Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zusammenfassung

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH₂ sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Zusammenfassung

Zebrafische sind ein wichtiger Modellorganismus mit inhärenten Vorteile, die das Potenzial Zebrafisch ein weithin angewandt Modell für die Untersuchung der Energie-Homöostase und Übergewicht zu machen. Die geringe Größe der Zebrafisch ermöglicht Tests an Embryonen in einem 96 oder 384 Well-Plattenformat durchgeführt werden, Morpholino und CRISPR basierte Technologien zu fördern einfache genetische Manipulation, und medikamentöse Behandlung von Badanwendung lebensfähig ist. Darüber hinaus sind Zebrafisch ideal für zukunfts genetischen Screens so dass für neues Gen Entdeckung. Angesichts der relativen Neuheit der Zebrafisch als Modell für Übergewicht, ist es notwendig, Werkzeuge, die diese Vorteile voll ausschöpfen zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine Methode, um den Energieverbrauch in Tausenden von embryonalen Zebrafisch gleichzeitig zu messen. Wir haben eine ganze Tiermikroplattform, in der wir Platten mit 96 Vertiefungen zu einzelnen Fische zu isolieren entwickelt und wir beurteilen kumulative NADH _2-Produktion unter Verwendung des im Handel erhältlichen Zellkulturfähigkeit reMittel alamarBlue. In poikilotherms die Beziehung zwischen NADH ₂ Produktion und Energieverbrauch ist eng verknüpft. Dieser Energieverbrauch Test schafft das Potenzial, sich rasch zu screenen pharmakologische oder genetische Manipulationen, die den Energieverbrauch direkt zu ändern oder ändern Sie die Reaktion auf eine angelegte Drogen (zB Insulin-Sensitizer).

Einleitung

Die Maus ist derzeit das vorherrschende Modell für Adipositas-Forschung. Die kurze Generationsintervall und genetischer Werkzeuge zur Verfügung, in der Maus wurden unerreicht auf dem Laufenden. Allerdings hat der Zebrafisch auch eine kurze Generationsintervall (3-4 Monate) und übertrifft sogar die Maus in eine einfache genetische Manipulation ^1,2. Der Zebrafisch unterhält fast 90% der Säugetiergenen, während Sie die Maus weit über der Zahl der Nachkommen und das Potenzial für den Einsatz in genetischen und Drogen-Bildschirme ^3.

Um das Potenzial des Zebrafisch-Modell für Studien der Fettleibigkeit zu erschließen, müssen Tests entwickelt werden, um Faktoren, die Gewichtsregulation, einschließlich Energieverbrauch beeinflussen zu untersuchen. Als Metaboliten werden durch β-Oxidation und Tricarbonsäurezyklus Sauerstoff verarbeitet verbraucht und NADH ₂ wird erzeugt. Somit NADH _{2 ist ein} direkter Indikator des Flusses von Metaboliten durch Stoffwechselwege (Metabolit Oxidation). In poikilotherms, H ⁺ Leck durch die innere Mitochondrienmembran, die NADH _{2 -Oxidation} entkoppelt von der ATP-Synthese ist 4-5-fach geringer als bei Warmblütern ^4. Dementsprechend wird in Zebrafisch NADH ₂ sehr fest an die ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung verknüpft. Hier beschreiben wir einen Test, der NADH ₂ Produktion misst in Larven Zebrafisch als Proxy für den Energieverbrauch ^5.

Der Sauerstoffverbrauch ist der Goldstandard zur Messung der Energieaufwand. Doch am besten nutzen Sie die Hochdurchsatz-Potenzial des Zebrafisch-Assays des Energieverbrauchs muss zugänglich für Hochdurchsatz sein. Sauerstoffverbrauch Systeme, die auf einer geschlossenen Kammer Umlaufsystem abhängt, werden im Durchsatz durch die Anzahl von Kammern ^vorhanden 6 begrenzt. _Open-Air-O 2 Verbrauch / _CO 2 -Produktion Assays wurden ebenfalls in der Zebrafisch ^5,7 angewandt. Diese Open-Air-Platte mit 96 Vertiefungen BasisD Systems zugänglich sind hohem Durchsatz. Leider Gasaustausch mit der Umgebung begrenzt Empfindlichkeit dieser Assays. Wir haben vor kurzem veröffentlicht die Anwendung eines Assays, die NADH _{2 Monitore} mit dem Redoxindikator alamarBlue ^5. Dieser Test überwindet die Beschränkungen in Durchsatz und Empfindlichkeit gemeinsam Analysen der Sauerstoffverbrauch in der Zebrafisch.

Der Zebrafisch ist ein zunehmend wichtiges Modell für die Untersuchung der ganze Körper Energie-Homöostase. Zum Teil, weil Zebrafisch zugänglich sind in den zukunfts genetischen Screens und Drogen-Bildschirme verwenden. Darüber hinaus gezielte genetische Manipulation, einschließlich Zuschlags und Knock-in, kann schnell angewendet werden. Wir haben bereits gezeigt, dass dieser Test kann mit Badewanne Medikamentenapplikation und der genetischen Zuschlags oder KO kombiniert werden, um Verbindungen und Gene, die Stoffwechselrate zu ändern ⁵ zu identifizieren. Außerdem ist dieser Test für die hohen Durchsatzvorteile inhärent Zebrabärbling auszunutzen.

Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Universität von Arizona Amt für verantwortliches Handeln in der Forschung und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss gebilligt wurde

1. Zebrafisch-Embryo Zucht und Wartung

1. Bereiten E3 Embryo ^Medium 8. Um 60x Stammlösung machen, lösen sich 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl _{² ● 2} H 2 O und 9,78 g MgCl _{² ● 6} H 2 O in 1,95 L ddiH ₂ O. Der pH-Wert auf 7,2 unter Verwendung von NaOH und HCl Lautstärke bis 2 L mit ddiH ₂ O.
2. Um 1x E3 Embryo Medium herzustellen, verdünnte 16,5 ml 60x Lager in 1 L ddiH20. Fügen Sie 100 ul 1% Methylenblau.
3. Zucht
   1. Haus Männliche und weibliche Zuchtbestands (7-18 Monate alt) separat an Fruchtbarkeit zu maximieren.
   2. Mach das Licht aus 1-2 Stunden vor der am Tag vor der Eier erwünscht sind. Richten Sie Paarung (1 männlich und 1-2 Weibchen) in cRossing Käfige ^9, wie zuvor beschrieben. Crossing Käfigen ermöglichen die Eier Raub zu entkommen, als sie durch den perforierten Boden des Tanks Einsatz, in dem die ausgewachsene Fische gehalten werden, übergeben.
   3. Optional:. Für zeitgesteuerte Zucht, (wie es für Studien mit Morpholino Injektion erforderlich), trennen Sie den männlichen und weiblichen Fische von einem durchsichtigen Kunststoff-Teiler, entfernen diese am Morgen, um in zeitlicher Verlegung der Eier und die Befruchtung führen. Für Morpholino Studien durchführen Leistungsberechnungen, die Zahl der embryonalen Fisch pro Behandlung erforderlich zu bewerten. Ohne eine Schätzung der Größe des Effekts oder Abwandlung kann eine vorläufige Prüfung bei der n = 8 ausgeführt.
4. Gießen Sie die Eier aus der Kreuzung Käfig in eine Petrischale (100 bis 150 Embryonen / 10 cm Petrischale). Lassen Sie die Eier auf den Boden der Schale niederzulassen und abgießen. Entfernen Sie das restliche Wasser mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette. Zurück E3 Embryo Medium in Schritt 1.1 gemacht hinzufügen.
5. Machen aflame poliert Einwegpipette für zukünftige Ei und Fisch Übertragung. Mit einer Schere, schneiden Sie ein absolvierte Einmaltransferpipette an der 0,25 ml Graduierung. Um Ecken und Kanten, Flammpolitur der Schnitt Spitze über einem Bunsenbrenner zu entfernen.
6. Pflegen embryonale Fisch bis 4 Tage nach der Befruchtung (DPF) in 10 cm Petrischalen im Zebrafisch E3 Embryo Medium bei 28,5 ^○ C Zweimal täglich, verwenden Sie eine Flamme poliert absolvierte Einmaltransferpipette, um alle unbefruchteten Eiern oder toten Embryonen (opak weißes Aussehen) zu entfernen. Einmal täglich, tauschen E3 Embryo Medium. Abgießen E3 Embryo Medium, entfernen Sie verbleibende Flüssigkeit mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette, und fügen Sie wieder vorgewärmten (28,5 ^○ C) E3 Embryo Medium.

2. Bereiten Sie Testlösung

1. Vorbereitung der Testlösung gemäß Tabelle 1. Sterile Filter Assay Lösung unter Verwendung eines 0,22 um-Filter. Vor Beginn testen, warm die sterile Testlösung in einer 28,5 ^○ CWasserbad.

Bestandteil	% Der Gesamt	Volumen (ul / 10 ml)
60x E3 Embryo Medium	1,667	166,7
Doppel deionisiertem (DDI) H 2 0	96,233	9.623,3
Alamar-Blau-	1	100
400 mM NaOH	1	100
DMSO	0.1	10

Tabelle 1 Assay-Medium

3. Führen Assay

1. Spülen Zebrafischembryonen 3 mal mit steril filtriert E3 Embryo Medium. Kombinieren Sie alle lebensfähigen Zebrafischembryonen von der Kupplung in ein Becherglas. Sterilfilter 75 ml E3 Embryo Medium. Mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette, rebewegen, wie viel von der E3 Embryo Medium aus den Zebrafischembryonen wie möglich. 20 ml steril filtriert E3 Embryo Medium Rücken. Entfernen und 3 mal ersetzen E3 Embryo Medium.
2. Fischplatte 1 in jede der 93 Vertiefungen einer 96-Loch schwarz Seitige durchsichtigen Bodenplatte. Übertragen Sie die embryonale Fisch auf den Teller durch individuelles Einfangen eines Embryos in eine Flamme poliert absolvierte Kunststoff-Einweg-Transferpipette (Schritt 1.5) und sanft Auswerfen in den Brunnen. Bringen E3 Embryo Medium aus dem Becherglas gespült Fisch in den 3 leeren Brunnen entnommen. Dies stellt sicher, dass leere Brunnen wurden auf die gleiche Wasser wie die Brunnen, die Fisch enthalten ausgesetzt. Beide Brunnen, die Fisch und leere Brunnen enthalten sollte mindestens ½ volle (200 ul) auf den Abschluss dieser Schritt sein.
3. Ersetzen E3 Embryo Medium mit Assay-Lösung in allen 96 Wells, einschließlich leere Brunnen. Dieser Schritt sollte 1 Spalte zu einer Zeit für jede der 12 Spalten in einer 96-Well-Platte durchgeführt werden. Mit einer feinen Spitze Einweg-transfer Pipette entfernen E3 Embryo Medium aus jeder auch in einer Spalte der Platte (8 Kavitäten). Achten Sie auf die Zebrafischembryo nicht berühren. Werden 300 & mgr; l Assay-Lösung zu jeder Vertiefung, aus dem Wasser entfernt wurde. Wiederholen die Entfernung von E3 Embryo Mediums und Ersatz mit Assaylösung für alle 12 Spalten der Platte.
4. Optional: Um die metabolische Rate Änderung in Reaktion auf eine Testverbindung, stellen eine Lösung, die 100-mal (100X) die gewünschte Behandlungskonzentration ist. Zu beachten ist, sicherzustellen, dass die Lösung 100x 10% DMSO nicht überschreiten, um die endgültige DMSO-Konzentration auf nicht mehr als 0,1% zu begrenzen. Werden 3 ul des 100-fach-Lösung in jede der Behandlungs Vertiefungen.
   HINWEIS: Führen Sie Leistungsberechnungen, die Zahl der Behandlungs Brunnen zu bewerten. Jedoch ohne eine Schätzung der Grße der Reaktion oder einer Variation, einem Vorversuch kann in 8 Verbindung behandelten und 8 mit Vehikel behandelten Kontrollvertiefungen, die Fische enthalten ausgeführt werden.
   1. In 3 ul Fahrzeugkontrolle, die Kontrolle (keine drug Behandlung) Brunnen, die Fisch enthalten. Um sicherzustellen, dass das fluoreszierende Reaktion auf Verbindung ist ein Ergebnis der Maßnahmen, die im Fisch, gelten Drogen-und Fahrzeuganwendungen bis 3 leere Wells in einer Platte mit 96 Vertiefungen.
5. Lesen Fischen gefüllt Platte auf Fluoreszenzplattenlesegerät mit Anregungswellenlänge bei 530 nm und die Emissionswellenlänge bei 590 nm.
6. Platz Platte in befeuchteten Inkubator auf 28,5 ^○ C (halten Platte in der Dunkelheit über sie Assay zur Photobleichen der Testlösung zu vermeiden) eingestellt. Der Test kann für die Dauer der Zeit, die von 1 Stunde bis 24 Stunden reichen ausgeführt werden. Die Dauer des Tests hängt von der Zielsetzung der Studie. Zum Testen der Reaktion auf eine kurzwirksamen nicht stabile Verbindung eine kurze Dauer kann am besten geeignet. Doch die Maximierung Assay Dauer für eine stabile Verbindung, Tests oder Prüfungen der genetische Effekte, vorzuziehen, die Vorteile mit der Summensignal zugeordnet zu nutzen.
7. Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt (siehe Schritt 3.6, um festzustellen Timing)Lesen Fluoreszenz des fischreichen Platte wieder mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 3.5.

4. Bewerten Sie die relative Veränderung der Fluoreszenz Verbunden mit Treatment

1. Änderung in der Fluoreszenz von jeder Berechnung auch durch Subtrahieren der Fluoreszenz zum Zeitpunkt 0 von der Fluoreszenz am Ende der Studie. Wells ohne Fisch (Rohlinge) sollten Werte nahe 0 haben, weit unter Werte von Brunnen, die Fisch enthalten.
   Veränderung der Fluoreszenz = Fluorescence am Schluss - Fluoreszenz zum Zeitpunkt 0
2. Um die relative Veränderung der Fluoreszenz zu ermitteln, berechnen die durchschnittliche Veränderung der Fluoreszenz für die Kontrollvertiefungen dann teilen die Veränderung der Fluoreszenz jedes vom durchschnittlichen Veränderung der Fluoreszenz der Kontrollvertiefungen. Zu beachten ist, könnte Kontrollen entweder Fahrzeugsteuerungen oder genetische Kontrolle zu sein.
   

Ergebnisse

Assay-Lösung nicht-Fluoreszenz in Abwesenheit von embryonalen Fisch (1) zu erhöhen. Jedoch ist der Test sehr empfindlich auf kleine Änderungen der Stoffwechselrate im Bohrloch. Eine einzelne Fische innerhalb einer gut schafft ein Signal deutlich von leeren Brunnen innerhalb 1 Stunde (P <0,0001). Abbildung 2 bietet eine visuelle Darstellung der Signale, die von embryonalen Fische nach 24 Stunden Inkubation erzeugt. Für die Zwecke dieses Bildes klar seitige Vertiefungen wurden verw...

Diskussion

Kontamination mit Bakterien oder Pilzen stark begrenzen Anwendung dieses Assays. Methylenblau in der E3-Embryomedium begrenzt die Möglichkeit einer Kontamination mit Pilzen. Im gesamten Embryo Aufzucht es wichtig, dass darauf geachtet wird, tote Embryonen zu entfernen zweimal täglich ist. Zusätzlich ist es wichtig, die Embryos mit sterilem E3 Embryo Medium gründlich am Tag Assayinitierungsbereich. Diese 2 Schritte begrenzen das Potenzial für bakterielle Kontamination der Embryonen. Die Einbeziehung der in Schritt 3...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	Manufactured by Thermo Scientific
Fine Tip DisposableTransfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-26	Manufactured by Thermo Scientific
Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-771-9AM	Manufactured by Thermo Scientific
Black sided clear bottom 96-well plates	Fisher Scientific	50-320-785	Manufactured by E&K Scientific Products Inc.