의 생명 공학에 대한 각질 기반의 나노 섬유의 합성

요약

전기 방사 나노 섬유는 비 기계적 무결성을 중량으로 세포의 성장과 증식을 지원하는 높은 표면적을 갖는다. 이러한 나노 섬유는 의치 넓은 응용 범위를 가진다. 여기서 우리는 전기 방사 기술을 이용하여 각질 / PCL 나노 섬유를 제조하고, 조직 공학에서의 응용 가능성을 위해 섬유를 특성화.

초록

다양한 분야에서의 응용을위한 범용성 및 잠재적으로 인해 전기 방사, 자주 나노 파이버를 제조하기 위해 사용되고있다. 이러한 다공성 나노 섬유의 생산은 그들의 독특한 물리 화학적 특성에 큰 관심이다. 여기에서 우리는 폴리 (ε 카프로 락톤)를 포함하는 케라틴 (PCL) 나노 섬유 (즉, PCL이 / 케라틴 합성 섬유)의 제조에 정교한. 수용성 각질 제 머리카락으로부터 추출 된 다른 비율의 PCL과 혼합 하였다. PCL / 각질의 혼합 용액을 설정 실험실 설계 전기 방사를 이용한 나노 섬유 멤브레인로 변신했다. 섬유 형태 얻어진 나노 파이버의 기계적 특성을 관찰 주 사형 전자 현미경 및 인장 시험기를 사용하여 측정 하였다. 또한, 나노 파이버의 분해성 화학적 특성은 FTIR에 의해 분석 하였다. SEM 이미지는 다른 조성의 PCL / 케라틴 섬유의 균일 한 표면 형상을 나타내었다. 이 PCL / keratiN 섬유는 또한 영률 실패 점 등 뛰어난 기계 특성을 보였다. 섬유 아세포의 세포 부착과 좋은 세포 생존 능력을 증명하여 증식 할 수 있었다. 상술 한 특성에 따라, 우리는 강하게 천연 및 합성 고분자 나노 파이버가 혼합 된 다양한 생물 의학 응용에 사용할 수있는 복합 재료의 우수한 현상을 나타낼 수 있음을 주장하고있다.

서문

전기 방사 나노 섬유는 중합체를 달성 방법으로서 널리 인식되고있다. 섬유는 나노 스케일에서 제조 될 수 있고, 섬유 ^한 사용자 정의 속성이다. 이러한 발전과 전기 방사 나노 섬유의 특성은 특히 조직 공학에서 생물 의학 공학 애플리케이션에 특히 흥미 있었다. 전기 방사 나노 섬유는 세포 외 매트릭스 유사성을 가지고있어 세포의 부착, 이동 및 ^{증식을 촉진이.} 때문에 세포 외 기질 (ECM)이 유사성, 전기 방사 섬유 상처 드레싱, 약물 전달을 돕기 위해 원료로 사용 될 수 있고, 예컨대 간, 뼈, 심장, 근육 ^(3)와 같은 조직 공학에 대한.

합성 및 천연 기원의 다른 중합체의 다양한 다른 애플리케이션 의공학 ⁴ 전기 방사 섬유를 만드는 데 사용되어왔다. 최근에이 성장하고있다합성 및 천연 중합체 ^(4)를 혼합하여 복합 나노 파이버의 개발의 terest. 이러한 조성물에서 최종 제품은 일반적으로 또한 천연 고분자에서 생물학적 단서와 속성을 채택하면서 합성 고분자와 관련된 기계적 강도를 상속합니다.

합성 및 천연 중합체는 나노 복합체의 합성에 사용되는 바와 같이,이 실험에서, PCL 및 케라틴이 제시된다. 각질은 머리, 양모와 손톱에서 발견되는 천연 중합체이다. 그것은 많은 아미노산 잔기를 포함 주목할만한 관심 시스테인 ^{4,5입니다.} 이상적으로 천연 중합체는 biorenewable 생체 적합성 및 생분해 될 것이다. ^{또한도 6에} 포함 된 생체 물질에 세포 증식 및 부착을 강화하면서 각질이 모든 특성을 가지고 세.

폴리 카프로 락톤 (PCL)를 크게하는 흡수성 합성 폴리머조직 공학 ^4. 이러한 중합체는 이전 구조적 및 기계적 안정성을 평가되고 있으며, 그러나, 세포 친 화성이 부족하고 긴 분해율을 나타낸다. PCL의 소수성 특성은 세포 친 화성 ^(7)의 부족에 대한 가능성이 담당합니다. 그러나, PCL는 다른 폴리머와 매우 혼합 됨으로써 한계로 가입합니다. PCL / 각질 복합 PCL의 기계적 특성을 설명하고 다양한 생명 의학 애플리케이션을위한 이상적인 선택하고, 각질의 생물학적 특성을 통합해야합니다.

프로토콜

모든 프로토콜은 연구 준수 및 윤리 노스 캐롤라이나 A & T 주립 대학 사무실의 지침을 따릅니다.

각질 추출 ⁴ 1. 화학 준비

1. 흄 후드, 2 % 중량 / 부피 초산 용액 (PAS) 1000 ml의를 준비하는 것은 탈 (DI) 물 980 ml의 초산 20 ㎖를 추가합니다.
2. 100 mM 트리스 염기 용액 (TBS) : 1000㎖를 제조 DI 물 1000 ml의 트리스베이스의 12.2 g을 추가하고 완전히 용해 될 때까지 교반한다.
3. DI 물 30 ㎖에 진한 염산 4 mL로 흘려 흄 후드에 묽은 염산 수용액 (DHAS)을 준비한다.
4. 화학적으로 처리되거나 변경되지 않은 인간의 머리 잘라낸의 약 20 g의 조달. 헤어 길이 될 수 있습니다.
5. 따뜻한 물과 비누로 손으로, 철저하게 머리를 씻으십시오. 마지막 헹굼에 대한 탈 (DI) 물을 사용합니다.
6. 80 ºC O를 두 개의 600 ㎖의 비커에 머리와 장소를 넣어1 시간 동안 VEN.
7. 비커의 바닥으로부터 액체를 배출시키고 모발이 완전히 건조 될 때까지 오븐에서 제자리.
8. 분할은 각 비커에 머리 10g을 배치, 600 ml의 비커 사이에 균일하게 머리를 건조. 500 개 이상의 ml의를 채우기 위해 머리를 허용하지 않습니다.
9. 머리를 모두 커버해야하고 각각의 비이커에 PAS 500 ml에 따르십시오. 12 시간 동안 파라 필름 및 저장과 비커를 커버.

케라틴 추출물 솔루션 2. 준비

1. 500 μm의 체를 사용하여 PAS에서 머리를 분리합니다. 별도의 용기에 폐기물 PAS를 수집합니다. 남은 PAS를 제거하는 DI의 물로 머리를 씻어.
2. 500㎖의 플라스크에 세척 머리를 놓습니다. 머리가 포함되어 있는지 확인하고, 플라스크에 TBS 400ml를 붓고. 38 ºC, 1 시간 동안 65 rpm으로 설정 떨고 욕조에 넣어 플라스크.
3. 1 시간 후, 각질 추출 용액의 약 400 ㎖ (KES)에 액체를 목욕을 흔들어에서 제거하고 부어, 난1,000 비이커 NTO.
4. 모발 덮고 1 시간 동안 진탕 수욕 제자리 않도록 보장 머리 함유 플라스크에 탈 이온수 400ml를 붓는다. 진동 화장실에서 플라스크를 제거하고 이전에 수집 된 KES으로 1,000 ml의 비이커에 KES의​​ 나머지 400 ml에 붓는다. 모발은 더 이상 필요하지 않은 가장 가까운 쓰레기 수용 플라스크 밖으로 버려진 폐기 될 수있다.

케라틴 추출물 솔루션 3. 농도

1. 증류수로 맨 윗줄에 rotodistiller 목욕을 입력하고 90 ºC로 설정합니다. 200 rpm으로 설정 회전 속도. 냉각수 냉각 펌프를 켜고 -10 ºC로 설정합니다.
2. pH 미터를 사용하여, KES의​​ pH를 모니터링 천천히 pH가 7.0에 도달 할 때까지 KES 1 mM의 DHAS을 추가 피펫을 사용합니다. 용액을 추가로 천천히 교반한다.
3. 전체에 대한 분기까지 둥근 바닥 플라스크에 500 ml의에 중화 KES을 따르십시오. 제조업체에 따라 증류기를 실행1.25 시간 동안 프로토콜입니다.
   1. KES의 모든 때까지 단계를 반복 3.3 증류되고있다. 플라스크에 단단히 연결되어 있는지 확인합니다.

케라틴 추출물 솔루션 4. 투석

1. (12) 별도의 14 ML 원뿔 튜브에 동일하게 KES 솔루션을 따르십시오. 10 분 동안 1,050 XG에서 튜브를 원심 분리기.
2. 수집 된 파편에서 멀리 부어해야하고, 깨끗한 비커에 원심 분리 KES을 따르십시오. KES의 모든 원심 분리 될 때까지 반복합니다.
3. 채우기 2,000 ml의 DI 물과 실린더를 졸업했다.
4. 이십사인치 투석 튜브 셀룰로오스 막을 잘라, 그것을 폐쇄 유지하도록 튜브의 한쪽 끝을 클립.
5. 더 유연하고 쉽게 열 수 있도록 DI 워터의 실린더 튜브의 길이를 딥.
6. 투석 튜빙 셀룰로오스 막의 비 클립핑 단부를 열고 천천히 원심 튜브에 KES 용액 60 ㎖에 붓는다. 튜브의이 끝을 닫습니다 다른 클립을 사용합니다.
7. 디 넣어DI 물 2,000 ml의 실린더 alysis 튜브와 24 시간 동안 앉아서 할 수 있습니다. 실린더에있는 모든 3 ~ 4 시간을 DI 물을 변경합니다.
8. 24 시간 기간 후, 24 시간 동안 -20 ° C에서 냉동실에 상단의 공간과 장소를 떠날 확인되고, 덮인 항아리에 투석 KES 솔루션을 비 웁니다.

5. 동결 건조 각질 추출 솔루션

1. -86 ºC에 동결 건조기를 설정합니다.
2. , 냉동실에서 냉동 KES를 포함하는 항아리를 제거 항아리 떨어져 뚜껑을하고​​, 동결 건조 앰플에 배치합니다. 앰플에 씰을 놓고 0.133 mbar에서의 진공 압력을 생성하기 위해 노브를 돌려. 모든 수분이 멈출 때까지 약 48 시간 동안 샘플을 동결 건조.

전기 방사 솔루션 6. 준비 (10 중량 % 각질 솔루션)

1. 동결 건조기에서 각질 가루를 제거하고 무게.
2. 10 % 중량 / 중량을 만들 케라틴 분말 DI 물 추가각질 솔루션입니다.

10 % 중량 PCL 솔루션 7. 준비

1. 및 트리 플루오로 에탄올 (TFE) - PCL (90 kDa의 ε 카프로 락톤 폴리머, 망간 70)을 얻었다. 교반 O / N에 의해​​ TFE에 무게 PCL으로 10 %를 준비하고 균질 혼합물을 구하십시오.

각질 / PCL 솔루션 8. 준비

1. 10 중량 % PCL 용액을 미리 준비하고, 10 중량 % 각질 솔루션을 얻습니다. 90:10, 80:20, 70:30 10 ml의 PCL / 각질 솔루션, 60:40 비율을 만들기 위해 현명한 PCL 용액 드롭으로 각질을 추가합니다.
2. 전기 방사 전에 PCL / 각질 용액의 균질 한 혼합물을 수득 vortexer를 사용합니다.

전기 방사 PCL 9. 생산 / 케라틴 섬유

1. 0.5 mm 직경의 플라스틱 튜브가 장착 된 10 ㎖의 일회용 주사기에 PCL / 각질 솔루션의 약 8 ml에 놓습니다. 유속은 2.5 ㎖ / 시간으로 설정된다 주사기 펌프에 주사기를 놓는다.
2. 관에 접속 침의 선단에 전압을인가 (~ 수평으로부터 30도를 드럼 수집 섬유로부터 ~ 23cm 위치 등). 튜브에 22 kV의 전압과 약 200 rpm에서 집 드럼을 회전 - 19을 적용합니다.
   1. 샘플을 실행하기 전에 알루미늄 호일로 집 드럼을 감싸. 알루미늄 호일은 양쪽 끝에서 라벨 테이프를 적용하여 안정적인지 확인하십시오.
      참고 : 섬유는 알루미늄 호일에 형성한다 (그림 2 참조) RT에서 섬유 커버 호일을 저장합니다.

PCL / 각질 나노 파이버 (10) 기계 분석

1. 8mm에서 60mm로 샘플을 잘라. 디지털 마이크로 미터를 사용하여 두께를 기록해야합니다. 준비 각 구성의 경우, 5 개의 샘플을 사용합니다.
2. 인장 시​​험기에 60 × 8 밀리미터 샘플을 연결합니다. 샘플을 연결하는 맞춤 설계 시편 홀더를 사용합니다. 이중 사용 색인 카드로 만들어 시편 홀더 간의 샘플 샌드위치양면 테이프. 10mm / 분의 변위 율 10 N 부하 셀을 적용한다.
   참고 : 시편 홀더는 38mm 50 mm의 내부 창 40mm로 62mm로 설계되었습니다.
3. 확장 레코드 및 소프트웨어 프로토콜에 따라 소프트웨어를 통해 부하 값.
4. 시험 샘플의 면적으로 나눔으로써 힘 응력을 계산한다. 다음으로, 초기 길이만​​큼 길이의 변화로 나누어 변형을 계산한다.
5. X 축에 스트레인 값에 대해 대응하는 Y 축 응력을 플롯하여 응력 - 변형 곡선을 생성한다.
6. 경사 탄성률 같음 선형 영역에서의 영률을 계산한다. 변형의 오프셋 (offset) 0.2 %를 복용하고 선형 영역 곡선에 평행 한 선을 그려 응력 변형 플롯에서 인장 강도를 결정합니다.
7. 이전 분석 소프트웨어 ^(8)를 사용하여 분산 분석을 사용하여 수득 중으로 기계 데이터의 통계적 분석을 수행한다. P 값 <0.05 우리통계적으로 유의 한 것으로 간주 다시.

11. 표면 형태와 구조 특성

1. 전기 방사 된 섬유의 형태를 관찰하기 위해 15 kV의 전압 및 5 μA의 전류 가속의 파라미터를 주 사형 전자 현미경 (SEM)을 사용한다.
   1. SEM으로 촬상에 앞서, 섬유의 ^단면이 2cm를 잘라내어 구리 테이프를 사용 SEM 스테이지에 부착. 약 11 nm 두께의 금 층을 만드는 데 1 분 30 초 동안 15mA에서 금을 스퍼터 코터와 코트 안에 무대를 놓습니다. SEM의 챔버로 샘플을로드합니다. 섬유 샘플을 관찰한다.
2. PCL과 각질 사이의 화학 결합의 특성을 적외선 분광기 (FTIR)를 푸리에 변환을 사용합니다. 자석 홀더에 전기 방사 나노 섬유 막 2cm ² 부를 넣고 실험 전에 건조한 공기 정화 시스템. (200) 검사에 대한 스펙트럼을 구하여 역을 이용하여 스펙트럼을 분석소프트웨어 프로토콜에 따라 ndard 소프트웨어.
3. 표준 소프트웨어를 사용하여 스펙트럼 분석을 수행하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 나노 섬유의 각 비율의 삼중를 사용합니다.

셀 섬유의 상호 작용의 연구 (12)

1. 16mm ² 샘플로 섬유를 잘라. 12 mm 직경으로 된 커버에 각 시료를 해결하기 위해 생체 적합성, 실리콘 기반의 접착제를 사용합니다.
2. , 다음,도 커버 슬립 위로 샘플의 자유 단을 접착제, 커버 슬립 주위 샘플 랩에만 덮여 슬립 상단 떠나는 커버 슬립 위로 섬유 샘플의 일단 접착제 섬유 샘플.
3. 24 웰 플레이트에서 섬유 샘플을 놓습니다. 1 시간 동안 80 % 에탄올에 침지시켜 샘플을 소독.
4. DI 물을 사용하여 샘​​플에서 에탄올 헹군다. 그런 다음, 피펫 전체 샘플을 커버 확인하고 샘플 상에 기초 배지 2 ㎖. 5 분 후 매체를 제거합니다.
5. 사용 섬유 아세포 (3)T3 세포는 섬유 샘플 시드. DMEM 1 ㎖ 당 / ^cm이 약 62,000 세포가 존재한다는 항생제 등이 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 세포를 일시.
6. 각 섬유 샘플 / ^cm이 약 62,000 세포로 피복되어 있도록 각 웰 플레이트 3T3 세포 함유 DMEM 용액 1ml를 놓는다. 37 ° C에서 24 시간 5 % CO ₂ 잘 번호판을 품어. 주 : 사용 5 % CO ₂ 수준은 일반적 일 생리적 범위 셀 매체의 pH를 유지할 수 있기 때문이다.

나노 섬유 매트릭스 (13) 저하

1. 잘라 사각형 약 30mm X 30mm로 PCL / 각질 나노 섬유 멤브레인을 건조시켰다.
2. 10 분의 배양 기간 동안 80 % 알코올로 900mm ² 샘플을 소독하고 DI 물로 깨끗이 씻는다. 37 ºC에서, PBS, pH를 7.5 15 ml의 샘플을 품어. 버피를 교체3 일마다 FER.
3. 지정된 간격으로 용액 중 세포막을 타고 일주 7 주, 및 DI의 물로 씻어.
4. 동결 건조 앰플로 막 샘플을 놓습니다. 앰플에 실을 삽입하고 진공을 만들려면 노브를 돌려. 완전히 건조 될 때까지 24 시간 동안 동결 건조.
5. 구리 테이프를 사용 SEM 단계로 건조 된 샘플을 연결합니다. 1 분 30 초 동안 15mA에서 금을 스퍼터 코터와 코트 안에 무대를 놓습니다.
6. SEM의 챔버로 샘플을로드합니다. 1.5 kV의 5 μA의 전류의 가속 전압에서 섬유 샘플을 관찰한다.

결과

섬유 형태론
섬유의 SEM 이미지는 모든 섬유 조성물 얻어졌다. 도 3 참조. 섬유 화상 섬유가 랜덤하게 배향되어 있음을 확인한다.

기계 테스트
기계적으로 강한 섬유는 일반적으로 다양한 조직 공학 응용 프로그램이 필요합니다. 이 섬유는 특정 스트레스와 환경 조건 ^...

토론

인간의 머리에서 각질의 추출이 성공적으로 이루어졌다. 아세트산은 케라틴은 트리스 자료 추출 할 수 있도록, 인간의 머리에 산화제로서 작용. 케라틴 분말의 제조 인해에만 연구 목적으로 행해졌 사실 소규모이었다. 이 과정은 이미 대규모 제조 산업에서 확립되었다. 소규모 케라틴 추출 목적은 오염 배치 다양성 및 비용 효율성을 제어 할 수 있었다.

각질 추출이 절차의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Hair			Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% crystalline
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning electron microscope	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series	AGS-X Series	Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD)	Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test	SigmaPlot 12 software