High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energia Despesas Assay

Resumo

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH₂ sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Resumo

Peixe-zebra são um modelo importante organismo com vantagens inerentes que têm o potencial para fazer zebrafish um modelo amplamente aplicado para o estudo da homeostase da energia e da obesidade. O pequeno tamanho do peixe-zebra permite ensaios sobre os embriões para ser conduzido num formato de placa de 96 ou 384 poços, morfolino e tecnologias baseadas CRISPR promover a facilidade de manipulação genética, e no tratamento de droga por aplicação de banho é viável. Além disso, peixe-zebra são ideais para telas genéticos para a frente, permitindo a descoberta do gene para a novela. Dada a relativa novidade do peixe-zebra como um modelo para a obesidade, é necessário desenvolver ferramentas que exploram plenamente esses benefícios. Aqui, nós descrevemos um método para medir o gasto de energia em milhares de peixes-zebra embrionária simultaneamente. Nós desenvolvemos uma plataforma de microplacas animal completo no qual usamos placas de 96 poços para isolar cada peixe e avaliar cumulativa de produção de NADH usando a ₂ disponível comercialmente cultura celular viabilidade reagente alamarBlue. Em poiquilotérmicos a relação entre NADH ₂ produção e gasto de energia está intimamente ligado. Este ensaio gasto energético cria o potencial para a tela rapidamente manipulações farmacológicas ou genéticas que alteram diretamente o gasto de energia ou alteram a resposta a um fármaco aplicada (por exemplo, sensibilizadores de insulina).

Introdução

O mouse é atualmente o modelo predominante para a investigação de obesidade. O curto intervalo de geração e ferramentas genéticas disponíveis no rato têm sido inigualável até à data. No entanto, o peixe-zebra também tem um intervalo de geração curto (3 - 4 meses) e supera até mesmo o mouse na facilidade de manipulação genética ^1,2. O peixe-zebra mantém quase 90% de genes de mamíferos, enquanto ultrapassando o mouse no número de descendentes e potencial para uso em telas genéticos e medicamentos ^3.

Para explorar o potencial do modelo peixe-zebra para estudos em obesidade, os ensaios devem ser desenvolvidos para investigar os fatores que influenciam a regulação do peso corporal, incluindo as despesas de energia. Como metabolitos são processados ​​através β-oxidação e o ácido tricarboxílico ciclo oxigénio é consumido NADH e ₂ é produzido. Assim, NADH ₂ é um indicador directo do fluxo de metabolitos através de vias metabólicas (oxidação metabolito). Em poikilotherms, ^H + vazar através da membrana mitocondrial interna, que desacopla o NADH ₂ de oxidação a partir da síntese de ATP, é de 4 - 5 vezes menor do que em homeotérmicos ^4. Assim, em NADH ₂ peixe-zebra é muito bem ligados à produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Aqui, descrevemos um ensaio que mede a produção de NADH _{2 em} zebrafish larval como um proxy para o gasto energético ^5.

O consumo de oxigênio é o padrão ouro para medir o gasto de energia. No entanto, para melhor aproveitar o potencial de alto rendimento do peixe-zebra, ensaios de gasto de energia devem ser passíveis de high-throughput. Sistemas de consumo de oxigênio que dependem de uma câmara fechada, sistema de circulação são limitados em taxa de transferência pelo número de câmaras disponíveis ^6. Open air _consumo de O 2 / CO ₂ ensaios de produção também foram aplicadas no peixe-zebra ^5,7. Estes ar livre de 96 poços placa de baseD Systems são passíveis de alto rendimento. Infelizmente, as trocas gasosas com o ambiente de limites de sensibilidade destes ensaios. Nós publicada recentemente a aplicação de um ensaio que monitora NADH _{2, utilizando o} indicador redox alamarBlue ^5. Este ensaio supera as limitações na taxa de transferência e sensibilidade comum às análises de consumo de oxigênio no peixe-zebra.

O peixe-zebra está se tornando um modelo cada vez mais importante para estudos da homeostase energética do corpo inteiro. Em parte, por causa do peixe-zebra são passíveis de uso em telas genéticos para a frente e telas de drogas. Além disso, orientada manipulação genética, incluindo knockdown e knock-in, pode ser aplicada rapidamente. Nós mostramos anteriormente que este ensaio pode ser combinado com a aplicação de drogas e banho de knockdown ou nocaute genético para identificar compostos e genes que alteram a taxa metabólica ^5. Além disso, este ensaio foi concebido para explorar as vantagens de elevada capacidade inerentes ao peixe-zebra.

Protocolo

Nota: Este protocolo segue as diretrizes da Universidade do Arizona Gabinete de Conduta Responsável em Pesquisa e foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional

1. Criação de peixe-zebra e Embryo Manutenção

1. Prepare meio embrião E3 ^8. Fazer 60x solução estoque, dissolver 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g _de CaCl2 ^● 2H _{2 O,} e 9,78 g _de MgCl2 ^● 6H _{2 O em} 1,95 L ddiH ₂ O. Ajustar o pH para 7,2 usando NaOH e HCl Ajustar o volume para 2 L, utilizando ddiH ₂ O.
2. Para preparar o meio embrião E3 1x, diluir 16,5 ml 60x estoque em 1 L ddiH20. Adicionar 100 mL de 1% de azul de metileno.
3. Reprodução
   1. Casa Masculino e Feminino reprodutores (7 - 18 meses de idade) separadamente para maximizar a fecundidade.
   2. Desligue as luzes 1 - 2 horas antes, no dia anterior ovos são desejados. Configure o acasalamento (1 macho e 1 - 2 fêmeas) em cgaiolas Rossing ⁹ como previamente descrito. Cruzando gaiolas para permitir que os ovos a predação escapar à medida que passam através da base perfurada da peça inserta na qual o tanque de peixes adultos são realizadas.
   3. Opcional:. Para reprodução programada, (como seria necessário para estudos envolvendo morfolino injeção), separe a peixes machos e fêmeas por um divisor de plástico transparente, Remover esta manhã para resultar na colocação cronometrado dos ovos e fertilização. Para morfolino estudos, realizar cálculos de energia para avaliar o número de peixes embrionário exigido por tratamento. Sem uma estimativa da magnitude do efeito, ou variação, um ensaio preliminar pode ser executado com uma N = 8.
4. Despeje os ovos a partir do cruzamento de gaiola em uma placa de Petri (100 - 150 embriões / 10 centímetros placa de Petri). Permita que os ovos se depositam no fundo do prato e despeje a água. Retire toda a água restante usando uma ponta fina transferência descartável da pipeta. Adicionar costas meio E3 embrião feita na etapa 1.1.
5. Faça afpipeta descartável polido lame para o ovo futuro e transferência de peixes. Com uma tesoura, corte uma pipeta de transferência descartável formado pela graduação de 0,25 ml. Para remover arestas, polonês chama a ponta corte sobre um bico de Bunsen.
6. Manter peixes embrionárias para 4 dias após a fertilização (DPF) em 10 cm placas de Petri em meio E3 embrião de peixe-zebra a 28,5 ^○ C. Duas vezes por dia, use uma chama polido formou pipeta de transferência descartável para remover quaisquer ovos não fertilizados ou embriões mortos (aparência branca opaca). Uma vez por dia, substitua meio embrião E3. Deitar fora meio embrião E3, remover o líquido restante usando uma ponta fina transferência descartável da pipeta, e adicionar novamente pré-aquecido (28,5 ^○ C) meio embrião E3.

2. Preparar a Solução de Ensaio

1. Preparar a solução de ensaio de acordo com a Tabela 1. Solução de ensaio de filtração estéril utilizando um filtro de 0,22 um. Antes do ensaio de iniciação, aquecer a solução de ensaio estéril numa 28,5 ^○ Cbanho d'água.

Ingrediente	% Do Total	Volume (mL / 10 mL)
60x E3 Embryo Médio	1.667	166,7
Duplo deionizada (DDI) H 2 0	96,233	9623,3
Alamar Blue	1	100
400 mM de NaOH	1	100
DMSO	0,1	10

Tabela 1. Ensaio Médio

3. Execute Assay

1. Enxágüe embriões de peixe-zebra 3 vezes com meio embrião E3 filtrada estéril. Misture todos os embriões de peixe-zebra viáveis ​​do embreagem para um copo. Filtro estéril 75 ml meio embrião E3. Usando uma ponta fina transferência descartável pipeta, remover-se tanto a forma de embrião E3 a partir dos embriões de peixe-zebra quanto possível. Adicionar 20 ml de volta médio embrião estéril filtrada E3. Remover e substituir meio embrião E3 3 vezes.
2. Placa 1 peixe para cada um dos 93 poços de uma de 96 poços preto sided placa clara de fundo. Transferir o peixe embrionária para a placa de captura individualmente por um embrião dentro de uma chama de plástico graduado lustrado pipeta descartável (passo 1.5) e ejectar suavemente para dentro do poço. Transferir meio embrião E3 retirado da proveta contendo os peixes enxaguado em 3 poços em branco. Isto assegura que os poços em branco foram expostas a água da mesma exacta como os poços que contêm peixes. Ambos os poços que contêm peixes e poços de branco deve ser de, pelo menos, ½ completo (200 ul) à conclusão deste passo.
3. Substituir meio embrião E3 com solução de ensaio em todos os 96 poços, incluindo poços em branco. Esta etapa deve ser realizada uma coluna de cada vez para cada uma das 12 colunas de uma placa de 96 poços. Usando uma ponta fina descartável transfer pipeta, remover o meio embrião E3 de cada poço numa coluna de a placa (8 poços). Tome cuidado para não tocar o embrião de peixe-zebra. Adicionar 300 ul de solução de ensaio a cada poço a partir do qual a água foi removida. Repetir a remoção do meio de embrião E3 e substituição com a solução de ensaio para todas as 12 colunas da placa.
4. Opcional: Para testar a alteração da taxa metabólica em resposta a um composto, fazer uma solução que é 100 vezes (100X) a concentração de tratamento desejado. De nota, assegurar que a solução 100x não exceda 10% DMSO para limitar a concentração de DMSO final a não mais do que 0,1%. Adicionar 3 mL da solução de 100x a cada um dos poços de tratamento.
   NOTA: Executar cálculos de potência para avaliar o número de poços de tratamento. No entanto, sem uma estimativa da grandeza da resposta ou variação, um ensaio preliminar pode ser executado em 8 tratado com composto e 8 tratados com veículo poços de controlo que contêm peixes.
   1. Adicionar 3 mL de controlo do veículo para o controlo (sem Drutratamento g) poços que contêm peixes. Para assegurar que a resposta ao composto fluorescente é um resultado das acções dentro do peixe, aplicam-se tratamentos com drogas e 3 do veículo para poços em branco em placa de 96 poços.
5. Leia peixes cheio placa fluorescente leitor de placas com comprimento de onda de excitação a 530 nm e comprimento de onda de emissão a 590 nm.
6. Colocar a placa na incubadora umidificado definida para 28,5 ^○ C (placa de manter na escuridão durante todo ensaio para evitar a fotodegradação de solução de ensaio). O ensaio pode ser executado por períodos de tempo que variam desde 1 h a 24 h. A duração do ensaio depende do objectivo do estudo. Para testar a resposta de um composto não-estável de curta duração de curta duração pode ser mais adequado. No entanto, para os testes composto estável ou testes de efeitos genéticos, maximizando a duração do ensaio é preferível explorar as vantagens associadas com o sinal cumulativo.
7. Em um ponto de tempo pré-determinado (veja o passo 3.6 para ajudar a determinar sincronismo)leia fluorescência de placa cheio de peixe novamente com as mesmas configurações do passo 3.5.

4. Avaliar a mudança relativa na fluorescência associada ao tratamento

1. Calcular alteração na fluorescência de cada cavidade subtraindo a fluorescência no tempo 0 da fluorescência após a conclusão do estudo. Wells sem peixe (espaços em branco) deverá ter valores próximos de 0, muito abaixo dos valores dos poços que contêm peixe.
   Alteração na fluorescência = Fluorescência na conclusão - fluorescência no tempo 0
2. Para determinar a alteração relativa da fluorescência, calcular a variação média da fluorescência para os poços de controlo, em seguida, dividir a alteração na fluorescência de cada poço pela variação média da fluorescência dos poços de controlo. De nota, controles poderia ser ou comandos do veículo ou controles genéticos.
   

Resultados

Solução de ensaio não aumenta de fluorescência na ausência de peixe embrionário (Figura 1). No entanto, o ensaio é altamente sensível a pequenas alterações na taxa metabólica dentro do poço. Um peixe dentro de um único poço cria um sinal significativamente diferente de poços em branco dentro de 1 h (P <0,0001). A Figura 2 proporciona uma representação visual de sinais gerados pelo peixe embrionário após 24 h de incubação. Para a finalidade da imagem foram usadas ...

Discussão

A contaminação com bactérias ou fungos limita grandemente a aplicação deste ensaio. O azul de metileno no meio embrião E3 limita a possibilidade de contaminação por fungos. Ao longo embrião criação é fundamental que o cuidado é tomado para remover embriões mortos duas vezes por dia. Além disso, é essencial para lavar cuidadosamente os embriões com meio embrião E3 estéril no dia do início do ensaio. Estes passos 2 limitar o potencial para a contaminação bacteriana dos embriões. A inclusão de poço...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	Manufactured by Thermo Scientific
Fine Tip DisposableTransfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-26	Manufactured by Thermo Scientific
Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-771-9AM	Manufactured by Thermo Scientific
Black sided clear bottom 96-well plates	Fisher Scientific	50-320-785	Manufactured by E&K Scientific Products Inc.