Синтез кератина основе нановолокон для биомедицинской инженерии

Резюме

Electrospun нановолокна имеют высокую площадь поверхности к весу, отличную механическую целостность и поддержки роста и пролиферации клеток. Эти нановолокна имеют широкий спектр биомедицинских применений. Здесь мы изготовить кератин / PCL нановолокна, используя технику электропрядения, и охарактеризовать волокна для возможных применений в тканевой инженерии.

Аннотация

Электроформования, из-за своей универсальности и возможности для применения в различных областях, в настоящее время часто используются для изготовления нановолокон. Производство этих пористых нановолокон представляет большой интерес из-за их уникальных свойства физико. Здесь мы подробно остановиться на изготовлении кератина, содержащего поли (-капролактон) (PCL) нановолокон (т.е. PCL / кератин композитный волокно). Водорастворимый кератина впервые была выделена из человеческих волос и смешивают с PCL в различных соотношениях. Смешанный раствор PCL / кератина был преобразован в нановолоконные мембран с использованием лабораторной предназначен электроформования настроить. наблюдались и измерены с использованием сканирующего электронного микроскопа и при растяжении волокна морфологии и механические свойства полученной нановолокна. Кроме того, были изучены разложению и химические свойства нановолокна методами ИК. СЭМ изображения показали равномерное морфологию поверхности для PCL / кератиновые волокна различного состава. Эти PCL / keratiп волокна также показали отличные механические свойства, такие как модуль упругости и отказов точки Юнга. Фибробластов клетки были способны прикрепиться и размножаться тем самым доказав хорошую жизнеспособность клеток. Исходя из характеристик, рассмотренных выше мы можем утверждать, что сильно смешанные нановолокна из природных и синтетических полимеров может представлять отличную разработку композиционных материалов, которые могут использоваться для различных биомедицинских применений.

Введение

Электроформования признан распространенным методом достижения полимерных нановолокон. Волокна могут быть изготовлены на наноуровне и свойства волокна являются настраиваемый ^{с 1.} Эти события и характеристики electrospun нановолокон были особенно интересны для их применения в биомедицинской инженерии особенно в тканевой инженерии. В electrospun нановолокна обладают сходство с внеклеточного матрикса и тем самым способствовать адгезии клеток, миграцию и пролиферацию ^2. В связи с этим сходство с внеклеточным матриксом (ECM), electrospun волокна могут быть использованы в качестве материалов для оказания помощи в перевязочного, доставки лекарств, и для инженерных тканей, таких как печень, кости, сердце и мышцы ^3.

Множество различных полимеров синтетического и природного происхождения, были использованы для создания electrospun волокна для различных биомедицинских инженерных приложений ^4. В последнее время растет винтерес представляют также разработка композиционных нановолокон путем смешивания синтетических и природных полимеров ^4. В этих композициях конечные продукты, как правило, наследуют механическую прочность, связанный с синтетическим полимером в то же время принимая биологические сигналы и свойства из природного полимера.

В этом эксперименте, PCL и кератина представлены как синтетические и природные полимеры, которые будут использоваться для синтеза композиционного нановолокна. Кератин природный полимер, который находится в волосах, шерсти и ногтей. Он содержит много аминокислотных остатков; ощутимого интереса цистеин ^4,5, В идеале естественным полимером бы biorenewable, биологически совместимый и биологически. Кератин имеет все эти три характеристики в то же время увеличивая пролиферацию клеток и привязанность к биоматериалов он включается ^{в 6.}

Поликапролактон (PCL) является рассасыванию, синтетический полимер, который является существенным втканевой инженерии ^4. Этот полимер был ранее высокую оценку за его структурной и механической стабильностью, однако, ему не хватает сродство клеток и обладает длительной скорость деградации. Гидрофобный характер PCL, вероятно, ответственным за отсутствие клеточной сродством ^7. Тем не менее, PCL составляет для его ограничения, будучи высоко смешивается с другими полимерами. PCL / кератин композитный должны продемонстрировать механические свойства PCL и включить биологические свойства кератина, что делает его идеальным выбором для различных биомедицинских применений.

протокол

Все протокола следует рекомендациям Государственного университета Управления Северная Каролина & T исследовательского соблюдению и этики.

1. Химический Подготовка к кератина Extraction ⁴

1. Чтобы приготовить 1000 мл 2% вес / объем надуксусной кислоты (PAS), в вытяжном шкафу добавить 20 мл надуксусной кислоты до 980 мл деионизированной (ДИ) воды.
2. Чтобы приготовить 1,000 мл 100 мМ раствора базовой Трис (TBS), добавить 12,2 г трис-основани 1000 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения.
3. Подготовьте разбавленный раствор соляной кислоты (роЗ) в вытяжном шкафу при заливке 4 мл концентрированной соляной кислоты в 30 мл дистиллированной воды.
4. Закупка примерно 20 г вырезки человеческих волос, которые не были химически обработанных или изменено. Волосы могут быть любой длины.
5. Промыть волосы тщательно, вручную, с теплой водой и мылом. Используйте деионизированной (ДИ) воды для окончательной промывки.
6. Поместите волосы на две 600 мл стаканы и место в 80 ºC Oаже в течение 1 часа.
7. Слейте жидкость из нижней части стакана и поместите обратно в духовку, пока волосы полностью высохнет.
8. Разделить сушат волосы равномерно между 600 мл химических стаканах, помещая 10 г волос в каждом стакане. Не допускать волосы, чтобы заполнить более 500 мл.
9. Налейте 500 мл PAS в каждом стакане убедившись, чтобы покрыть все волосы. Накройте стаканы с парафином и хранить в течение 12 ч.

2. Подготовка кератина раствор экстракта

1. Отделить волосы от PAS использованием сита 500 мкм. Сбор PAS отходов в отдельном контейнере. Ополосните волосы тщательно дистиллированной водой для удаления любых оставшихся PAS.
2. Поместите промытый волосы в колбу на 500 мл. Налейте 400 мл TBS во флягу, чтобы убедиться, что волосы полностью покрыты. Место колбу в качалке бане до 38 ° С, 65 мин в течение 1 ч.
3. Через 1 ч удалить из встряхивая ванну и залить жидкость, около 400 мл экстракционного раствора кератина (KES), яNto стакан на 1000 мл.
4. Налейте 400 мл дистиллированной воды в колбу, содержащую волосы, обеспечивающую, что волосы покрывают и помещают обратно в качалке бане в течение 1 часа. Удалить колбу из дрожащей бане и залить оставшиеся 400 мл в КЭС в 1000 мл стакан с собранной ранее КЭС. не волосы больше не нужен и может быть сброшены из колбы и отбрасываются в ближайшее мусорное сосуда.

3. Концентрация кератина раствор экстракта

1. Заполните rotodistiller ванну в верхней строке с дистиллированной водой и установить до 90 ° С. Установите скорость вращения до 200 оборотов в минуту. Включите теплоносителя чиллер-насоса и установить до -10 ° С.
2. Использование рН-метра, чтобы контролировать рН KES, использовать пипетку, чтобы постепенно добавить 1 мМ роЗ к KES до достижения рН 7,0. Медленно перемешивайте как добавлен раствор.
3. Налейте нейтрализованного KES в 500 мл круглодонную колбу, примерно до четверти полном объеме. Запуск дистиллятор соответствии с производителемПротокол 1,25 ч.
   1. Повторите шаг 3,3 до все КЭС была дистиллированная. Убедитесь, что колба тесно связана.

4. Диализ кератина раствор экстракта

1. Налейте раствор KES поровну на 12 отдельных конических труб 14 мл. Центрифуга трубки при 1050 мкг в течение 10 мин.
2. Налейте центрифугировали KES в чистую стакан, убедившись, что вылить из собранного мусора. Повторите, пока все KES не была центрифугировали.
3. Заполните 2,000 мл мерный цилиндр с дистиллированной водой.
4. Вырезать диализной мембраны трубки целлюлозы до 24 дюймов, и клип один конец трубки провести закрытое.
5. Dip длину трубки в цилиндре дистиллированной водой, чтобы сделать ее более гибкой и легче открывать.
6. Откройте нон-обрезается конец целлюлозной мембране для диализа и медленно залить 60 мл центрифугируют раствор КЭС в трубку. Используйте другой клип, чтобы закрыть эту конец трубки.
7. Поместите диalysis трубки в 2000 мл цилиндра дистиллированной водой и позволяют сидеть в течение 24 ч. Изменение DI воды в цилиндре каждые 3 до 4 ч.
8. После периода 24 ч, опорожнить диализуют решение KES в крышками банок, будучи уверенным оставить пространство в верхней и место в морозильной камере при температуре -20 ° С в течение 24 ч.

5. После лиофилизации кератина раствор экстракта

1. Установите лиофилизатор чтобы -86 ° С.
2. Удалить банки, содержащие замороженную KES из морозильника, принять колпачки офф банок, и поместить их в Сушилка ампулах. Поместите уплотнения на ампулах и повернуть ручку, чтобы создать разрежение 0,133 мбар. Лиофилизации образцы примерно 48 ч, до тех пор, вся влага не исчезнет.

6. Подготовка электроформования Solutions (10% мас кератина Решение)

1. Удалить кератином порошка из лиофилизации и взвесить его.
2. Добавить DI воды к порошку кератина создать 10% вес / весКератин решение.

7. Подготовка 10% мас PCL Solution

1. Получить PCL (ε-капролактон полимера, Mn 70 - 90 кДа), и трифторэтанола (ТФЭ). Приготовьте 10% по весу PCL в ТФЭ перемешиванием O / N и получения гомогенной смеси.

8. Приготовление раствора кератина / PCL

1. Получить 10% -ного раствора PCL заранее подготовленный и 10 мас% кератина решение. Добавить кератин в каплю раствора PCL разумному, чтобы создать 10 мл PCL / кератиновые растворы 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 коэффициенты.
2. Используйте Vortexer до получения однородной смеси раствора PCL / кератина, прежде электроформования.

9. Производство Electrospun PCL / кератин волокна

1. Поместите примерно 8 мл в / кератина раствора PCL в 10 мл одноразовом шприце, снабженной пластиковым диаметр трубки 0,5 мм. Поместите шприц в шприцевой насос, где скорость потока устанавливается на уровне 2,5 мл / ч.
2. Подать напряжение на кончике иглы, подключенного к трубке (позиционируется ~ 23 см от волокна собирающего барабана, и ~ 30 градусов от горизонтального положения). Нанесите 19 - напряжение кВ 22 к трубке и вращать барабан коллектора около 200 оборотов в минуту.
   1. Оберните коллектор барабан с алюминиевой фольгой перед запуском образца. Убедитесь, что алюминиевая фольга является стабильным путем применения маркировки ленты на обоих концах.
      Примечание: Волокна образуют на алюминиевую фольгу (рисунок 2), хранить волокна покрыты фольгой при комнатной температуре.

10. Механическое Анализ PCL / кератина нановолокон

1. Вырезать образец в 60 мм на 8 мм. Убедитесь, чтобы записать толщину с помощью цифрового микрометра. Для каждого композиции, полученной использовать пять образцов.
2. Прикрепите образец 60 х 8 мм в динамометре. Использовать пользовательский разработан держатель образца, чтобы приложить образец. Сэндвич образец между держателями образцов, который производится из карточках с помощью двойнойклейкая лента. Применить ячейку 10 Н нагрузки со скоростью перемещения 10 мм / мин.
   Примечание: Держатель образца был разработан, чтобы быть 62 мм на 40 мм с внутренним окна 50 мм на 38 мм.
3. Расширение Запись и значения нагрузки с помощью программного обеспечения в соответствии с протоколом программного обеспечения.
4. Рассчитать напряжение путем деления силы на площади образца тестируемого. Далее, рассчитать нагрузку путем деления изменение длины путем первоначальной длины.
5. Генерирование кривой растяжения путем построения напряжение в оси ординат для соответствующих величина напряженности в оси х.
6. Рассчитать модуль Юнга от линейной области, где наклон равен модулю упругости. Определить предел прочности при растяжении от стресса деформации участка, принимая 0,2% смещения в штамме и рисунок параллельную линию к линейной кривой области.
7. Выполните статистический анализ механических данных, полученных в трех экземплярах ранее с помощью одностороннего анализа дисперсии с использованием программного обеспечения для анализа ^8. Значения Р <0,05 мыповторно рассматривалось как статистически значимое.

11. Морфология поверхности и структурной характеристики

1. Используйте сканирующего электронного микроскопа (SEM) с параметрами ускоряющего напряжения 15 кВ и ток 5 мкА наблюдать морфологию electrospun волокон.
   1. До визуализации с SEM, вырезать 2 ^{см 2} сечении волокна и прикрепить его к стадии SEM использованием медной ленты. Поместите этап внутри установки дл покрыти распылением и покрыть золотом на 15 мА в течение 1 мин и 30 сек, чтобы создать слой золота приблизительно 11 нм. Загрузите образец в камере SEM. Соблюдайте образцов волокна.
2. Используйте преобразование Фурье инфракрасную спектроскопию (FTIR), чтобы характеризовать химическое связывание между PCL и кератина. Поместите раздел 2 ^{см 2} electrospun нановолокна мембраны в магнитном держателе и очистить систему с сухим воздухом перед тестированием. Получить спектры 200 сканирований и анализа спектров с помощью STAndard обеспечение в соответствии с протоколом программного обеспечения.
3. Выполнить анализ спектра с использованием стандартного программного обеспечения и использовать трех повторах каждого соотношении нановолокна в соответствии с протоколом производителя.

12. Изучение сотовый волокна взаимодействию

1. Вырезать волокна на 16 ^{мм 2} образцов. Используйте биосовместимого, на основе силикона клей для фиксации каждого образца, чтобы покровные с диаметром 12 мм.
2. Клей один конец образца волокна к задней части покровного стекла, обернуть образца вокруг покровное, затем склеить свободный конец образца к задней части покровного стекла, а также, выходящий из верхней части скольжения покрытой только волокно образца.
3. Поместите образцы волокна в 24-луночный планшет в. Стерилизовать образцы погружением в 80% этаноле в течение 1 часа.
4. Промыть этанола из образцов с использованием ДИ воды. Затем, пипетки 2 мл базальной среды на образцах, убедившись, чтобы покрыть весь образец. Удалить среду после 5 мин.
5. Использование фибробластов 3T3 клетки, чтобы отобрать образцы волокон. Приостановка клетки в среде Игла в модификации Игла (DMEM) с добавлением антибиотиков и 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), так что есть приблизительно 62000 клеток / ^{см 2 на} 1 мл DMEM.
6. Отбросьте 1 мл клеточной раствором, содержащим 3T3 DMEM в каждую лунку пластины, обеспечивающей, что каждый образец волокна покрыта примерно 62000 клеток / см ^2. Выдержите хорошо пластин в течение 24 ч при 37 ° С и 5% CO _2. Примечание: Используйте 5% _{CO 2,} потому что уровень, как правило, поддерживать рН клеточной информации в физиологическом диапазоне в течение нескольких дней.

13. Деградация нановолокна Matrix

1. Вырезать сушат PCL / кератиновые нановолокна мембраны в квадратный примерно 30 х 30 мм.
2. Стерилизовать 900 ^{мм 2} образцов с 80% -ным спиртом в течение инкубационного периода 10 мин и тщательно промыть дистиллированной водой. Инкубируйте образцы в 15 мл PBS, рН 7,5, при 37 ° С. Заменить БУФчают каждые 3 дня.
3. Возьмите мембраны из раствора с заданными интервалами, 1 неделя и 7 недель, и промыть дистиллированной водой.
4. Поместите образцы мембран в Сушилка ампулах. Поместите уплотнения на ампулах и повернуть ручку, чтобы создать вакуум. не лиофилизации в течение 24 ч, до полного высыхания.
5. Присоединить высушенного образца его до стадии SEM использованием медная лента. Поместите этап внутри покрыти распылением и покрыть золотом на 15 мА в течение 1 мин и 30 сек.
6. Загрузите образец в камере SEM. Соблюдайте образцов волокна при ускоряющем напряжении 1,5 кВ и 5 мкА.

Результаты

Волоконно Морфология
СЭМ изображения волокон были получены для всех композиций волокон. См Рисунок 3. Волоконно изображения подтверждает, что волокна ориентированы случайным образом.

Механические испы...

Обсуждение

Добыча кератин из волос человека была успешно достигнута. Надуксусной кислоты действовал в качестве окислителя на человеческий волос, позволяя кератина должны быть извлечены с помощью Трис-основание. Производство кератина порошка была небольшой масштаб в связи с тем, что это было сде...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Hair			Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% crystalline
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning electron microscope	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series	AGS-X Series	Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD)	Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test	SigmaPlot 12 software