高通量<em&gt;斑马鱼</em&gt;能量消耗分析

摘要

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH₂ sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

摘要

斑马鱼是一种重要的模式生物与必须使斑马鱼的能量平衡和肥胖的研究中广泛应用模式的潜在先天的优势。斑马鱼的小尺寸允许在胚胎测定以在96或384孔板形式进行，基于吗啉代和CRISPR技术促进易于遗传操作，和药物治疗通过浴的应用是可行的。此外，斑马鱼是理想的正向遗传学屏幕允许新基因的发现。定斑马鱼的相对新颖作为模型肥胖，有必要开发工具，充分利用这些好处。在此，我们描述了一个同时测量数千胚胎斑马鱼的能量消耗的方法。我们已经开发出一种整体动物微孔板平台，其中，我们使用96孔板来分离单个鱼和我们评估使用市售的细胞培养物生存力重新累积NADH ₂生产代理的AlamarBlue。在变温动物NADH _2产生和能量消耗之间的关系是紧密相连。这种能量消耗测定创建快速筛选药理学或遗传操作直接改变能量消耗或改变响应于施加的药物（例如，胰岛素增敏剂）的潜力。

引言

鼠标是目前肥胖症研究的主要模式。短世代间隔，并在鼠标可用的遗传工具已经无可匹敌的日期。然而，斑马鱼也有一个短的世代间隔（3 - 4个月）和甚至超过了鼠标的易用性基因操纵^1,2。斑马鱼保持近90％的哺乳动物的基因，而远远超过了鼠标的后代和潜在的遗传和药物屏幕³的使用数量。

为了开发用于肥胖症的研究斑马鱼模型的潜力，试验必须制定调查影响体重调节，包括能源消耗的因素。作为代谢物通过β氧化和三羧酸循环氧处理被消耗和NADH ₂就产生了。因此，NADH ₂是代谢物的通过代谢途径（代谢物氧化）的磁通的直接指标。在poikilotherms ^H +泄漏通过线粒体内膜，该脱开NADH _2氧化从ATP合成，是4 - 5比恒温动物⁴倍以下。因此，在斑马鱼NADH ₂是非常紧密通过氧化磷酸化连接于ATP的产生。在此，我们描述了测量NADH ₂生产幼虫斑马鱼作为能量消耗⁵代理的检测。

耗氧量的黄金标准测量的能量消耗。然而，为了最好的利用斑马鱼的高通量的潜力，能量消耗的测定必须是适合于高通量。依赖于一个封闭的腔室循环系统氧消耗系统的吞吐量由可用⁶室的数目的限制。露天_氧气消耗量/ CO ₂的生产试验也已在斑马鱼^5,7应用。这些开放空气96孔板基D系统适于高吞吐量。不幸的是，与环境进行气体交换限制这些测定的灵敏度。我们最近公布了使用氧化还原指示剂的AlamarBlue ⁵监视NADH ₂的检测中的应用。该测定中克服了吞吐量和共同到氧消耗在斑马鱼的分析灵敏度的限制。

斑马鱼正在成为整个身体能量平衡的研究日益重要的模式。在某种程度上，因为斑马鱼是适合于向前遗传筛选和药物屏幕使用。此外，有针对性的遗传操作，包括敲除和敲入，可以快速应用。之前我们已经表明，这种检测可以与浴药的应用和基因敲除或基因敲除结合起来，以确定化合物的基因，改变代谢率^5。此外，该试验被设计用于利用固有的斑马鱼的高通量的优点。

研究方案

注:该协议遵循亚利桑那州办公室的大学研究的负责行为准则和已批准的机构动物护理和使用委员会

1.斑马鱼繁殖和胚胎维护

1. 准备E3胚胎中期^8。为了使60X贮备液，溶解34.8克氯化钠1.6克氯化钾，氯化钙5.8克_{^2●2H 2} O和9.78克_氯化镁 ^●6H _{2 O}在1.95大号ddiH ₂ O.调节pH至7.2用NaOH和HCl调节音量用ddiH _{2 O} 2升
2. 为了准备1X E3胚胎中期，淡化16.5毫升60倍的股票在1升ddiH20。加入100微升1％亚甲蓝。
3. 选育
   1. 宅男和女亲鱼（7 - 18个月）分别以最大限度地提高繁殖力。
   2. 前2小时，当天鸡蛋所需的前 - 关灯1。建立交配（1男1 - 2名女性）在C罗辛笼如前所述^9。渡网箱允许鸡蛋逃脱捕食，因为他们通过在成鱼保持油箱插入的穿孔基地通过。
   3. 择:对于定时育种，（如，将需要涉及吗啉注射研究），分离雌雄鱼由透明塑料分频器，在上午除去此导致卵受精的定时铺设。对于吗啉的研究，进行功率计算，以评估每次治疗所需的胚胎的鱼的数量。没有效果或变化的幅度的估计，一个初步试验可有n = 8运行。
4. 倾从交叉笼将鸡蛋打入培养皿（100 - 150胚胎/ 10厘米培养皿）。允许卵沉淀到培养皿的底部，并倒出水。用细尖一次性移液管中取出所有剩余的水。加回步骤1.1取得E3胚胎中期。
5. 使自动对焦跛脚抛光一次性吸管为今后的蛋和鱼转移。用剪刀剪毕业一次性移液管以0.25ml毕业。要删除粗糙的边缘，火焰抛光切割端过本生灯。
6. 在斑马鱼胚胎的E3介质的培养皿在^28.5○C.保持胚胎鱼至4天受精后（dpf）的10厘米每天两次，用火焰打磨毕业一次性移液管，以消除任何未受精的卵子或胚胎死亡（不透明的白色外观）。每天一次，更换E3胚胎中期。倒掉E3胚胎培养基，用细尖一次性移液管除去残留的液体，加回预热^{（28.5○C）E3}胚胎中期。

2.准备分析解决方案

1. 根据使用0.22微米过滤器表1.无菌过滤器测定溶液制备测定溶液。在测定前启动，暖在^28.5○C无菌检测解决方案水浴。

成分	％的总	卷（微升/ 10毫升）
60X E3胚胎中期	1.667	166.7
双去离子（DDI）H 2 O	96.233	9623.3
阿尔玛蓝	1	100
400毫米氢氧化钠	1	100
DMSO	0.1	10

表1.分析培养基

3.执行分析

1. 冲洗斑马鱼胚胎3次，无菌过滤E3胚胎中期。将所有可行的斑马鱼胚胎从离合器放入烧杯中。无菌过滤器75毫升E3胚胎中期。用细尖一次性移液管，重新从斑马鱼胚胎尽可能将尽可能多的E3胚胎中期的。添加倒退20毫升无菌过滤E3胚胎中期。卸下并更换E3胚胎中期的3倍。
2. 板1成鱼每93孔96孔黑色的双面明确的底板。通过单独捕获胚胎内的火焰磨光毕业一次性塑料移液管（步骤1.5），轻轻地喷射到井内的胚胎鱼转移到板上。从转移含有清洗鱼放入3空白孔烧杯中采取E3胚胎中期。这确保了空白孔被暴露了完全相同的水作为含有鱼类的孔中。包含鱼和空白孔两口井应至少半满（200微升）在这一步的结论。
3. 更换E3胚胎中期，在所有96个孔，其中包括空白孔检测解决方案。此步骤，应执行1列的时间为每个在96孔板的12个列。使用精尖的一次性反FER吸管，从每一个井板（8孔）的一列去除E3胚胎中期。小心不要碰斑马鱼胚胎。添加300微升测定溶液至每孔从其中除去水。重复使用的板的所有12列测定溶液去除E3胚胎中期和更换。
4. 择:为了测试响应于化合物的代谢速度的变化，使一个解决方案，是100倍（100X）所需的治疗浓度。值得注意的是，确保了100倍的溶液不超过10％的DMSO，以限制最终DMSO浓度到不超过0.1％以上。加入3微升100倍的溶液，以各处理井。
   注:执行功率计算以评估治疗井的数量。然而，如果没有响应或变化的大小的估计，一个初步试验可在处理8化合物和包含鱼8载体治疗的对照孔中运行。
   1. 加入3微升车辆控制来控制（没有DRU摹处理），包含鱼井。为了确保到化合物的荧光响应是的鱼中的动作的结果，应用药物和车辆处理，以3空白孔在96孔板中。
5. 阅读荧光酶标仪激发波长为530 nm，发射波长为590纳米的鱼填板。
6. 将板进入加湿孵化器设置为^28.5○C（保持板在黑暗整个试验，以避免测定溶液漂白）。该分析方法可用于持续时间的范围从1小时至24小时运行。测定法的持续时间取决于研究的目标。用于测试响应于短效非稳定化合物短的持续时间可能是最适合的。然而，对于稳定的化合物测试或遗传效应试验，最大限度地提高检测的持续时间最好利用与累积的信号相关的优点。
7. 在预先确定的时间点（见步骤3.6，以帮助确定时序）使用相同的设置步骤3.5再读鱼填充板的荧光。

4.评估在荧光相关的相对变化与治疗

1. 井通过从荧光减去荧光在时间0在研究结束时计算变化中的每个的荧光。井无鱼（空格）应包含鱼井还有一些值接近0，远低于价值。
   更改荧光=荧光的结论 - 荧光在时间0
2. 为了确定在荧光的相对变化，计算在荧光的平均变化对于对照孔，然后通过在对照孔的荧光的平均变化除以在的各孔的荧光变化。值得注意的是，对照可以是载体对照或基因控制。
   

结果

测定溶液不会在没有胚胎鱼（图1）增加的荧光。然而，该测定是在井内代谢率的微小变化高度敏感。内一个井的单个鱼产生的信号在1小时内（P <0.0001）显著不同于空白孔中。 图2提供了孵育24小时后通过胚胎鱼产生的信号的视觉表示。对于这张照片的目的明确的双面井使用。然而，黑色双面井优选用于测定性能，以防止来自附近孔的荧光信号的浸出。

讨论

污染与细菌或真菌将极大地限制了应用此法的。在E3胚胎培养基中的亚甲基蓝限制真菌污染的可能性。在整个胚胎饲养至关重要的是，小心一天两次，每次去除死胚胎。此外，有必要彻底冲洗用无菌的E3胚胎培养基中的胚上测定引发的天。这些2步限制用于胚胎细菌污染的可能性。列入步骤3.2中所述空白孔中可以检测任何细菌污染。细菌污染而产生可测量的信号是罕见的。然而，如果空白孔做显示?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	Manufactured by Thermo Scientific
Fine Tip DisposableTransfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-26	Manufactured by Thermo Scientific
Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-771-9AM	Manufactured by Thermo Scientific
Black sided clear bottom 96-well plates	Fisher Scientific	50-320-785	Manufactured by E&K Scientific Products Inc.