التوليف من ألياف نانوية أساس كيراتين للهندسة الطبية الحيوية

Summary

ألياف النانو Electrospun لديها مساحة عالية لنسبة الوزن، السلامة الميكانيكية ممتازة، ودعم نمو الخلايا وانتشارها. هذه ألياف النانو لديها مجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية. نحن هنا افتعال الكيراتين / ألياف النانو PCL، وذلك باستخدام تقنية العزل الكهربائي، وتوصيف الألياف للتطبيقات الممكنة في هندسة الأنسجة.

Abstract

العزل الكهربائي، وذلك بسبب تنوعها وقدرتها على التطبيقات في مختلف المجالات، ويجري كثيرا ما تستخدم لتصنيع ألياف النانو. إنتاج هذه ألياف النانو التي يسهل اختراقها هي ذات أهمية كبيرة نظرا لخصائصها الفيزيائية الفريدة. نحن هنا وضع على تصنيع الكيراتين التي تحتوي على بولي (ε-caprolactone) (PCL) ألياف النانو (أي PCL / قرنين الألياف مركب). تم استخراج الكيراتين للذوبان في الماء لأول مرة من شعرة الإنسان ومختلطة مع PCL في نسب مختلفة. تحولت حل المخلوطة من PCL / الكيراتين في الأغشية nanofibrous باستخدام العزل الكهربائي مختبر تصميم اقامة. لوحظ مورفولوجيا الألياف والخواص الميكانيكية للألياف نانوية التي تم الحصول عليها وتقاس باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح واختبار الشد. وعلاوة على ذلك، تمت دراسة التحلل والكيميائية خصائص ألياف نانوية من قبل FTIR. وأظهرت لقطات SEM مورفولوجيا سطح موحدة للألياف PCL / الكيراتين من تركيبات مختلفة. هذه PCL / keratiأظهر الألياف ن أيضا خصائص ميكانيكية ممتازة مثل معامل والفشل نقطة يونغ. استطاعت أن نعلق وتتكاثر مما يثبت بقاء الخلية جيدة الخلايا الليفية. على أساس الخصائص المذكورة أعلاه، يمكننا القول بقوة أن ألياف النانو المخلوطة البوليمرات الطبيعية والاصطناعية يمكن أن تمثل تطورا ممتازة من المواد المركبة التي يمكن استخدامها لالتطبيقات الطبية الحيوية المختلفة.

Introduction

يتم الاعتراف العزل الكهربائي كوسيلة السائد في تحقيق ألياف النانو بوليمر. يمكن أن تنتج الألياف على مقياس النانو وخصائص الألياف قابلة للتخصيص ^1. وكانت هذه التطورات وخصائص ألياف النانو electrospun مثيرة للاهتمام خاصة بالنسبة للتطبيقات في الهندسة الطبية الحيوية وخاصة في هندسة الأنسجة. ألياف النانو electrospun تمتلك التشابه إلى المصفوفة خارج الخلية، وبالتالي تعزيز التصاق الخلية والهجرة وانتشار ^2. ونتيجة لهذا التشابه إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) والألياف electrospun يمكن استخدامها كمواد للمساعدة في تضميد الجروح، وتسليم المخدرات، والأنسجة الهندسية مثل الكبد والعظام والقلب والعضلات ^3.

وقد استخدمت مجموعة متنوعة من البوليمرات المختلفة المنشأ الاصطناعية والطبيعية لخلق الألياف electrospun لمختلف تطبيقات الهندسة الطبية ^(4). في الآونة الأخيرة كان هناك تزايد فيterest في تطوير ألياف النانو المركب عن طريق مزج الاصطناعية وبوليميرات طبيعية ^(4). في هذه التراكيب المنتجات النهائية يرث عادة القوة الميكانيكية المرتبطة البوليمر الاصطناعية بينما تبني أيضا الاشارات البيولوجية والخصائص من البوليمر الطبيعي.

في هذه التجربة، وتعرض PCL والكيراتين مثل البوليمرات الاصطناعية والطبيعية لاستخدامها في تركيب وألياف نانوية مركب. الكيراتين هو بوليمر الطبيعية التي وجدت في الشعر والصوف والأظافر. أنه يحتوي على العديد من بقايا الأحماض الأمينية. من مصلحة بارزة هي السيستين ^4،5. من الناحية المثالية البوليمر التي تحدث بشكل طبيعي سيكون biorenewable، حيويا وقابلة للتحلل. الكيراتين تمتلك كل ثلاثة من هذه الخصائص في الوقت الذي تعزز أيضا تكاثر الخلايا والتعلق الحيوية قد أدرج في ^6.

Polycaprolactone (PCL) هو البوليمر الاصطناعية resorbable التي هي كبيرة فيهندسة الأنسجة ^4. وقد سبق أن أشاد هذا البوليمر لتحقيق الاستقرار الهيكلي والميكانيكي لها، ومع ذلك، فإنه يفتقر إلى تقارب الخلية ويسلك معدل تدهور طويلة. طبيعة مسعور من PCL هي على الأرجح المسؤولة عن عدم وجود خلية تقارب ^7. ومع ذلك، PCL يعوض عن حدودها من خلال كونها غير قابلة للامتزاج للغاية مع البوليمرات الأخرى. وPCL / مركب قرنين وينبغي أن يبين الخصائص الميكانيكية للPCL وتتضمن الخصائص البيولوجية من الكيراتين، مما يجعلها خيارا مثاليا لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية.

Protocol

يتبع كل بروتوكول للمبادئ التوجيهية للمكتب جامعة ولاية نورث كارولينا A & T الامتثال البحوث والأخلاق.

1. إعداد الكيميائية للكيراتين استخراج ⁴

1. لإعداد 1000 مل من 2٪ بالوزن / المجلد محلول حمض البيروكسي (PAS)، تحت غطاء الدخان إضافة 20 مل من حمض البيروكسي إلى 980 مل من منزوع الأيونات الماء (DI).
2. لإعداد 1000 مل من 100 ملي تريس حل قاعدة (TBS)، إضافة 12.2 غرام من قاعدة تريس إلى 1000 مل من الماء DI ويقلب حتى يذوب تماما.
3. تحضير محلول مخفف حمض الهيدروكلوريك (DHAS) في غطاء الدخان بصب 4 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى 30 مل من الماء DI.
4. شراء حوالي 20 غراما من قصاصات شعر الإنسان التي لم يتم معالجتها كيميائيا أو تغييرها. الشعر يمكن أن يكون أي طول.
5. يغسل الشعر جيدا، من جهة، مع الماء الدافئ والصابون. استخدام منزوع الأيونات الماء (DI) للشطف النهائي.
6. وضع الشعر الى قسمين 600 مل الأكواب ومكان في س 80 درجة مئويةفين لمدة 1 ساعة.
7. استنزاف السائل من أسفل الكأس ووضعها مرة أخرى في الفرن حتى شعر جاف تماما.
8. الفجوة تجفف الشعر بالتساوي بين 600 مل فنجان، وضع 10 غرام من الشعر في كل كوب. لا تسمح للشعر لملء أكثر من 500 مل.
9. صب 500 مل من نظام تقييم الأداء في كل كوب مع التأكد من تغطية جميع من الشعر. تغطية الأكواب مع بارافيلم وتخزينها لمدة 12 ساعة.

2. إعداد كيراتين استخراج الحل

1. فصل الشعر من نظام تقييم الأداء باستخدام منخل 500 ميكرون. جمع PAS النفايات في وعاء منفصل. شطف الشعر جيدا بالماء DI لإزالة أي بقايا نظام تقييم الأداء.
2. وضع الشعر تشطف في قارورة 500 مل. صب 400 مل من TBS في قارورة، والتأكد من أن يتم تغطية الشعر. مكان دورق في حمام تهز مجموعة إلى 38 درجة مئوية، و 65 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
3. بعد 1 ساعة، وإزالة من اهتزاز حمام وصب السائل، ما يقرب من 400 مل من محلول استخراج الكيراتين (KES)، طn لدورق 1000 مل.
4. صب 400 مل من الماء DI في قارورة تحتوي على شعر ضمان أن يتم تغطية الشعر والمكان مرة أخرى في الحمام تهز لمدة 1 ساعة. إزالة قارورة من الحمام تهتز وصب 400 مل المتبقية من KES في دورق 1000 مل مع KES التي تم جمعها سابقا. لم يعد هناك حاجة للشعر، ويمكن أن تكون ملقاة خارج القارورة والتخلص في أقرب وعاء القمامة.

3. تركيز الكيراتين استخراج الحل

1. ملء حمام rotodistiller إلى السطر العلوي مع الماء المقطر وتعيين إلى 90 درجة مئوية. ضبط سرعة دوران إلى 200 دورة في الدقيقة. تشغيل المبرد المبرد مضخة وتعيين إلى -10 درجة مئوية.
2. باستخدام مقياس درجة الحموضة لمراقبة درجة الحموضة في KES، واستخدام ماصة لإضافة ببطء 1 ملم DHAS إلى KES حتى تصل درجة الحموضة 7.0. يحرك ببطء كما يتم إضافة الحل.
3. صب KES تحييدها في 500 مل قارورة جولة القاع حتى حوالي ربع كامل. تشغيل التقطير وفقا لالصانعبروتوكول مقابل 1.25 ساعة.
   1. وقد تم استخلاص كرر الخطوة 3.3 حتى كل من KES. تأكد من أن قارورة متصل بإحكام.

4. غسيل الكلى من القرتين استخراج الحل

1. صب حل KES بالتساوي إلى 12 أنابيب مخروطية 14 مل منفصلة. أنابيب الطرد المركزي في 1050 x ج لمدة 10 دقيقة.
2. صب KES طرد في دورق نظيفة، والتأكد من أن تصب بعيدا عن الحطام التي تم جمعها. كرر حتى تم طرد كل من KES.
3. ملء 2000 مل تخرج اسطوانة بالماء DI.
4. خفض غسيل الكلى غشاء أنابيب السليلوز إلى 24 بوصة، وكليب واحدة من نهاية الأنابيب لأنه عقد مغلقة.
5. تراجع طول الأنبوب في الاسطوانة من الماء DI لجعلها أكثر مرونة وأسهل لفتح.
6. فتح نهاية غير قص الغشاء السليلوز غسيل الكلى أنابيب وتصب ببطء 60 مل من محلول KES طرد في أنابيب. استخدام مقطع آخر لإغلاق هذا نهاية الأنبوب.
7. وضع ديأنبوب alysis في الاسطوانة 2000 مل من الماء DI والسماح للجلوس لمدة 24 ساعة. تغيير الماء DI في الاسطوانة كل 3 إلى 4 ساعات.
8. بعد فترة 24 ساعة، تفريغ حل KES مدال في الجرار توج، ويجري التأكد من ترك مساحة في الجزء العلوي وضعها في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

5. تجفيد من القرتين استخراج الحل

1. تعيين مجفاد إلى -86 درجة مئوية.
2. إزالة الجرار التي تحتوي المجمدة KES من الثلاجة، واتخاذ قبعات الخروج من الجرار، ووضعها في أمبولات مجفف تجميد. وضع الأختام على أمبولات وتحويل مقبض الباب لإنشاء ضغط الفراغ من 0.133 ميللي بار. يجفد العينات لمدة حوالي 48 ساعة حتى ذهب كل من الرطوبة.

6. إعداد حلول العزل الكهربائي (10٪ بالوزن كيراتين الحل)

1. إزالة مسحوق قرنين من مجفاد وتزن عليه.
2. إضافة الماء DI إلى مسحوق كيراتين لخلق الوزن 10٪ / الوزنحل الكيراتين.

7. إعداد 10٪ بالوزن PCL الحل

1. الحصول على PCL (ε-caprolactone البوليمر، المنغنيز 70-90 كيلو دالتون)، وtrifluoroethanol (TFE). إعداد 10٪ من وزنها PCL في TFE عن طريق اثارة O / N والحصول على مزيج متجانس.

8. إعداد كيراتين / PCL الحل

1. الحصول علي 10٪ بالوزن PCL حل معدة مسبقا وحل قرنين 10 وزن٪. إضافة الكيراتين إلى انخفاض حل PCL الحكمة من أجل خلق 10 مل PCL / حلول الكيراتين من 90:10، 80:20، 70:30، 60:40 و النسب.
2. استخدام vortexer للحصول على خليط متجانس من حل PCL / كيراتين قبل العزل الكهربائي.

9. إنتاج Electrospun PCL / ألياف الكيراتين

1. ضع حوالي 8 مل من PCL / حل قرنين في 10 مل حقنة واحدة مزودة 0.5 ملم أنبوب قطره البلاستيك. وضع حقنة في ضخ حقنة حيث يتم تعيين معدل تدفق ليكون 2.5 مل / ساعة.
2. تطبيق الجهد إلى رأس الإبرة المتصلة أنبوب (بوضعها ~ 23 سم من الألياف جمع طبل، و~ 30 درجة من الأفقي). تطبيق 19-22 كيلو فولت التيار الكهربائي إلى أنبوب وتدوير أسطوانة جامع بنحو 200 دورة في الدقيقة.
   1. التفاف طبل جامع مع رقائق الألومنيوم قبل تشغيل العينة. تأكد من أن رقائق الألومنيوم هو مستقر من خلال تطبيق الشريط وضع العلامات على حد سواء.
      ملاحظة: إن الألياف تتشكل على رقائق الألومنيوم (انظر الشكل 2)، وتخزين الألياف مغطاة احباط في RT.

10. تحليل الميكانيكية من PCL / كيراتين ألياف النانو

1. قطع العينة إلى 60 مم 8 مم. تأكد من تسجيل سمك باستخدام ميكرومتر الرقمية. لكل تكوين إعداد، استخدم خمس عينات.
2. إرفاق العينة 60 × 8 ملم في اختبار الشد. استخدام مصممة خصيصا صاحب العينة إرفاق العينة. شطيرة العينة بين أصحاب العينة التي تتم من بطاقة الرقم القياسي باستخدام مزدوجالشريط جانب. تطبيق الخلية 10 N الحمل بمعدل تشريد 10 مم / دقيقة.
   ملاحظة: تم تصميم حامل العينة ليكون 62 مم 40 مم مع نافذة الداخلي 50 ملم بنسبة 38 مم.
3. تمديد تسجيل والقيم الحمل من خلال البرنامج وفقا لبروتوكول البرمجيات.
4. حساب الإجهاد عن طريق قسمة القوة من قبل منطقة من العينة التي تم اختبارها. بعد ذلك، حساب سلالة بقسمة التغير في طول بواسطة طول الأولي.
5. توليد منحنى الإجهاد والانفعال عن طريق التآمر التوتر في المحور ص لمقابلة قيمة الضغط في محور س.
6. حساب معامل يونغ من المنطقة الخطية حيث يساوي المنحدر إلى معامل المرونة. تحديد قوة الشد من سلالة مؤامرة الإجهاد عن طريق أخذ 0.2٪ يقابلها في سلالة ورسم خط مواز لمنحنى المنطقة الخطية.
7. إجراء التحليل الإحصائي للبيانات التي تم الحصول عليها الميكانيكية في ثلاث نسخ مسبقا باستخدام تحليل التباين الأحادي باستخدام برامج التحليل ^8. القيم ف <0.05 نحنإعادة النظر في دلالة إحصائية.

11. سطح الصرف والهيكلية توصيف

1. استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) مع المعلمات تسريع الجهد 15 كيلو فولت وتيار 5 أمبير لمراقبة التشكل من الألياف electrospun.
   1. قبل التصوير مع وزارة شؤون المرأة، وقطع 2 سم ² القسم من الألياف ونعلق عليه إلى مرحلة SEM باستخدام شريط النحاس. وضع المسرح داخل المغطى تفل ومعطف مع الذهب عند 15 أمبير لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية لخلق طبقة الذهب حوالي 11 نانومتر سميكة. تحميل العينة إلى الغرفة ووزارة شؤون المرأة. مراقبة عينات من الألياف.
2. استخدام تحويل فورييه الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (FTIR) لوصف الروابط الكيميائية بين PCL والكيراتين. وضع القسم 2 سم ^{2 من} الغشاء electrospun ألياف نانوية في حامل المغناطيسي وتطهير النظام مع الهواء الجاف قبل إجراء الاختبار. الحصول على أطياف 200 بمسح وتحليل الأطياف باستخدام ستابرنامج ndard وفقا لبروتوكول البرمجيات.
3. لتحليل الطيف باستخدام البرمجيات القياسية واستخدام يثلث من كل نسبة ألياف نانوية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

دراسة 12. التفاعل الخلوي الألياف

1. قطع الألياف إلى 16 مم ² العينات. استخدام حيويا، القائمة على السيليكون الغراء لإصلاح كل عينة لcoverslips التي يبلغ قطرها 12 ملم.
2. الغراء واحدة من نهاية عينة من الألياف إلى الجزء الخلفي من انزلاق الغطاء، والتفاف العينة حول ساترة، ثم الغراء نهاية خالية من العينة إلى الجزء الخلفي من انزلاق الغطاء كذلك، وترك الجزء العلوي من زلة مغطاة فقط عينة من الألياف.
3. وضع عينات من الألياف في 24 لوحة جيدا. تعقيم العينات عن طريق غمر في 80٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة.
4. شطف الإيثانول من العينات باستخدام المياه DI. ثم، ماصة 2 مل من المتوسط ​​القاعدية على العينات، مع التأكد من تغطية العينة كلها. إزالة المتوسطة بعد 5 دقائق.
5. استخدام الخلايا الليفية 3خلايا T3 إلى البذور وعينات من الألياف. تعليق الخلايا في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) تستكمل مع المضادات الحيوية و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) حتى لا يكون هناك ما يقرب من 62000 خلية / سم ^{2 في} 1 مل من DMEM.
6. إسقاط 1 مل من التي تحتوي على الخلايا حل 3T3 DMEM في كل لوحة جيدا ضمان أن يتم تغطية كل عينة الألياف مع ما يقرب من 62000 خلية / ^سم 2. احتضان لوحات جيدا لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2. ملاحظة: استخدام 5٪ CO ₂ لهذا المستوى يمكن عادة الحفاظ على درجة الحموضة وسائل الإعلام خلية في نطاق الفسيولوجية لعدة أيام.

13. تدهور ألياف نانوية مصفوفة

1. قطع المجففة PCL / الأغشية ألياف نانوية الكيراتين في مربع حوالي 30 ملم × 30 ملم.
2. تعقيم 900 مم ² العينات مع 80٪ من الكحول لفترة حضانة 10 دقيقة ويغسل جيدا بالماء DI. احتضان العينات في 15 مل من برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.5، في 37 درجة مئوية. استبدال BUFفر كل 3 أيام.
3. خذ الأغشية من الحل في فترات زمنية محددة، 1 أسبوع و 7 أسابيع، ويشطف بالماء DI.
4. وضع العينات الغشاء في أمبولات مجفف تجميد. وضع الأختام على أمبولات وتحويل مقبض الباب لخلق فراغ. يجفد لمدة 24 ساعة، حتى تجف تماما.
5. إرفاق العينة المجففة إلى مرحلة SEM باستخدام شريط النحاس. وضع المسرح داخل المغطى تفل ومعطف مع الذهب عند 15 أمبير لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية.
6. تحميل العينة إلى الغرفة ووزارة شؤون المرأة. مراقبة عينات من الألياف في الجهد تسريع 1.5 كيلو فولت أمبير و 5 الحالي.

النتائج

الألياف الصرف
تم الحصول على الصور ووزارة شؤون المرأة من الألياف لجميع مكونات الألياف. انظر الشكل 3. صورة الألياف تؤكد أن الألياف وتوجه بشكل عشوائي.

اختب...

Discussion

وقد تحقق استخراج الكيراتين من الشعر البشري بنجاح. حمض البيروكسي تصرفت باعتبارها عامل مؤكسد على شعرة الإنسان، والسماح للالكيراتين سيتم استخراجها من قاعدة تريس. كان إنتاج مسحوق قرنين على نطاق صغير يرجع ذلك إلى حقيقة أن تم القيام به فقط لأغراض البحث. وقد تم بالفعل تأسي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Hair			Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% crystalline
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning electron microscope	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series	AGS-X Series	Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD)	Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test	SigmaPlot 12 software