基于角蛋白纳米纤维生物医学工程合成

摘要

纳米纤维具有高的表面积与重量比，优异的机械完整性，并支持细胞生长和增殖。这些纳米纤维具有广泛的生物医学应用。在这里，我们制造角蛋白/ PCL纳米纤维，利用静电纺丝技术，和表征纤维用于组织工程可能的应用。

摘要

静电纺丝，由于它的多功能性和潜在的在各个领域的应用中，被频繁用于制造纳米纤维。这些多孔纳米纤维的生产是非常感兴趣的，由于其独特的物理化学性质。在这里，我们阐述含有聚（ε -己内酯）角蛋白（PCL）纳米纤维（即，PCL /角蛋白复合纤维）的制造。水溶性角蛋白首次从人类头发萃取，用不同比例的PCL混合。 PCL /角蛋白的混合溶液转化成用实验室设计的静电设立纳米纤维膜。纤维形态，将得到的纳米纤维的机械性能进行了观察和使用扫描电子显微镜和拉伸试验机进行测定。此外，纳米纤维的降解和化学性质用FTIR分析。 SEM图像显示，对于不同的组合物的PCL /角蛋白纤维均匀的表面形貌。这些PCL / keratiÑ​​纤维也表现出优异的机械性能如杨氏模量与故障点。成纤维细胞能够附着并增殖从而证明良好的细胞生存力。根据上面讨论的特征，我们可以强烈认为天然和合成聚合物的共混纳米纤维可以表示可用于不同的生物医学应用的复合材料的优异的发展。

引言

电纺丝是公认的实现聚合物纳米纤维的一种普遍方法。该纤维可以在纳米级来制备和纤维的性能定制^1。这些发展和纳米纤维的特性一直是他们在生物医学工程应用中特别有趣尤其是在组织工程。所述纳米纤维具有相似的细胞外基质，从而促进细胞粘附，迁移和增殖^2。由于这种相似的胞外基质（ECM），电纺纤维可以用作材料，以协助在伤口敷料，药物递送，以及用于工程组织如肝，骨，心脏，肌肉^3。

各种合成和天然来源的不同聚合物已被用于创建不同的生物医学工程应用⁴静电纤维。近来，在不断增长terest在复合纳米纤维的发展通过混合合成的和天然的聚合物^4。在这些组合物的最终产品通常继承与合成聚合物结合的同时还采用生物线索和性质与天然聚合物的机械强度。

在该实验中，PCL和角蛋白被表示为要使用的复合纳米纤维的合成的合成和天然聚合物。角蛋白是在毛发，羊毛和指甲发现天然聚合物。它包含了许多氨基酸残基;值得注意的兴趣是半胱氨酸^4,5。理想的是天然存在的聚合物是生物可再生的，生物相容和可生物降解的。角蛋白具有所有这三种特性，同时也增强细胞增殖和附着到它已在⁶被纳入的生物材料。

聚己内酯（PCL）是一个可再吸收的，合成的聚合物，在显著组织工程^4。这种聚合物先前已经称赞其结构和机械稳定性，但是，它缺乏细胞亲和力并呈现一个冗长的降解速率。 PCL的疏水性质为缺乏细胞亲和性⁷的可能负责。然而，PCL由是与其他聚合物高度混溶弥补了其局限性。一个PCL /角蛋白复合应当证明PCL的力学性能，并纳入角蛋白的生物特性，使其成为各种生物医学应用的理想选择。

研究方案

所有协议遵循研究合规与道德的北卡罗莱纳州A＆T州立大学办公室的指导方针。

1.化学制备角蛋白提取⁴

1. 为了制备1,000ml中2％重量/体积的过乙酸溶液（PAS），在通风橱下20毫升过乙酸加至980毫升去离子（DI）水的。
2. 为了制备1,000ml中的100mM Tris碱溶液（TBS）中，添加12.2克Tris碱的达1,000ml去离子水，搅拌至完全溶解。
3. 通过倾倒4ml浓盐酸于30ml DI水中制备在通风橱稀盐酸溶液（DHAS）。
4. 采购大约20g还没有经过化学处理或改变人的头发丝的剪报。头发可以是任意长度。
5. 彻底清洗头发，用手，用温水和肥皂。使用去离子（DI）水进行最后冲洗。
6. 把头发分成2台60毫升的烧杯中，并发生在80ºCØVEN 1小时。
7. 从烧杯底部排出的液体和放回烘箱直到头发完全干燥。
8. 鸿沟干头发均匀地600毫升的烧杯之间，将将10克发到每个烧杯中。不要让头发充满超过500毫升。
9. 倒入500毫升PAS到每个烧杯中并确保覆盖所有的头发。用封口膜封住并存储12小时的烧杯。

2.角蛋白提取液的制备

1. 使用500微米筛子分离PAS头发。收集废物的PAS在一个单独的容器中。用去离子水彻底冲洗头发，以消除任何剩余的PAS。
2. 放置在一个500ml烧瓶中的漂洗毛发。倾400毫升的TBS到烧瓶中，确保毛发被覆盖。在设置为38ºC，65转1小时的惊天洗澡的地方瓶。
3. 1小时后，从振荡浴中移除，并倒入液体，约400毫升角蛋白提取液（KES），我n要的1000ml烧杯中。
4. 倾400毫升DI水到含有头发确保毛发被覆盖并放回振荡浴1小时烧瓶中。从晃动浴中取出烧瓶，并倒入剩余的将400ml KES入1000毫升烧杯中与先前收集的KES。头发不再需要并且可以倾倒出瓶中的并丢弃在最近的垃圾容器。

3.角蛋白提取液浓度

1. 填写rotodistiller浴用蒸馏水顶线，并设置到90℃。设置旋转速度至200转。打开冷却剂冷却器泵和设置为-10ºC。
2. 使用pH计来监视KES的pH值，用移液管至1mM DHAS慢慢添加到KES直到达到pH为7.0。慢慢搅拌的溶液中。
3. 倾中和的KES到500毫升的圆底烧瓶中直到大约四分之一满。根据制造商的运行蒸馏协议1.25小时。
   1. 重复步骤3.3直到所有KES已经蒸馏。确保将烧瓶紧紧相连。

4.透析角蛋白提取液的

1. 倒入KES解决方案均分为12个独立14毫升锥形管。离心试管在1050×g离心10分钟。
2. 倒入离心KES到一个干净的烧杯中，并确保从收集的碎片倒掉。重复，直到所有的KES已经离心。
3. 填写2,000量筒用去离子水。
4. 切透析管纤维素膜到24英寸，和夹管的一端保持它关闭。
5. 浸管的长度DI水在汽缸中，以使之更柔软和更容易打开。
6. 打开透析管纤维素膜的非限幅端和慢慢倒入60毫升离心KES溶液进入管。使用另一个剪辑关闭管道的这一端。
7. 把迪所述2000毫升气缸DI水在alysis管并允许放置24小时。改变DI水在气缸中，每3至4小时。
8. 24小时周期之后，清空透析KES溶液放入加盖罐子，应确保在-20℃离开顶部和地点空间在冷冻24小时。

5.角蛋白提取液冻干

1. 冻干机设置为-86ºC。
2. 拆下冰箱冷冻含有KES罐子，把帽子脱罐子，并把它们放入冻干机安瓿。广场上的安瓿的密封和转动旋钮创造的0.133毫巴的真空压力。冻干样品约48小时，直到所有的水分已经一去不复返了。

6.准备静电解决方案（10％重量角蛋白溶液）

1. 从冻干机中取出角蛋白粉和称重。
2. DI水添加到角蛋白粉末以创建10％重量/重量角蛋白的解决方案。

7.准备10％的重量PCL解决方案

1. 得到的PCL（ε - 己内酯的聚合物，锰70 - 90 kDa的），和三氟乙醇（TFE）。通过搅拌O / N中的TFE重量的PCL制备10％，将获得均匀的混合物。

8.制备角蛋白/ PCL解决方案

1. 获得预先制备的10％（重量）的PCL溶液和10％（重量）角蛋白溶液。添加角蛋白进入PCL溶液滴在以创造10毫升PCL / 90:10，80:20，70:30角蛋白溶液，和60:40比率明智的。
2. 用涡流混合器静电之前获得的PCL /角蛋白溶液均匀的混合物。

9.生产静电纺丝的PCL /角质纤维

1. 放置约8毫升的PCL /角蛋白溶液在装有0.5毫米直径的塑料管10ml的一次性注射器。放置注射器在将流速设定为2.5毫升/小时的注射器泵。
2. 应用电压到连接至所述管的针尖（定位从纤维收集鼓〜23厘米和〜从水平30度）。套用19 - 22千伏电压到管，并在约200转旋转滚筒收藏家。
   1. 运行示例之前包裹铝箔收集桶。确保该铝箔是通过将标签带在任一端是稳定的。
      注:纤维将形成在铝箔上（ 见图 2）中，纤维覆盖箔储存于RT。

10. PCL /角质纳米纤维的力学分析

1. 8 mm切割样品成60个毫米。确保通过使用数字千分尺来记录厚度。对于准备各组成，使用五个样本。
2. 附着在拉伸试验机的60×8毫米的样本。使用自定义设计的试样架附加的样本。夹着它是从一个索引卡片使用双制成样品支架之间的样本双面胶带。以10毫米/分钟的位移速率施加10N的测力传感器。
   注:样品保持器被设计为有62个毫米乘40毫米，38毫米50mm的内窗。
3. 记录延伸，通过软件根据软件协议的负载值。
4. 通过测试的样品的区域分割的力计算应力。接着，除以初始长度的长度变化计算应变。
5. 产生由在y轴为x轴对应应变值绘制应力的应力 - 应变曲线。
6. 从那里斜率等于弹性模量线性区域计算杨氏模量。通过取0.2％应变偏移和绘制平行线到线性域的曲线确定从应力应变图抗拉强度。
7. 以前使用分析软件使用⁸单因素方差分析方法进行一式三份获得的机械数据的统计分析，P值均<0.05，我们再有统计学显著。

11.表面形貌和结构表征

1. 使用具有加速15千伏的电压和5微安的电流来观察电纺丝纤维的形态的参数扫描电子显微镜（SEM）。
   1. 用SEM来成像之前，切纤维2厘米²段和使用铜带将其连接到一个SEM阶段。放置溅射镀膜机和涂层用金内部的阶段在15mA进行1分30秒的创建的金层大约11纳米厚。加载样品到SEM的腔室。观察纤维样品。
2. 使用傅立叶变换红外光谱（FTIR）来表征PCL和角蛋白之间的化学结合。放置静电纳米纤维膜的2 ^平方厘米部分中的磁夹持器和测试之前吹扫 ​​用干燥空气的系统。获取光谱200扫描和使用STA分析光谱根据软件协议ndard软件。
3. 使用标准的软件进行频谱分析，并使用根据制造商的方案的纳米纤维的各个比率的一式三份。

12.细胞纤维相互作用研究

1. 切纤维为16 ^平方毫米的样品。使用生物相容的，硅氧烷基胶固定每个样本盖玻片用直径为12毫米。
2. 胶纤维样品到盖玻片的背面的一端，环绕盖玻片样品，然后粘上样品到盖玻片的背面的自由端，以及，留下覆盖有仅滑移的顶纤维样品。
3. 放置纤维样品在24孔板中。通过在80％乙醇中浸渍1小时灭菌样品。
4. 冲洗使用去离子水样品中的乙醇。然后，加入2 ml基础培养基上的样品中，并确保以覆盖整个样品。 5分钟后删除网上平台。
5. 使用3成纤维细胞T3细胞种子的纤维样品。暂停补充有抗生素和10％胎牛血清（FBS），以便在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）的细胞有大约62000个细胞/ ^cm 2的每1ml DMEM中。
6. 滴将1ml 3T3含细胞的DMEM溶液到每个孔板确保每个纤维样品覆盖有大约62000个细胞/ ^cm 2以下。孵育孔板在37℃下24小时和5％ _的 CO 2。注意:使用5％的CO _2，因为该水平通常可以保持细胞媒体在生理范围的pH值天。

13.降解纳米纤维矩阵

1. 切干PCL /纳米纤维角蛋白膜成方形约30mm×30毫米。
2. 消毒900 ^平方毫米的样品用80％酒精10分钟的潜伏期和去离子水彻底清洗。孵育样品在15毫升PBS中，pH为7.5的，在37ºC。更换BUFFER每3天。
3. 取该膜从溶液中在指定的时间间隔，1周和7周，并用DI水冲洗。
4. 将膜样品进入冻干机安瓿。放置在安瓿的密封和转动旋钮以产生真空。冻干24小时，直至完全干燥。
5. 在干燥的样品将其连接到用铜带的SEM阶段。放置溅射镀膜机和涂层用金内部的阶段在15mA进行1分30秒的。
6. 加载样品到SEM的腔室。在1.5千伏和5微安的电流的加速电压观察纤维样品。

结果

纤维形态
对于所有的纤维组合物得到的纤维的SEM图像。 参见图3。纤维图像证实了纤维被随机取向。

机械测试
机械强度高的纤维一般需要关于各种组织工程应用。这些纤维应保留一定的压力和环境条件⁹下足够的强度和柔韧性。通常，支架被期望具有接近目标组?...

讨论

从人发角蛋白的提取成功实现。过乙酸充当对人类的头发氧化剂，允许由Tris碱中提取的角蛋白。生产角蛋白粉的是小规模，由于这样的事实，它为研究目的才被完成。这个程序已经建立在工业的大规模生产。提取的小规模角蛋白的目的是，以控制污染，批次变异性，和成本效益。

角蛋白提取是这个过程的限速步骤。角蛋白粉末的产率是很低的，0.7 - 2％。人的头发丝20克产?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Hair			Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% crystalline
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning electron microscope	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series	AGS-X Series	Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD)	Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test	SigmaPlot 12 software