높은 처리량<em&gt; 다니오 레 리오 (rerio)</em&gt; 에너지 지출 분석

요약

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH₂ sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

초록

제브라 피쉬는 에너지 항상성 및 비만의 연구에 널리 적용 모델 만들 수있는 잠재력을 가지고 고유 이점 중요한 모델 생물이다. 배아에 대한 분석은 96 또는 384 웰 플레이트 형식으로 실시하는 제브라 피쉬의 작은 크기가 있습니다, 모르 폴리 노 및 CRISPR 기반 기술이 목욕 응용 프로그램에 의해 유전자 조작의 용이성 및 약물 치료를 촉진이 가능한 것입니다. 또한, 제브라 피쉬는 새로운 유전자 발견을 가능하게 앞으로 유전 화면에 이상적입니다. 비만 모델 지브라 피쉬의 상대적인 신규성을 고려할 때 이러한 장점을 충분히 활용 도구 개발하는 것이 필요하다. 여기서, 우리는 동시에 배아 지브라 피쉬 수천에서 에너지 소비를 측정하는 방법을 설명한다. 우리는 개별 물고기를 분리 96- 웰 플레이트를 사용하는 전체 동물 마이크로 플랫폼을 개발하고 우리는 시판되는 세포 배양 생존력 재를 사용하여 누적 NADH ₂ 생산을 평가에이전트 알라 마르 블루. poikilotherms _2에서 NADH의 생산 및 에너지 소비 간의 관계 단단히 연결되어있다. 이 에너지 소모 분석 급속 직접 에너지 소비를 변경 또는 응용 약물 (예, 인슐린 감작 제)에 대한 응답을 변경 또는 약리 유전 조작 화면까지의 전위를 생성한다.

서문

마우스는 현재 비만 연구를위한 지배적 인 모델이다. 짧은 세대 간격과 마우스에서 사용할 수있는 유전 적 도구는 현재까지 타의 추종을 불허하고있다. 그러나, 제브라 피쉬는 짧은 세대 간격이 (3-4개월를) 및 유전자 조작 ^{1, 2의} 용이성에서도 마우스를 능가한다. 먼 유전자 의약품 스크린 ^(3)에 사용하고 잠재적 자손의 수에 마우스를 초과하면서 지브라 피쉬는 포유 동물 유전자의 약 90 %를 유지한다.

비만 연구를위한 모델 지브라 피쉬의 전위 수돗물, 분석은 에너지 소비를 포함하여 체중 조절을, 영향 요인을 조사하기 위해 개발되어야한다. 대사 물질이 β 산화 및 트리 카르 복실 산 사이클의 산소를 통해 처리 될 때 소모되므로 NADH _2가 생성된다. 따라서, NADH _2는 대사 경로 (대사 산화)를 통해 대사 플럭스의 직접적인 지표이다. poikil에서homeotherms ^4에 비해 5 배 낮은 - otherms, H는 ^+, ATP 합성에서 NADH ₂ 산화를 분리됩니다 4 미토콘드리아 내막을 통해 누출. 따라서, 제브라 피쉬 NADH _2는 매우 밀접하게 산화 적 인산화를 통해 ATP 생산에 연결되어 있습니다. 여기서, 우리는 에너지 소비 ⁵ 프록시로 애벌레 제브라 피쉬에서 NADH ₂ 생산을 측정하는 분석에 대해 설명합니다.

산소 소비는 에너지 소비를 측정하기위한 금 표준이다. 그러나, 가장 제브라 피쉬의 높은 처리량 잠재력을 활용하기 위해, 에너지 소비의 분석은 높은 처리량 의무가 있어야합니다. 순환 시스템 밀폐 챔버에 의존 산소 소비 시스템은 ⁶ 가능한 챔버들의 수로 처리량 제한된다. 야외 O ₍₂₎ 소비는 / CO ₂ 생산 분석은 제브라 피쉬 ^5,7에 적용되었습니다. 이러한 야외 96 웰 플레이트베이스D 시스템은 높은 처리량 의무가 있습니다. 불행하게도, 환경과 가스 교환이 분석의 감도를 제한한다. 최근 우리는 레 독스 표시기 ⁵ 알라 마르 ^블루를 사용한 NADH _2를 모니터링 분석의 어플리케이션을 출판. 이 분석은 처리량 및 지브라 피쉬의 산소 소비량의 분석에 공통 감도 한계를 극복한다.

제브라 피쉬는 몸 전체의 에너지 항상성의 연구에 점점 더 중요한 모델이되고있다. 부분적으로, 제브라 피쉬 때문에 앞으로 유전 화면과 약물 화면에서 사용하는 의무가 있습니다. 또한, 최저 및 녹아웃에 신속하게 적용 할 수 있습니다 포함하여, 유전자 조작을 대상으로. 우리는 이전에이 분석은 화합물의 대사 ^속도를 변경할 ⁵ 유전자를 동정하기 위해 약물 목욕 애플리케이션 유전자 녹다운 또는 녹아웃과 조합 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 또한,이 분석은 제브라 피쉬에 내재 된 높은 처리량의 이점을 활용할 수 있도록 설계되었습니다.

프로토콜

참고 :이 프로토콜은 연구의 책임있는 행동에 대한 애리조나 오피스 대학의 지침을 다음과 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된

1. Zebrafish의 사육 및 배아 유지 보수

1. E3 배아 매체 ^(8)를 준비합니다. 60 배 원액을 확인하기 위해, 1.95 L ddiH ₂ O에서 34.8 g의 염화나트륨, 1.6 G의 KCl, 5.8의 염화칼슘 ₂ ^● 2H ₂ O, 및 9.78 g의 MgCl ₂ ^● 6H ₂ O를 용해 ddiH ₂ O를 사용하여 2 L에 볼륨을 조정 수산화 나트륨과 염산을 사용하여 pH를 7.2로 조정
2. 1 L ddiH20 16.5 ml의 60 배 주식을 희석 1X E3 배아 매체를 준비합니다. 100 μL 1 % 메틸렌 블루를 추가합니다.
3. 번식
   1. 하우스 남성과 여성의 무리 스톡 (7 - 만 18 개월) 별도로 생산력을 극대화한다.
   2. 계란이 요구하기 전에 날에 전에 2 시간 - 1 떨어져 불을 켭니다. C에서 - 설정 짝짓기 (2 여성 1 남성과 1)rossing 케이지는 이전에 ^9를 설명했다. 그들이 어른 물고기가 개최되는 탱크 삽입의 천공 기본을 통과 계란 포식을 탈출하는 교차 케이지 할 수 있습니다.
   3. 옵션 :. 시간 제한 번식을 위해, (모르 폴리 노 주입과 관련된 연구에 필요한 것 등), 투명한 플라스틱 디바이더로 남성과 여성의 물고기를 분리, 계란과 수정의 시간 제한 누워 결과 아침에이를 제거합니다. 연구를 들어 모르 폴리 노, 처리 당 요구 어류 배아의 수를 평가하기 위해 전력 계산을 수행한다. 효과 나 변화의 크기를 추정하지 않고, 예비 시험은 n = 8로 실행할 수있다.
4. (- 150 배아 / 10cm 페트리 접시 100) 페트리 접시에 교차 케이지에서 계란을 붓고. 계란 요리의 바닥에 정착 물을 부어하도록 허용합니다. 좋은 팁 일회용 전송 피펫을 사용하여 남아있는 물을 제거합니다. 단계 1.1에서 만든 E3 배아 매체를 다시 추가합니다.
5. AF 확인미래 계란과 생선 전송을위한 절름발이 광택 일회용 피펫. 가위를 사용하여 0.25 ㎖의 졸업식에서 졸업 일회용 전송 피펫을 잘라. 거친 가장자리, 불꽃 폴란드어 분젠 버너를 통해 절단 팁을 제거하십시오.
6. 제브라 피쉬 E3 배아 매체에서 배양 접시 28.5 ^○ ℃에서 후 수정 10cm에서 (DPF) 사일에 배아 물고기를 유지 두 번 매일, 불꽃이 어떤 미 수정 계란 또는 죽은 배아 (불투명 한 흰색 외관)을 제거하기 위해 일회용 전송 피펫을 졸업 닦는 사용합니다. 각각 하루에 한 번, E3 배아 매체를 교체합니다. 좋은 팁 일회용 전송 피펫을 사용하여 남아있는 액체를 제거, E3 배아 매체를 붓고, 사전 예열 (28.5 ^○ C) E3 배아 매체를 다시 추가합니다.

2. 분석 솔루션을 준비합니다

1. 0.22 μM 필터를 이용하여 표 1. 멸균 필터 분석 용액에 의한 분석 용액을 제조 하였다. 28.5 ^○ C에서 멸균 분석 솔루션을 개시 분석 따뜻한 이전물 목욕.

성분	전체의 %	볼륨 (μL / 10 mL) 중
60 배 E3 배아 중간	1.667	166.7
두 번 탈 (DDI) H 2 0	96.233	9623.3
하는, Alamar 블루	1	(100)
400 밀리미터의 NaOH	1	(100)
DMSO	0.1	(10)

표 1. 분석 중간

3. 분석을 수행

1. 제브라 피쉬 배아를 멸균 여과 E3 배아 매체로 3 회 씻어. 비커에 클러치에서 모든 가능한 제브라 피쉬 배아를 결합합니다. 멸균 필터 75 ml의 E3 배아 매체. , 좋은 팁 일회용 전송 피펫을 다시 사용가능한 한 제브라 피쉬 배아에서 E3 배아 매체의 많은 이동합니다. 20 ㎖를 멸균 여과 E3 배아 매체를 다시 추가합니다. 제거하고 E3 배아 매체 3 회를 교체합니다.
2. 96 웰 블랙 93 우물의 각으로 플레이트 (1) 물고기는 분명 바닥 판을 양면. 불꽃이 플라스틱 일회용 전송 피펫을 졸업 닦는 내에서 개별적으로 (1.5 단계) 배아를 캡처하고 부드럽게 우물에 배출하여 판에 배아 물고기를 전송합니다. 3 빈 우물에 씻어서 물고기가 들어있는 비커에서 가져온 E3 배아 매체를 전송합니다. 이 빈 우물이 물고기가 들어있는 우물로 동일한 물에 노출되어 있는지 확인합니다. 물고기와 빈 우물을 포함 모두 우물이 단계의 결론에 (200 μL) 적어도 ½ 가득합니다.
3. 빈 우물을 포함하여 모든 96 우물에서 분석 솔루션 E3 배아 매체를 교체합니다. 이 단계는 96 웰 플레이트에서 12 열마다 한 번에 한 열을 수행한다. 좋은 팁을 사용하여 일회용 트랜스FER 피펫은, 플레이트 (8 우물)의 하나의 컬럼에있는 모든 우물에서 E3 배아 매체를 제거합니다. 제브라 피쉬 배아를 터치하지 않도록주의하십시오. 물이 제거 잘되는 각 분석 솔루션의 300 μl를 추가합니다. 판의 모든 12 열에 대한 분석 솔루션 E3 배아 매체 및 교체의 제거를 반복합니다.
4. 옵션 : 화합물에 대한 응답으로 신진 대사 속도의 변화를 테스트하려면, 100 배 (100 배) 원하는 치료 농도 인 솔루션을합니다. 참고로, 100 × 용액을 0.1 % 이하로 더욱 최종 DMSO 농도를 제한하기 위해 10 %의 DMSO를 초과하지 않는 것을 보장한다. 처리 웰 각각 100X 용액 3 μL를 추가한다.
   주 : 치료 우물의 수를 평가하기 위해 전력 계산을 수행합니다. 그러나, 응답 또는 변화의 크기를 추정하지 않고, 예비 시험은 치료 8 화합물 및 물고기를 포함 8 차량 처리 제어 우물에서 실행할 수 있습니다.
   1. (제어 할 DRU를 차량 제어의 3 μl를 추가하지G 처리) 물고기를 포함 우물. 화합물에 형광 응답이 물고기 내 행동의 결과인지 확인하기 위해, 96 웰 플레이트에 3 빈 우물에 약물 및 차량 치료를 적용 할 수 있습니다.
5. 590 nm에서 530 nm의 여기 파장과 방출 파장 형광 플레이트 리더에 물고기 충전 판을 읽어보십시오.
6. 가습 인큐베이터에 배치 할 판은 28.5 ^○ C (분석 솔루션의 광표백을 방지하기 위해 분석을 통해 어둠 속에서 판을 유지)으로 설정. 분석은 1 시간에서 24 시간까지 다양 시간의 기간에 대해 실행할 수 있습니다. 시험 기간은 연구의 목적에 따라 달라진다. 짧은 기간이 가장 적합 할 수있는 속효성 비 안정적인 화합물에 대한 응답을 테스트하기 위해. 그러나, 안정한 화합물 시험 또는 유전 효과 시험을위한 시험 시간을 최대화 누적 신호와 관련된 장점을 활용하는 것이 바람직하다.
7. 미리 정해진 시점에서 (타이밍을 결정하는 데 도움이 3.6 단계 참조)단계 3.5과 동일한 설정으로 다시 물고기 가득한 판의 형광을 읽어 보시기 바랍니다.

4. 치료와 형광 연합의 상대적인 변화를 평가

1. 잘 연구의 결론에 형광에서 시간 0 형광을 빼서 각각의 형광의 변화를 계산합니다. 물고기 (공백)없이 웰스는 물고기를 포함 우물에서 멀리 값 이하로, 0 근처의 값을 가져야한다.
   결론에 형광 = 형광의 변화 - 형광을 시간 0
2. 대조군 웰은 다음 대조군 웰의 형광의 평균 변화에 의해 각 웰의 형광 변화를 나눔 형광의 상대적인 변화를 확인하기 위하여, 형광의 평균 변화를 계산한다. 참고로, 컨트롤은 차량 컨트롤이나 유전자 제어 될 수있다.
   

결과

분석 액 어류 배아 (도 1)의 부재 하에서 형광을 증가시키지 않는다. 그러나, 분석은 잘 내 신진 대사 속도의 작은 변화에 매우 민감하다. 잘 내에서 하나의 물고기는 1 시간 (P <0.0001) 내 빈 우물에서 유의 한 차이 신호를 생성한다. (2) 배양 24 시간 후 배아 물고기에 의해 생성 된 신호의 시각적 표현을 제공한다 그림. 이 사진의 목적을 위해 투명한 양면 웰을 ...

토론

세균이나 곰팡이에 오염은 크게이 분석의 응용 프로그램을 제한합니다. E3 배아 매체 메틸렌 블루는 진균의 오염의 가능성을 제한한다. 배아 동안은 치료를 두 번 매일 죽은 태아를 제거하기 위해 수행하는 것이 중요 양육. 또한, 철저히 분석 개시 당일 멸균 E3 배아 매체 배아 린스하는 것이 필수적이다. 이러한 2 단계의 배아 박테리아 오염에 대한 잠재 성을 제한한다. 단계 3.2에서 설명한 빈 우물...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	Manufactured by Thermo Scientific
Fine Tip DisposableTransfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-26	Manufactured by Thermo Scientific
Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-771-9AM	Manufactured by Thermo Scientific
Black sided clear bottom 96-well plates	Fisher Scientific	50-320-785	Manufactured by E&K Scientific Products Inc.