巧な、時間がかかり、潜在的にストレスの多い技術の使用を禁止する（例えば、筋電、握力、回転棒、等）。代わりに、それは確実に迅速な方法でSOD1-G93Aマウスの神経筋機能を評価するin vivoでのスクリーニングツールの必要性を強調しています。

ALS TDIでプロトコルが平均でマウスあたり30秒未満でSOD1-G93Aマウスの神経筋機能の信頼性の評価が可能になるように開発されました。このプロトコルのencompaプレスで、ビデオでは、この報告書に記載されている単純な神経学的スコアリングシステム（NeuroScore）を使用して、後肢機能のSSES毎日評価。後肢の赤字が最も早く、SOD1-G93Aマウス^5,6における疾患の神経学的兆候を報告しているためNeuroScoreは、後肢の機能に焦点を当てています。さらに、ALS TDIが開発したプロトコルは、不全麻痺（わずかなまたは部分的な麻痺）の発症の公平な評価を提供する麻痺の進行および重症度、それが疾患の進行における薬剤誘発性の変化を識別するのに十分な感度です。

プロトコル

すべての実験動物の管理と使用のための健康ガイドの国立研究所によって記載されたプロトコルに従って実施されており、ALS TDIの制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1.動物、住宅、および研究デザイン

注意：SOD1-G93Aマウスコロニーは、もともとガーニーら⁷によって生産高コピーB6SJLTgN（SOD1G93A）1Gur株に由来するものでした。コロニーは、現在、野生型C57BL / 6-SJL F1の雌とトランスジェニックC57BL / 6-SJL男性を交配することによって維持されています。 F1動物をB6雌とSJL男性を交配することによって生成されます。マウスは、生​​後35〜45日でALSのTDI毎週に出荷されます。

1. マウス少なくとも1週間は研究に割り当てる前（18〜23°Cと40〜60％の湿度の温度で、12時間の明/暗サイクル）動物施設に順応できるようにします。
2. ハウスオスSOD1-G93Aマイクグループを収容するので、ケージごとに電子1マウスは、男性は戦うために傾向があります。ケージ当たり最大2つの家の女性SOD1-G93Aマウス。プラスチック小屋の形で、環境エンリッチメントを提供します。マウスは、水/食品飲料に薬物投与を必要とする研究の一部である場合を除き、食料および水を自由に摂取させてください。これらのケースでは、配給、レコード食料と水。
3. 年齢50日目の周りの薬剤有効性試験を開始し、64ゴミをマッチさせたジェンダーバランスのとれたマウス（コホートごとに32）が挙げられます。最後に、研究を行う研究者が実験条件を知らされていることを確認。
   注：これは、典型的な薬剤の有効性の研究は、しかし、それは前または後の研究を開始することが望ましいかもしれない治療的介入の種類に基づいて、年齢50日に開始することをお勧めします。
   注意：コホートあたり32匹のマウスを用いた研究は、性特異的薬剤の効果を検出するために供給されています。何の性別固有の比較が必要とされない場合は、コホートあたり24匹のマウスは、全体的な薬剤の効果を検出するために十分なはずです。

2.体重

1. グラムの10分の1の精度で日常の研究におけるすべてのマウスのレコードの体重。注意：体重は疾患進行の慢性薬物治療から生じる可能性の倦怠感の敏感な指標です。
2. マウスの体重は、このように、朝に高いこと、日中かなり変動毎日同じ時期にそれらを記録。

3.神経学的スコアリングシステム（NeuroScore）

1. A）マウスがその尾によって中断され、b）のマウスは、歩くことが許可され、麻痺cの発症後）：順次実行次の3つの条件の下でマウスを観察することで、毎日、各マウスのための神経学的スコア（NS）を評価マウスは、その側面に配置されています。
   1. 尾懸垂試験では、OBSながら、離れた食品流域から、1〜2秒のための彼らのホームケージのワイヤー上から約1.5 "尾の付け根からマウスを開催後肢をアービング。懸濁試験を3回繰り返し、最も一貫性のある結果を記録します。
   2. 歩行テストでは、いくつかのトラクション25センチ歩行距離を提供してきれいな表面上でマウスを置く（ 例えば 、ペーパータオルは、滑り防止のためにダウンしてテープで固定しました）。その歩行を観察しながらマウスを75センチ合計（ペーパータオルの3倍の長さ）を歩くことを許可します。
   3. その左側または右側にマウスを置き、テスト「立ち直り反射」とストップウォッチを使用するために、それが両側から自力自体を右にかかる時間を測定します。注：このテストの唯一の試験が必要です。
2. 0〜4注に独立規模で（左または右）各後肢のNSを決定します。右後肢NSが1である間例えば0のスコアは、1は、左後肢NSが0であることを示しています。
3. （ 表1に提供要約）観測の次のセットに対応する神経学的スコア（0-4）を割り当てます。
   1. 以下が観察されている場合は、NS 0（発症前）を割り当てます、マウスを尾によって中断されると、後肢は通常のスプレイつまりを提示し 、それが完全に離れて横正中線から延長され、それが2秒間、この位置に留まりますか長いです。マウスが歩いさせると、通常の歩行が観察されます。
   2. 以下が観察されている場合は、NS 1（最初の症状）を割り当て：マウスを尾によって中断されると、後肢は異常な広がりを示し、 すなわち、それが崩壊している、または部分的に崩壊し、横方向の正中線に向かってか、尾懸垂中に震えるか、後退させます/握りしめ。マウスが歩いて許可された場合、通常のまたはわずかに遅い歩行が観察されます。
   3. 以下が観察されている場合は、NS 2（麻痺の発症）を割り当てます。マウスを尾によって中断されると、後肢はあまり伸びるない、部分的または完全に崩壊しています。 （まだ関節の動きがあるかもしれません）。マウスが歩いさせると、後肢を前方MOTのために使用されますイオンは、しかし、つま先を90センチ歩いたり、足の一部がケージの底/テーブルに沿ってドラッグしている間に少なくとも二度下向きにカール。マウスは、その左右側に配置されている場合には、両側から10秒以内に自身を右することができます。
   4. 以下が観察されている場合は、NS 3（麻痺）を割り当て：マウスを尾によって中断されると、後肢または最小限の関節の動きの剛性麻痺があります。マウスを歩くことを許可されている場合には、前方が後肢は前進運動のために使用されていない動きがあります。マウスは、その左右側に配置されている場合には、両側から10秒以内に自身を右することができます。注：まれに、麻痺の発症後、尿の水分が後肢に表示されない場合があります。左未処理の尿の水分が尿に「バーン」と皮膚病変を引き起こす可能性があります。髪をクリッピングすることによって尿の水分を扱い、暖かい水が尿を除去するために浸す適用され、静かに乾燥ブロット。皮膚病変が存在する場合antibio適用チック軟膏。
   5. 以下が観察されている場合は、NS 4（動物愛護エンドポイント）を割り当てます。マウスを尾によって中断されると、後肢で剛性麻痺があります。マウスを歩くことを許可された場合、何の前進運動はありません。マウスは、その左右に配置されているとき、それはどちらの側から10秒以内に自分自身を右することはできない。 すなわち、立ち直り反射の欠如。

4.データ入力と分析

1. 薬効の研究の過程で、研究室情報管理システム（LIMS）に各マウスについて、市販の表計算ソフトに収集されたデータを入力します。
   注意：ALS TDI-開発LIMSソフトウェアは、ALSのTDI研究者のための時間をかけて、これらのデータは便利なアクセスできるように、内部の研究から収集したすべてのデータの中央リポジトリです。 LIMSは、すべての試験日に戻ってその系統、体重または神経学的スコアに、そのユニークなIDで、任意の個々のマウスを追跡し、その有効期間中に注意し、他の観測値が含まれています。 LIMSは、最終的にはその後の分析のために使用されているスプレッドシートを生成します。
2. 薬効試験の完了時、 すなわち、全てのマウスは、左と右の後肢NSを平均化することによって毎日のために、各マウスのための組み合わせNSを計算するために人道的エンドポイント用表計算ソフト（材料の表を参照）に達したとき。次に、各マウスそれぞれのマウスは、特定のNSに費やした日数の間、それぞれのNSで年齢の中央値を計算します。
3. 統計ソフトウェアに表計算ソフトからデータをインポートすることで、時間をかけて、NSの全体的な変化を分析（材料の表を参照のこと）。中央値NS時の年齢と回帰における効果などの薬物治療と、期待NSを推定順序ロジスティック回帰モデルを使用してこれらのデータを合わせます。ログランクカイ二乗検定を用いて効果尤度確率を推定し、NS進行に対する薬物治療の効果は統計的であるかどうかを判断LY有意な（ステップバイステップの手順については、補足コードファイルを参照してください）​​。
   注：p値<0.05は、統計学的に有意であると考えられます。
   注：統計分析するこの方法は、NSデータと個々のマウスのNS軌跡の可変性の序性質を尊重します。個々のNS軌跡がNS応答の十分に反映していないNS時間に関連するグループの平均値が得られる著しく異なるものとすることができるので、好ましいです。加えて、いくつかのケースでは、特にNSときゼロから1つの範囲で変動することができます。
4. 最後に、薬剤処理動物と対照動物のためのグラフ（;補足コードは、ステップバイステップの手順については、ファイルの図 2を参照）、「序数はNS時の年齢中央値対NSを期待」を生成する（材料の表を参照してください）ソフトウェアのグラフを使用します。 私は （便利なy軸から疾患の発症年齢の中央値を補間することにより、薬物治療群と対照群との間のシフトを推定するためにこれらのグラフを使用してください。Eは、x軸上のNS 2）。
   注：二つのグループ間の年齢の中央値の差は、薬剤誘発性のシフトを表しており、効果の大きさの実用的な尺度として扱われます。
   注意：予想NS対年齢の中央値曲線が右へシフトが遅く症候性疾患の進行を示しています。逆に、予想NS対年齢の中央値曲線の左方シフトが加速症候性疾患の進行を示しています。

結果

90男性と94女性の非処置SOD1-G93Aマウスのデータは2014年の間に、ALS TDIで学ん神経学的スコアを評価しました。結果は、女性に比べNS 1におけるその寿命の大部分によって証明されるように、雄マウスは、典型的に、雌のマウスよりもより攻撃的な疾患進行を有することを示しています。 NS 2、NS 3は、男女全体で事実上等しい頻度で発生します。それは「通常の」表現型と考えられているので、NS...

ディスカッション

本稿では、適切に適用された場合、迅速かつ簡単にビデオプロトコルを記述し、確実にSOD1-G93Aマウスにおける疾患の進行を評価し、薬物誘発性の変化を識別することができます。別のグループは、SOD1-G93Aマウス^8〜10のための表現型のスコアリングシステムを開発してきたが、それらは多くの場合、手続きに十分な詳細を提供し、レプリケーションのために不十分であるしないでくだ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	002726	Strain of mice used in this study
Breeders	Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA		Colony maintainance
Scale	Navigator OHAUS, Parsippany, NJ	Model N14120	Used to weigh mice
Nutra-GelH	Bio-Serv, Flemington, NJ	#S4798	Wet food provided to sick mice
Irradiated Lab Animal Diet	Harlan, Indianapolis, IN	2918-111914M	Chow diet
Lab-grade Sani-chips	Harlan Teklad, Indianapolis, IN	7090	Bedding
JMPH	SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC	v10.0.2	Statistical software
Microsoft Excel	Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA	Excel 2013 (v 15.0)	Spreadsheet software
GraphPad Prism 5	GraphPad software Inc., La Jolla, CA	v5.4	Graphing software
Mouse Huts	Bio-Serv, Flemington, NJ	K3272	For environmental enrichment