عالية الإنتاجية<em&gt; دانيو Rerio</em&gt; طاقة الإنفاق الفحص

Summary

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH₂ sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Abstract

الزرد هي كائن نموذجا هاما مع المزايا الكامنة التي لديها القدرة على جعل الزرد نموذجا يطبق على نطاق واسع لدراسة توازن الطاقة والسمنة. صغر حجم الزرد يسمح لفحوصات على الأجنة التي ستجري في شكل لوحة 96- أو 384-جيدا والتكنولوجيات Morpholino وكريسبر أساس تعزيز سهولة التلاعب الجيني، والعلاج من تعاطي المخدرات من خلال تطبيق الحمام غير قابلة للحياة. وعلاوة على ذلك، الزرد مثالية لشاشات الوراثية إلى الأمام السماح لاكتشاف الجين الرواية. نظرا لحداثة النسبية للالزرد كنموذج للسمنة، فمن الضروري لتطوير الأدوات التي تستغل بشكل كامل هذه الفوائد. هنا، نحن تصف طريقة لقياس استهلاك الطاقة في الآلاف من الزرد الجنينية في وقت واحد. قمنا بتطوير كامل منصة صفيحة ميكروسكوبية الحيوانات التي نستخدمها لوحات 96-جيدا لعزل الأسماك الفردية ونقيم التراكمي إنتاج NADH ₂ باستخدام المتاحة تجاريا زراعة الخلايا جدوى إعادةوكيل alamarBlue. في متغيرات الحرارة ترتبط بإحكام العلاقة بين NADH ₂ إنتاج واستهلاك الطاقة. هذا الاختبار نفقات الطاقة يخلق القدرة على الشاشة بسرعة التلاعب الدوائية أو الوراثية التي تغير مباشرة نفقات الطاقة أو تغيير الاستجابة لدواء التطبيقية (على سبيل المثال محسسات الأنسولين).

Introduction

الفأر هو حاليا النموذج السائد للأبحاث السمنة. كانت فترة جيل قصيرة والأدوات الجينية المتاحة في الماوس لا مثيل لها حتى الآن. ومع ذلك، فقد الزرد أيضا فاصل الجيل قصيرة (3-4 أشهر)، ويفوق حتى الماوس في سهولة التلاعب الجيني ^1،2. يحافظ على الزرد ما يقرب من 90٪ من الجينات الثدييات، في حين يتجاوز بكثير الماوس في عدد من ذرية والإمكانات للاستخدام في شاشات الوراثية والمخدرات ^3.

للاستفادة من إمكانات من طراز الزرد للدراسات في السمنة، ويجب وضع المقايسات للتحقيق في العوامل التي تؤثر على تنظيم وزن الجسم، بما في ذلك نفقات الطاقة. كما تتم معالجة الأيض من خلال β للأكسدة وحمض الكربوكسيليك دورة الأكسجين ويستهلك وينتج NADH _2. وهكذا، NADH ₂ هو مؤشر مباشر على تدفق الأيض من خلال المسارات الأيضية (التمثيل الأيضي الأكسدة). في poikilotherms، H ⁺ تسرب من خلال غشاء الميتوكوندريا الداخلية، التي uncouples NADH ₂ الأكسدة من ATP التوليف، هو 4-5 أضعاف أقل مما كانت عليه في متجانسات الحرارة ^4. وفقا لذلك، في NADH الزرد ₂ يرتبط بإحكام جدا لإنتاج ATP من خلال الفسفرة التأكسدية. هنا، نحن تصف مقايسة الذي يقيس NADH ₂ الإنتاج في الزرد اليرقات كوكيل للإنفاق الطاقة ^5.

استهلاك الأوكسجين هو المعيار الذهبي لقياس استهلاك الطاقة. ومع ذلك، وإلى الاستفادة القصوى من إمكانيات إنتاجية عالية من الزرد، ويجب أن تكون المقايسات من نفقات الطاقة قابلة للالإنتاجية العالية. نظم استهلاك الأوكسجين التي تعتمد على غرفة مغلقة تعميم نظام محدودة في الإنتاجية من قبل عدد من الغرف ^{المتاحة} 6. فتح O الهواء ₂ استهلاك / CO ₂ فحوصات الإنتاج كما تم تطبيقه في الزرد ^5،7. هذه 96-جيدا في الهواء الطلق لوحة قاعدةنظم د قابلة للإنتاجية عالية. للأسف، تبادل الغازات مع البيئة يحد حساسية هذه المقايسات. نشرنا مؤخرا تطبيق مقايسة التي تراقب NADH ₂ باستخدام مؤشر الأكسدة alamarBlue ^5. هذا الاختبار يتغلب على القيود في سرعة وحساسية مشتركة لتحليل استهلاك الأوكسجين في الزرد.

الزرد أصبحت نموذجا متزايد الأهمية للدراسات كله توازن الطاقة في الجسم. في جزء منه، لأن الزرد هي قابلة للاستخدام في شاشات الوراثية إلى الأمام وشاشات المخدرات. وعلاوة على ذلك، تستهدف التلاعب الجيني، بما في ذلك ضربة قاضية واضعا في، ويمكن تطبيقها بسرعة. لقد أظهرنا سابقا أن هذا الاختبار يمكن دمجه مع تطبيق حمام المخدرات وضربة قاضية وراثية أو خروج المغلوب لتحديد المركبات والجينات التي تغير معدل الأيض ^5. وعلاوة على ذلك، تم تصميم هذا الاختبار لاستغلال مزايا الإنتاجية العالية المتأصلة في الزرد.

Protocol

ملاحظة: هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للجامعة أريزونا مكتب للسلوك المسؤول من البحوث وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي

1. تربية اسماك الزرد والصيانة الأجنة

1. إعداد E3 المتوسط ​​الجنين ^8. جعل 60X حل سهم، ويحل 34.8 غرام كلوريد الصوديوم، 1.6 غرام بوكل، 5.8G CaCl ₂ ^● 2H ₂ O، و9.78 ز MgCl ₂ ^● 6H _{2 O} في 1.95 L ddiH ₂ O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك ضبط مستوى الصوت إلى 2 لتر باستخدام ddiH ₂ O.
2. لإعداد 1X E3 المتوسط ​​الجنين، وتمييع 16.5 مل 60X الأسهم في 1 L ddiH20. إضافة 100 ميكرولتر 1٪ الميثيلين الأزرق.
3. تربية
   1. منزل ذكر وأنثى الأسهم الحضنة (7-18 شهرا من العمر) على حدة لتحقيق أقصى قدر من الخصوبة.
   2. تحويل الأنوار 1-2 ساعة قبل يوم قبل أن يتم المطلوب البيض. إعداد التزاوج (1 الذكور و1-2 إناث) في جأقفاص rossing كما هو موضح سابقا ^9. أقفاص عبور تسمح للبيض للهروب الافتراس لأنها تمر من خلال قاعدة مثقبة من إدراج دبابات التي تقام في الأسماك البالغة.
   3. اختياري: لتربية الموقوتة، (كما ستكون هناك حاجة لدراسات شملت morpholino حقن)، فصل الذكور والإناث الأسماك التي كتبها مقسم البلاستيك الشفاف، إزالة هذا في الصباح أن يؤدي إلى زرع توقيت البيض والإخصاب. لmorpholino الدراسات وإجراء عمليات حسابية القدرة على تقييم عدد من الأسماك الجنينية المطلوبة لكل معاملة. دون تقدير لحجم تأثير أو الاختلاف، يمكن تشغيل محاكمة الأولية مع ن = 8.
4. صب البيض من القفص معبر في طبق بتري (100-150 الأجنة / 10 سم طبق بتري). السماح للبيض لتستقر في قاع الطبق وتخلصي من الماء. إزالة أي المياه المتبقية باستخدام طرف غرامة نقل المتاح ماصة. إضافة مرة أخرى E3 المتوسط ​​الجنين في الخطوة 1.1.
5. جعل بالعربيةعرجاء ماصة المتاح مصقول للبيضة في المستقبل، ونقل الأسماك. باستخدام مقص، وقطع نقل المتاح ماصة تخرج في تخريج 0.25 مل. لإزالة حواف خشنة، والبولندية لهب قطع أكثر من طرف على موقد بنسن.
6. الحفاظ على الأسماك الجنينية إلى 4 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) في 10 سم أطباق بتري في الزرد المتوسطة E3 الجنين في 28.5 ^○ C. كل يوم مرتين، واستخدام اللهب مصقول تخرج نقل المتاح ماصة لإزالة أي بويضة غير مخصبة أو الأجنة الميتة (ظهور الأبيض مبهمة). مرة واحدة كل يوم، استبدال E3 المتوسط ​​الجنين. تخلصي E3 المتوسط ​​الجنين، وإزالة السائل المتبقي باستخدام طرف غرامة نقل المتاح ماصة، وإضافة مرة أخرى قبل تحسنت (28.5 ^○ C) E3 المتوسط ​​الجنين.

2. إعداد الفحص الحل

1. تحضير محلول الفحص وفقا للجدول 1. محلول معقم مرشح فحص باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر. قبل لفحص بدء، تدفئة حل فحص العقيمة في 28.5 ^○ Cحمام الماء.

عنصر	٪ من إجمالي	الحجم (ميكرولتر / 10 مل)
60X E3 الأجنة المتوسطة	1،667	166.7
منزوع الأيونات المزدوج (DDI) H 2 0	96،233	9623.3
الامار الأزرق	1	100
400 ملي هيدروكسيد الصوديوم	1	100
DMSO	0.1	10

الجدول 1. الفحص المتوسطة

3. إجراء الفحص

1. شطف الأجنة الزرد 3 مرات مع العقيمة التي تمت تصفيتها E3 المتوسط ​​الجنين. الجمع بين جميع الأجنة الزرد قابلة للحياة من مخلب في دورق. تصفية العقيمة 75 مل E3 المتوسط ​​الجنين. باستخدام طرف غرامة نقل المتاح ماصة، وإعادةنقل أكبر قدر من المتوسط ​​الجنين E3 من الأجنة الزرد وقت ممكن. إضافة إلى الوراء 20 مل العقيمة التي تمت تصفيتها E3 المتوسط ​​الجنين. إزالة واستبدال E3 المتوسط ​​الجنين 3 مرات.
2. لوحة 1 الأسماك في كل من 93 بئرا من الأسود 96-جيدا وقفت أسفل لوحة واضحة. نقل الأسماك الجنينية لوحة من قبل التقاط فردي الجنين داخل اللهب مصقول تخرج من البلاستيك القابل للتصرف نقل ماصة (الخطوة 1.5) وإخراج بلطف في البئر. نقل E3 المتوسط ​​الجنين المأخوذة من دورق يحتوي على الأسماك تشطف في 3 آبار فارغة. هذا يضمن أن بئر فارغة تعرضوا لنفس الماء بالضبط كما الآبار التي تحتوي على الأسماك. يجب على الآبار التي تحتوي على الأسماك والآبار فارغة تكون على الاقل ½ الكامل (200 ميكرولتر) في ختام هذه الخطوة.
3. استبدال E3 الجنين المتوسطة مع الحل فحص في جميع الآبار 96، بما في ذلك آبار فارغة. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة 1 عمود في وقت لكل من الأعمدة 12 في 96 لوحة جيدا. باستخدام طرف غرامة التخلص منها عبرفر ماصة، وإزالة E3 المتوسط ​​الجنين من كل جيدا في عمود واحد من لوحة (8 آبار). الحرص على عدم لمس الجنين الزرد. إضافة 300 ميكرولتر من محلول الفحص على كل جانب من التي تمت إزالة المياه. تكرار إزالة E3 المتوسط ​​الجنين واستبدال مع حل فحص لجميع الأعمدة 12 لوحة.
4. اختياري: لاختبار تغير معدل الأيض ردا على المجمع، وجعل الحل الذي هو 100 مرات (100X) تركيز العلاج المطلوب. من المذكرة، وضمان أن الحل 100X لا يتجاوز 10٪ DMSO للحد من تركيز DMSO النهائية بما لا يزيد عن 0.1٪. إضافة 3 ميكرولتر من الحل 100X إلى كل من الآبار العلاج.
   ملاحظة: إجراء العمليات الحسابية القدرة على تقييم عدد من الآبار العلاج. ومع ذلك، من دون تقدير لحجم الاستجابة أو الاختلاف، يمكن تشغيل محاكمة تمهيدية في 8 مجمع المعالجة و8 مركبة تعامل آبار المراقبة التي تحتوي على الأسماك.
   1. إضافة 3 ميكرولتر من السيطرة على السيارة لسيطرة (لا دروز العلاج) الآبار التي تحتوي على الأسماك. لضمان الاستجابة الفلورسنت إلى المركب هو نتيجة للإجراءات داخل الأسماك، وتطبيق العلاجات الدوائية والمركبات إلى 3 آبار فارغة في 96 لوحة جيدا.
5. قراءة الأسماك شغل وحة على قارئ لوحة الفلورسنت مع الطول الموجي الإثارة في 530 نانومتر والطول الموجي الانبعاثات في 590 نانومتر.
6. مكان لوحة في حاضنة ترطيب مجموعة إلى 28.5 ^○ C (الحفاظ على لوحة في الظلام طوال فحص لتجنب photobleaching من محلول الفحص). يمكن تشغيل مقايسة لفترات من الزمن تتراوح من 1 ساعة إلى 24 ساعة. مدة الاختبار يعتمد على الهدف من الدراسة. لاختبار استجابة لمركب غير مستقر قصير المفعول قد تكون قصيرة المدة الأنسب. بعد، لاختبارات مجمع مستقرة أو اختبارات التأثيرات الجينية، وتعظيم مدة الفحص هو الأفضل لاستغلال المزايا المرتبطة إشارة تراكمية.
7. في نقطة زمنية محددة مسبقا (انظر الخطوة 3.6 للمساعدة في تحديد التوقيت)قراءة مضان لوحة مليئة الأسماك مرة أخرى مع نفس الإعدادات كخطوة 3.5.

4. تقييم التغير النسبي في الإسفار أسوشيتد مع العلاج

1. حساب التغير في مضان من كل بئر من خلال طرح مضان في وقت 0 من مضان في ختام الدراسة. يجب آبار بلا الأسماك (الفراغات) لديها قيم بالقرب من 0، أقل بكثير من القيم من الآبار التي تحتوي على الأسماك.
   تغيير في الإسفار = الإسفار في ختام - مضان في وقت 0
2. للتأكد من التغير النسبي في مضان، وحساب متوسط ​​التغير في مضان لآبار المراقبة ثم يقسم التغير في مضان من كل بئر من متوسط ​​التغير في مضان من آبار المراقبة. وتجدر الإشارة، يمكن التحكم تكون إما الضوابط سيارة أو الضوابط الوراثية.
   

النتائج

حل الاختبار لا يزيد مضان في غياب الأسماك الجنينية (الشكل 1). ومع ذلك، فإن فحص حساس جدا لتغيرات صغيرة في معدل الأيض داخل البئر. سمكة واحدة داخل بئر يخلق إشارة مختلفة إلى حد كبير من الآبار فارغة في حدود 1 ساعة (P <0.0001). الشكل 2 يوفر التمثيل البصري من الإشا?...

Discussion

سوف التلوث بالبكتيريا أو الفطريات يحد بشكل كبير من تطبيق هذا الاختبار. الأزرق الميثيلين في المتوسط ​​الجنين E3 يحد من إمكانية التلوث الفطري. في جميع أنحاء الجنين تربية فمن الأهمية بمكان أن الرعاية التي اتخذت لإزالة الأجنة الميتة مرتين كل يوم. بالإضافة إلى ذلك، فمن ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	Manufactured by Thermo Scientific
Fine Tip DisposableTransfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-26	Manufactured by Thermo Scientific
Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-771-9AM	Manufactured by Thermo Scientific
Black sided clear bottom 96-well plates	Fisher Scientific	50-320-785	Manufactured by E&K Scientific Products Inc.