Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

Riepilogo

nanofibre elettrofilate hanno una elevata area superficiale al rapporto di peso, eccellente integrità meccanica, e sostenere la crescita e la proliferazione cellulare. Questi nanofibre hanno una vasta gamma di applicazioni biomediche. Qui ci fabbrichiamo cheratina / nanofibre PCL, utilizzando la tecnica electrospinning, e caratterizzare le fibre per le possibili applicazioni in ingegneria dei tessuti.

Abstract

Electrospinning, grazie alla sua versatilità e potenziale per le applicazioni in vari campi, viene frequentemente utilizzato per fabbricare nanofibre. La produzione di queste nanofibre porosi è di grande interesse a causa delle loro proprietà fisico-chimiche uniche. Qui abbiamo approfondire la fabbricazione di cheratina contenente poli (ε-caprolattone) (PCL) nanofibre (ad esempio, PCL / cheratina fibre composite). L'acqua cheratina solubile è stato estratto da capelli umani e mescolato con PCL in diversi rapporti. La soluzione mista di PCL / cheratina è stato trasformato in membrane nanofibrous utilizzando un laboratorio progettato elettrospinning istituito. Fibra morfologia e le proprietà meccaniche del nanofibre ottenute sono state osservate e valutate utilizzando la microscopia elettronica a scansione e tester di trazione. Inoltre, degradabilità e chimiche del nanofibre sono stati studiati da FTIR. immagini SEM hanno mostrato morfologia superficiale uniforme per le fibre PCL / cheratina di composizioni diverse. Questi PCL / keratifibre n hanno mostrato eccellenti proprietà meccaniche come modulo di Young e fallimento point. fibroblasti sono stati in grado di collegare e proliferare in tal modo dimostrando buona vitalità cellulare. Sulla base delle caratteristiche di cui sopra, possiamo fortemente sostenere che le nanofibre miscelate di polimeri naturali e sintetici possono rappresentare un eccellente sviluppo di materiali compositi che possono essere utilizzati per diverse applicazioni biomediche.

Introduzione

Electrospinning è riconosciuto come metodo prevalente di realizzare nanofibre polimeriche. Le fibre possono essere prodotte su nanoscala e le fibre sono personalizzabili ^1. Questi sviluppi e le caratteristiche di nanofibre elettrofilate sono stati particolarmente interessanti per le loro applicazioni in Ingegneria Biomedica soprattutto in ingegneria dei tessuti. Le nanofibre elettrofilate presenta analogie con la matrice extracellulare e favorire in tal modo l'adesione cellulare, la migrazione e la proliferazione ^2. A causa di questa somiglianza alla matrice extracellulare (ECM), fibre elettrofilate possono essere utilizzati come materiali per aiutare nella medicazione, somministrazione di farmaci, e per i tessuti tecnici come fegato, osso, cuore e muscolo ^3.

Una varietà di diversi polimeri di origine sintetica e naturale sono stati utilizzati per creare fibre elettrofilate per le diverse applicazioni di ingegneria biomedica ^4. Recentemente vi è stata in crescita inTERESSE nello sviluppo di nanofibre compositi miscelando sintetiche e polimeri naturali ^4. In queste composizioni i prodotti finali tipicamente ereditano la resistenza meccanica associata con il polimero sintetico pur adottando spunti e proprietà biologiche dal polimero naturale.

In questo esperimento, PCL e cheratina sono presentati come i polimeri sintetici e naturali da utilizzare per la sintesi di un nanofibre composito. Cheratina è un polimero naturale che si trova nei capelli, lana e unghie. Esso contiene molti residui amminoacidici; Di notevole interesse è la cisteina ^4,5. Idealmente un polimero naturale sarebbe biorenewable, biocompatibile e biodegradabile. Cheratina possiede tutte e tre queste caratteristiche ma anche di migliorare la proliferazione cellulare e l'attaccamento ai biomateriali è stato incorporato in ^6.

Policaprolattone (PCL) è un polimero riassorbibile, sintetica che è significativo iningegneria dei tessuti ^4. Questo polimero è stato precedentemente apprezzato per la sua stabilità strutturale e meccanica, tuttavia, manca affinità cellulare e presenta una velocità di degradazione lunga. La natura idrofoba di PCL è probabilmente responsabile per la mancanza di affinità cellule ^7. Tuttavia, PCL compensa suoi limiti essendo altamente miscibile con altri polimeri. A PCL / composito cheratina dovrebbe dimostrare le proprietà meccaniche del PCL e incorporare le proprietà biologiche di cheratina, lo rende la scelta ideale per varie applicazioni biomediche.

Protocollo

Tutti protocollo segue le linee guida del North Carolina A & T State University Office of Compliance Research ed etica.

1. preparazione chimica per la cheratina estrazione ⁴

1. Per preparare 1.000 ml di 2% peso / volume soluzione di acido peracetico (PAS), sotto una cappa aspirante aggiungere 20 ml di acido peracetico a 980 ml di acqua deionizzata (DI).
2. Per preparare 1.000 ml di soluzione di base 100 mM Tris (TBS), aggiungere 12,2 g di Tris Base a 1.000 ml di acqua deionizzata e mescolare fino a completa dissoluzione.
3. Preparare la soluzione diluita di acido cloridrico (DHAS) in una cappa aspirante versando 4 ml di acido cloridrico concentrato in 30 ml di acqua deionizzata.
4. Procurarsi circa 20 g di ritagli di capelli umani che non sono stati trattati chimicamente o alterati. I capelli possono essere di qualsiasi lunghezza.
5. Lavare completamente i capelli, a mano, con acqua calda e sapone. Utilizzare acqua deionizzata (DI) per il risciacquo finale.
6. Mettere i capelli in due 600 ml bicchieri e posto in un 80 ° C oven per 1 ora.
7. Scolate il liquido dal fondo del bicchiere e posizionare in forno finché i capelli è completamente asciutto.
8. Divide asciugato i capelli in modo uniforme tra i 600 ml bicchieri, mettendo 10 g di capelli in ogni bicchiere. Non consentire i capelli per riempire più di 500 ml.
9. Versare 500 ml di PAS in ciascun bicchiere facendo attenzione a coprire tutti i capelli. Coprire i bicchieri con parafilm e conservare per 12 ore.

2. Preparazione di cheratina Estratto Solution

1. Separare i capelli dal PAS usando un setaccio da 500 micron. Raccogliere il PAS rifiuti in un contenitore separato. Lavare i capelli accuratamente con acqua deionizzata per eliminare ogni residuo PAS.
2. Posizionare i capelli risciacquati in un pallone da 500 ml. Versare 400 ml di TBS nel pallone, facendo in modo che i capelli sono coperti. Posto pallone in un bagno di agitazione impostato a 38 ° C, 65 giri al minuto per 1 ora.
3. Dopo 1 ora, togliere dal scuotendo bagno e versare il liquido, circa 400 ml di soluzione di estrazione di cheratina (KES), into un bicchiere da 1.000 ml.
4. Versare 400 ml di acqua deionizzata nel pallone contenente i capelli in modo che i capelli sono coperti e posto di nuovo nel bagno agitazione per 1 ora. Togliere il pallone dal bagno agitazione e versare i restanti 400 ml di KES nel becher 1.000 ml con il KES raccolti in precedenza. I capelli non è più necessario e può essere scaricato dal pallone e scartato nel recipiente cestino più vicino.

3. La concentrazione di cheratina Estratto Solution

1. Riempire il bagno rotodistiller alla linea superiore con acqua distillata e impostare a 90 ° C. Impostare velocità di rotazione di 200 rpm. Accendere il liquido di raffreddamento chiller-pompa e impostare a -10 ° C.
2. Usando un misuratore di pH per controllare il pH della KES, utilizzare una pipetta per aggiungere lentamente 1 mM DHAS al KES fino a raggiungere un pH 7,0. Mescolare lentamente mentre si aggiunge la soluzione.
3. Versare il KES neutralizzato nelle 500 ml pallone a base tonda fino circa un quarto pieno. Eseguire il distillatore secondo il fornitore diprotocollo per 1,25 ore.
   1. Ripetere il punto 3.3 fino a quando tutto il KES è stato distillato. Assicurarsi che il pallone viene collegato strettamente.

4. Dialisi di cheratina Estratto Solution

1. Versare soluzione KES equamente in 12 tubi coniche 14 ml separati. Centrifugare le provette a 1.050 g per 10 min.
2. Versare il KES centrifugato in un bicchiere pulito, avendo cura di versare via dai detriti raccolti. Ripetere finché tutti i KES è stato centrifugato.
3. Riempire un 2.000 ml cilindro graduato con acqua deionizzata.
4. Tagliare dialisi membrana tubo cellulosa a 24 pollici, e la clip un'estremità del tubo per tenerlo chiuso.
5. Immergere la lunghezza del tubo nel cilindro di acqua deionizzata per rendere più flessibile e più facile da aprire.
6. Aprire l'estremità non tagliata della membrana di cellulosa tubo di dialisi e versare lentamente 60 ml di soluzione KES centrifugato nel tubo. Utilizzare un altro clip per chiudere questa estremità del tubo.
7. Mettere il ditubo ALISI nel cilindro 2.000 ml di acqua deionizzata e lasciare riposare per 24 h. Cambiare l'acqua deionizzata nel cilindro ogni 3 o 4 ore.
8. Dopo il periodo di 24 ore, svuotare la soluzione KES dializzata in vasetti innevate, avendo cura di lasciare spazio nella parte superiore e mettere in freezer a -20 ° C per 24 ore.

5. liofilizzazione di cheratina Estratto Solution

1. Impostare il liofilizzatore a -86 ° C.
2. Togliere i vasetti contenenti KES congelato dal congelatore, prendere i tappi fuori dei vasi, e metterli in fiale liofilizzatore. Mettere i sigilli sulle fiale e ruotare la manopola per creare una pressione di vuoto di 0,133 mbar. Lyophilize i campioni per circa 48 ore, fino a quando tutta l'umidità è andato.

6. Preparazione di electrospinning Solutions (10% in peso cheratina Solution)

1. Rimuovere la polvere cheratina dalla liofilizzatore e si pesa.
2. Aggiungere acqua deionizzata alla polvere cheratina per creare un 10% peso / pesosoluzione cheratina.

7. Preparazione del 10% in peso PCL Soluzione

1. Ottenere PCL (polimero ε-caprolattone, Mn 70 - 90 kDa), e trifluoroetanolo (TFE). Preparare un 10% in peso PCL in TFE agitando O / N e ottenere una miscela omogenea.

8. Preparazione della soluzione cheratina / PCL

1. Ottenere la soluzione PCL 10% in peso precedentemente preparato e il 10% in peso soluzione cheratina. Aggiungere cheratina nella soluzione goccia PCL saggia per creare 10 ml soluzioni cheratina PCL / di 90:10, 80:20, 70:30 e 60:40 ratios.
2. Utilizzare un vortex per ottenere una miscela omogenea di soluzione PCL / cheratina prima electrospinning.

9. Produzione di elettrofilate PCL / fibra cheratina

1. Posizionare circa 8 ml della / soluzione cheratina PCL in una siringa monouso da 10 ml dotato di un tubo di plastica del diametro di 0,5 mm. Posizionare la siringa in una pompa a siringa in cui la portata è impostato per essere di 2,5 ml / hr.
2. Applicare tensione alla punta dell'ago collegata al tubo (posizionato ~ 23 cm dalla fibra raccolta tamburo, e ~ 30 gradi rispetto all'orizzontale). Applicare un 19 - tensione kV 22 al tubo e ruotare il tamburo collettore a circa 200 rpm.
   1. Avvolgere il tamburo collettore con un foglio di alluminio prima di eseguire l'esempio. Assicurarsi che il foglio di alluminio è stabile applicando il nastro con etichette su entrambe le estremità.
      Nota: Le fibre formeranno sul foglio di alluminio (vedere Figura 2), memorizzare il foglio rivestito fibra alla RT.

10. Analisi meccanica di PCL / cheratina Nanofibre

1. Tagliare il campione in 60 millimetri da 8 mm. Assicurarsi di registrare lo spessore utilizzando micrometrica digitale. Per ogni composizione preparato, utilizzare cinque campioni.
2. Fissare il campione di 60 x 8 mm nel tester di trazione. Usare un supporto esemplare personalizzato progettato per attaccare il campione. Sandwich il campione tra i titolari dei campioni che è fatto da una scheda con doppionastro biadesivo. Applicare la cella 10 N carico con una velocità di spostamento di 10 mm / min.
   Nota: Il titolare campione è stato progettato per di 62 mm per 40 mm con una finestra interna di 50 mm per 38 mm.
3. Record estensione e valori di carico attraverso il software in base al protocollo del software.
4. Calcolare lo stress dividendo la forza per area del campione testato. Successivamente, calcolare ceppo dividendo la variazione di lunghezza per lunghezza iniziale.
5. Generare la curva sforzo-deformazione riportando lo stress in asse y per il valore corrispondente ceppo in asse x.
6. Calcolare il modulo di Young della regione lineare dove pendenza pari al modulo di elasticità. Determinare resistenza alla trazione dalla trama ceppo di stress prendendo offset ceppo 0,2% e tracciando una linea parallela alla curva regione lineare.
7. Eseguire l'analisi statistica dei dati meccanici ottenuti in triplice copia in precedenza utilizzando analisi della varianza ad una via utilizzando il software di analisi ^8. Valori di p <0.05 siamori considerato statisticamente significativo.

11. Superficie Morfologia e strutturale Caratterizzazione

1. Utilizzare microscopio elettronico a scansione (SEM) con i parametri di tensione di accelerazione di 15 kV e la corrente di 5 μA per osservare la morfologia delle fibre elettrofilate.
   1. Prima di imaging con SEM, tagliare una sezione ² di 2 cm di fibra e collegarlo a una fase di SEM utilizzando nastro di rame. Posizionare il palco all'interno del dispositivo a induzione polverizzazione e il cappotto con l'oro a 15 mA per 1 min e 30 sec per creare uno strato d'oro di circa 11 nm di spessore. Caricare il campione nella camera del SEM. Osservare i campioni di fibre.
2. Utilizzare trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FTIR) caratterizzare il legame chimico tra il PCL e cheratina. Posizionare la sezione 2 ^cm 2 della membrana elettrofilate nanofibre in un supporto magnetico e spurgare il sistema con aria secca prima del test. Ottenere spettri per 200 scansioni e analizzare gli spettri utilizzando STAsoftware ndard secondo il protocollo del software.
3. Eseguire l'analisi dello spettro usando software standard e utilizzare triplicati di ogni rapporto di nanofibre secondo il protocollo del produttore.

12. Studio di interazione Cell-fibra

1. Tagliare le fibre in 16 mm ² campioni. Utilizzare un collante biocompatibile a base di silicone per fissare ogni campione di vetrini con un diametro di 12 mm.
2. Colla un'estremità del campione fibra al retro del vetrino, avvolgere il campione intorno coprioggetti, poi incollare l'estremità libera del campione al retro del vetrino e, lasciando all'inizio della slittamento coperto con il solo campione di fibra.
3. Mettere i campioni di fibre in una piastra da 24 pozzetti. Sterilizzare i campioni immergendo in 80% etanolo per 1 ora.
4. Risciacquare l'etanolo dai campioni utilizzando acqua deionizzata. Poi, pipetta 2 ml di terreno di base sui campioni, facendo attenzione a coprire l'intero campione. Rimuovere il supporto dopo 5 min.
5. Uso dei fibroblasti 3cellule T3 per seminare i campioni di fibre. Sospendere le cellule in terreno Dulbecco modificato Eagle (DMEM) supplementato con antibiotici e siero fetale bovino 10% (FBS) in modo che ci sono circa 62.000 cellule / cm ² per 1 ml di DMEM.
6. Goccia 1 ml della soluzione di cellule contenente 3T3 DMEM in ciascun piatto ben garantire che ogni campione fibra è coperto con circa 62.000 cellule / cm ^2. Incubare le oltre piastre per 24 ore a 37 ° C e 5% CO _2. Nota: Uso 5% CO ₂ perché questo livello può di solito mantenere il pH del supporto cella range fisiologico per giorni.

13. La degradazione di nanofibre Matrix

1. Cut asciugato PCL / membrane nanofibre di cheratina in piazza di 30 mm x 30 mm.
2. Sterilizzare i campioni di 900 ^mm 2 con 80% di alcol per un periodo di incubazione di 10 minuti e lavare accuratamente con acqua deionizzata. Incubare i campioni in 15 ml di PBS, pH 7,5, a 37 ° C. Sostituire il buffer ogni 3 giorni.
3. Prendere le membrane dalla soluzione a intervalli specifici, 1 settimana e 7 settimane, e risciacquare con acqua deionizzata.
4. Posizionare i campioni di membrana in fiale liofilizzatore. Mettere i sigilli sulle fiale e ruotare la manopola per creare un vuoto. Liofilizzato per 24 ore, fino a completa asciugatura.
5. Fissare il campione essiccato ad una fase di SEM utilizzando nastro di rame. Posizionare il palco all'interno del dispositivo a induzione polverizzazione e il cappotto con l'oro a 15 mA per 1 min e 30 sec.
6. Caricare il campione nella camera del SEM. Osservare i campioni di fibre ad una tensione di accelerazione di 1,5 kV e 5 μA di corrente.

Risultati

fibra Morfologia
immagini SEM delle fibre sono stati ottenuti per tutte le composizioni di fibre. Vedere Figura 3. Immagine Fiber conferma che le fibre sono orientate in modo casuale.

prove meccaniche
Meccanicamente fibre forti sono generalmente richiesti per varie applicazioni di ingegneria tissutale. Queste fibre dovrebbero conservare la forza sufficie...

Discussione

Estrazione di cheratina da capelli umani è stato raggiunto con successo. L'acido peracetico agito come agente ossidante sui capelli umani, permettendo la cheratina da estrarre dal Tris Base. La produzione di polvere di cheratina era piccola scala a causa del fatto che è stato fatto soltanto per scopi di ricerca. Questa procedura è già stato stabilito nel settore per la produzione su larga scala. Lo scopo di estrarre la cheratina su piccola scala è stato quello di controllare la contaminazione, la variabilità d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Hair			Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% crystalline
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning electron microscope	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series	AGS-X Series	Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD)	Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test	SigmaPlot 12 software