تعظيم الاستفادة من الفحص الجرح خدش للكشف عن تغيرات في الفئران الوسيطة اللحمية الهجرة الخلية بعد الأضرار التي كتبها القابلة للذوبان استخراج دخان السجائر

Summary

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Abstract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Introduction

الهجرة الخلية منسقة للغاية وحيوية لكثير من العمليات الفسيولوجية مثل تطوير الأنسجة، وإصلاح، وتجديد، وكذلك العمليات المرضية مثل ورم خبيث من السرطان وتصلب الشرايين ^1. فهم هجرة الخلايا أهمية خاصة بالنسبة إلى العلاجات الناشئة تستخدم لإصلاح الأنسجة التالفة وعلاج الحالات المرضية، بما في ذلك تكنولوجيات زرع الخلايا والأنسجة الاصطناعية التطعيم ^2. ونظرا للاهتمام الحالية في دور الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) في التوسط في إصلاح الأنسجة ^3، قياس القدرة المهاجرة من هذه الخلايا باستخدام الفحص التي هي قابلة للقياس بدقة، قابلة للتكيف، وفعالة من حيث التكلفة والفائدة. الأهم من ذلك، يجب أن يكون مثل هذا الفحص حساس بما فيه الكفاية للكشف عن التغييرات الطفيفة نسبيا في قدرة المهاجرة الخلوية بعد الضرر. الأساليب الحالية لقياس الهجرة الخلية، بما في ذلك فحوصات الصفر، المقايسات الهجرة غير المشبعة جيدا (بويدن الفصلالكهرمانات)، صفائف micropillar، والمقايسات منطقة الحظر الخلية تمتلك مجموعة من القيود في التكاثر، والتفصيل، الكمي، وفعالية التكاليف ^1،4،5. مقايسة الصفر الأمثل الموصوفة هنا يوضح نتائج قوية، وقدرات التحليل قابلة للقياس الكمي والصورة القائمة، وفعالية التكاليف، والقدرة على التكيف مع تطبيقات أخرى.

وقد استخدمت المقايسات الصفر في قدرات متعددة لتقييم هجرة الخلايا وانتشارها في ظل ظروف تجريبية مختلفة ^5. الفحص يستلزم بذر خلايا معينة، وتزايد لهم لإكمال أو التقاء القريب، وخدش أحادي الطبقة الناتجة بإبرة معقمة أو طرف الماصة ^6. يتم إجراء تحليل الأكثر شيوعا بمقارنة عرض الصفر على نقاط زمنية متعددة في مواقع مختارة عشوائيا ^7-9. على الرغم من استخدامه بارز، هو مرتبك فحص الصفر التي كتبها القضايا مع استنساخ النوعي والكمي. التباين فيجيل من الصفر لا يغير فقط المكروية من الخلايا، ولكن يمكن أيضا أن تعيق الهجرة الخلية عن طريق إتلاف سطح اللوحة والكامنة خارج الخلية مصفوفة ^5. وتجرى فحوصات في كثير من الأحيان أكثر من 7-12 ساعة، ولكن لخطوط الخلايا التي تظهر الهجرة أبطأ ومرات الفحص أطول، يصبح انتشار والخلط متغير ^7،10. وأخيرا، يمكن للخلايا هرمة الناتجة عن عملية الخدش الافراج عن العوامل التي تتداخل مع إشارات الخلية المطلوبة لسد الفجوة في أحادي الطبقة ^1. الاستفادة المثلى من مقايسة الصفر يتطلب خلق فجوة متسقة لا تتداخل مع خصائص السطح، والتقليل من فحص طول الوقت، ومنع موت الخلايا غير المرغوب فيها خلال التلاعب. مقايسة سدادة مقرها هو الأمثل لفحص منطقة الحظر الخلية. هذا الاختبار يستخدم سدادة توضع في منتصف البئر الذي يستبعد نمو الخلايا، ولكن يسمح الخلايا المراد بالذهب في جميع أنحاء منطقة الحظر المركزية.لتقييم الهجرة، تتم إزالة السدادة، ويوفر منطقة الحظر الناتجة سطح للهجرة إلى أن يحدث. ومع ذلك، هذا الاختبار الصعب تخصيص أو التكيف مع ¹⁰ وبالنسبة لبعض التطبيقات، ويمكن هذا الأسلوب أيضا أن تكلفة باهظة.

وعلى النقيض من المقايسات الصفر ومشتقاتها، المقايسات الهجرة غير المشبعة جيدا (أو بويدن المقايسات الغرفة) تقييم الهجرة عن طريق قياس عدد الخلايا التي تتحرك من غرفة واحدة، من خلال غشاء فلتر الصغيرة التي، في غرفة تحتوي على وكلاء الكيميائي ^{8،11، 12.} هذه التقنية قد فائدة محدودة لالخلايا الملتصقة مثل اللجان الدائمة ليلي الهجرة من خلال غشاء مسامي، وخلايا التمسك الجانب غشاء تتعرض لعوامل الكيميائي، ويمكن أن يكون من الصعب تحديد بدقة. في حين أن الاختبار هو قادرة على دراسة بعض أنماط الهجرة ثلاثية الأبعاد، أنواع الخلايا المقيدة التي أنها قادرة على تحديد بدقة الحد هجرة الخلايا فائدتها ¹⁰. بديل آخر لفحوصات الصفر يستخدم مجموعة الركن الصغير، والذي يقيس الحركة الخلوية من خلال الفضاء ثلاثي الأبعاد باستخدام قدرة الخلايا على تشوه وتهاجر إلى مجموعة كبديل. Polydimethlysiloxane (PDMS) اللدائن الشفاء أكثر من العفن دقيقة وتعامل مع الأوزون وفبرونيكتين تنتج المكروية متجانسة وغير القابلة للتحلل. ويمكن أيضا أن تختلف تباعد الصغرى دعامة حسب الحاجة لقياس قدرة الخلايا على دخول مجموعة ^4. يتم إنشاء قالب من خلال الحفر العميق أيون رد الفعل من رقائق السيليكون لإنشاء نسخة السلبي لارتفاع تبلغ نسبة أبعادها مجموعة ^13. بينما يتعزز فحص من قبل التفصيل في، والقدرة على تصميم نموذج الهجرة ثلاثية الأبعاد، وتحليل من خلال رؤية مباشرة من الخلايا المهاجرة، وصعوبة في خلق المصفوفات الدقيقة عمود تعوق اقتصاديا استخدامه على نطاق واسع.

مقايسة الصفر الأمثل الموصوفة في هذا البروتوكول يوفر كفاءة، كوسفعالية تي طريقة لإنتاج الخدوش تتفق التي يمكن تحليلها باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية. بدلا من قياسات عرض بسيطة مصنوعة عبر نقطة الصفر قبل وبعد الهجرة الخلية، والبرنامج يتيح للمستخدم تحديد مجموع المساحات الصفر قبل وبعد الهجرة. هذا التقدم يحد من قضية محاولة لتحديد مكان نقطة الصفر ينبغي أن تؤخذ القياسات العرض، وإذا كان العرض من نقطة الصفر موحد على طول طول انها. بالإضافة إلى ذلك، ناقش الأمثل دقيق لأعداد الخلايا، التقاء الخلية ونوع ودرجة الأضرار التي لحقت الخلايا من أجل زيادة الاستخدام الأمثل للفحص.

Protocol

ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، وخلايا انسجة الوسيطة الرئة (LR-اللجان الدائمة) من أنسجة الرئة القاصي تم عزل إما على أساس التعبير عنها من علامات سطح الخلية (CD45 ^NEG، CD31 ^NEG، هيئة السلع التموينية، 1 ^عالية، Epcam ^{NEG) 14،15،} وذلك باستخدام النباتى من النمو ^16، أو باستخدام الهضم الأنزيمي ^17. كانت ملتصقة LR-اللجان الدائمة المثقف في DMEM مع ارتفاع نسبة الجلوكوز ولا الجلوتامين، و 15٪ FBS، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري، و 2 ملي الجلوتامين (وسائل الإعلام كاملة من الآن فصاعدا) وحضنت عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2. تم passaged LR-اللجان الدائمة 3-4 مرات للتأكد من مجموعة من الخلايا مع خصائص نمو متجانسة نسبيا لفحص الهجرة.

1. إعداد متموجة واحد رقائق

1. لفصل اللجان الدائمة من الأطباق الثقافة القياسية 100 ملم، وغسل الخلايا مع 10 مل من 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني قبل تحسنت، نضح PBS وإضافة 4 مل من التربسين (0.25٪). احتضان 3-5 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية. نضح جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في أنبوب مخروطي الشكل، إضافة حجم مساو من وسائل الإعلام كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق لتكوير أسفل الخلايا.
   ملاحظة: حضانة أطول في التربسين يمكن أن يغير مستقبلات سطح الخلية وربما يؤثر على الهجرة.
2. وسائل الاعلام نضح والخلايا resuspend في وسائل الإعلام كاملة جديدة. عد الخلايا، باستثناء الخلايا الميتة باستخدام الأزرق الاستبعاد التريبان وصفيحة خلايا انسجة 500،000 الوسيطة في 4 مل من وسائل الإعلام كاملة على 60 مم طبق ثقافة الخلية.
   ملاحظة: اعتمادا على مصدر للخلايا، وقد تكون الاختبارات اللازمة لتحديد العدد الأمثل من الخلايا اللازمة.
3. احتضان الخلايا حتى لوحات هي 90٪ متموجة لمرفق الخلية الأمثل والانتشار، وعادة 48-72 ساعة عن اللجان الدائمة.
   ملاحظة: لا ينصح 100٪ التقاء، لأن العديد من تعتمد على مرسى تثبيط الخلايا تجربة الاتصال، الأمر الذي قد يغير قدرة هجرتها. سوف وحات مع أقل من 80٪ التقاء يؤدي في الصور غير صالحة للاستعمال بسبب برنامج تحليل الصور وتفسير الفجوةالصورة بين الخلايا كجزء من محيط الصفر (انظر الشكل 1D).
4. بعد الخلايا قد وصلت 90٪ التقاء، تلف الخلايا بما يتناسب مع التطبيق. لتقييم تلف الخلايا بعد التعرض للذوبان استخراج دخان السجائر (CSE)، وتوليد 100٪ CSE عن طريق رسم الدخان من 1 جامعة كنتاكي البحوث السجائر (3R4F) من خلال 25 مل من وسائل الإعلام كاملة في قارورة بوشنر أكثر من 2 دقيقة ^18.
5. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 4 مل 1-4٪ CSE مخففة في وسائل الإعلام كاملة. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل الخلايا مرتين مع 4 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة الدافئ، قبل أن يحل محل مع 4 مل وسائل الإعلام كاملة جديدة.
   ملاحظة: إتلاف الخلايا مع تركيزات عالية من استخراج دخان السجائر (> 5٪) قد يقلل إلى حد كبير التقاء.

2. إنشاء خدش

1. في بيئة معقمة، وإزالة الغطاء من 60 ملم لوحة من اللجان الدائمة التالفة، ووضع حافة مستقيمة (على سبيل المثال مسطرة بلاستيكية معقمة) ACروس حافة العلوية للوحة. دون إزالة وسائل الإعلام، واستخدام معقم 200 ميكرولتر طرف الماصة تسترشد معقمة مستقيم الحافة لجعل واحدة إلى أربع الخدوش موازية عبر لوحة ما يقرب من 5 مم وبصرف النظر و 50 مم.
   ملاحظة: A حافة مستقيمة يقلل من كمية تعديلات التناوب حاجة إلى لوحة عندما يكون على خشبة المسرح المجهر. ومن الضروري أن الخدوش تظهر عمودية تماما (أو أفقية) على الشاشة. توليد خدوش متعددة على 60 ملم لوحة لا يغير من المكروية في الطريقة التي يؤثر الهجرة الخلية (لا تظهر البيانات)، ولكن قد يكون النظر لأنواع الخلايا الأخرى. لا ينصح استخدام الآبار الصغيرة منذ تقلب الخلايا المتزايد على مقربة من حافة البئر يصبح أكثر وضوحا ويمكن أن تؤثر جيل موحد من الخدوش.
2. نضح في وسائل الاعلام وغسل بلطف لوحات مع 2 مل من وسائل الإعلام كاملة استعد مسبقا لمنع الخلايا من الانضمام إلى مركز للخدش، وإزالة الخلاياالصورة التي تم خففت من الخدش. استبدال 4 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة.
3. باستخدام علامة دائمة العقيمة، وتسمية كل نقطة الصفر 1-4 على الجانب السفلي من لوحة في الموقع الذي لن تتداخل مع تصوير الخدوش.
   ملاحظة: من المهم أن الصور من نفس نقطة الصفر تتم مقارنة قبل وبعد الهجرة، منذ يمكن أن يكون هناك تباين في العرض الصفر.

3. أخذ الصور الأولية للخدش

ملاحظة: إذا تم إجراء الفحص الصفر على لوحات متعددة، فمن المستحسن أن يتم أخذ الصور الأولية لجميع خدوش على لوحة واحدة قبل أن يتم بعمل خدوش على لوحة القادمة.

1. استخدام المرحلة المجهر النقيض المقلوب مع كاميرا لتوليد الصور اللازمة للتحليل.
2. وضع لوحة الثقافة على المجهر، واستخدام الهدف منخفضة الطاقة (10X) لتحديد موقع نقطة الصفر # 1. إذا التكثيف على غطاء لوحة الثقافة يعوق وايماج اضح (ه) من الخلايا، استخدام مجموعة مرحلة ساخنة إلى 37 درجة مئوية.
3. الحفاظ على الصفر أفقي تماما ومركز مجال الرؤية، الحصول على العديد من الصور حسب الضرورة ليشمل 90٪ من طول الصفر ل. الحصول على صور من أجزاء متميزة من نقطة الصفر مع أي تداخل بين الصور.
   ملاحظة: انكسار الضوء على حواف الطبق الثقافة overexposes الصور، مما يجعلها مستحيلة لتحليلها. لذلك، لا تأخذ الصور من الاول والاخير 5٪ من طول الصفر ل.
4. حفظ الصور من كل نقطة الصفر في مجلد منفصل.
5. كرر الخطوات من 3،2-3،4 لخدوش 2 و 3 و 4.
6. العودة إلى لوحات الحاضنة مباشرة بعد التصوير الأولي. السماح تهاجر الخلايا لل7/4 ساعة.
   ملاحظة: 7 ساعة هو الأمثل عند تقييم اللجان الدائمة التالفة مع CSE. احتضان الخلايا لمدة تزيد عن 7 ساعات غير مستحسن بسبب تكاثر الخلايا يمكن أن تكون بمثابة متغير الخلط للهجرة الخلايا (انظر اختياري ملاحظة 8.2 أدناه).

الطبقة = "jove_title"> 4. تحليل الأولية خدش الصور

1. تحميل يماغيج وتثبيت الجرح أداة شفاء المساعد (يرجى الرجوع إلى جدول المواد / المعدات).
2. فتح ملف الصورة في يماغيج، ثم انقر فوق "عملية" و "البحث عن الحواف" لتسليط الضوء على الخلايا المحيطة الصفر لأداة شفاء الجروح لحساب مساحة الصفر (الشكل 2B). التالي، انقر فوق "صورة"، "ضبط"، "اللون عتبة" و في القائمة المنسدلة المسمى "عتبة اللون" تغيير القيمة إلى "B & W".
3. ضمن القائمة "اللون عتبة"، وضبط كل من المتزلجون عتبة سطوع حتى يتحقق النقيض الأمثل بين الصفر وخلية الجبهة. لإتاحة الفرصة لأكبر مجموعة عند محاولة إنشاء التباين في الصورة، حرك شريط التمرير السفلي تماما إلى اليمين (صورة سوداء تماما)، ثم ضبط شريط التمرير الأعلى لتوليد أقصى قدر من التباين.
4. ضبط ببطء بري كبارالمنزلق ghtness من اليسار إلى اليمين حتى تكون الصورة يعرض نظيفة كفاف من الصفر (الشكل 2C). مرة واحدة وقد تم التعرف على حواف الصفر، وانقر على زر "المزيد من أدوات" في شريط الأدوات يماغيج، حدد "MRI_Wound_Healing_Tool" من القائمة المنسدلة، ثم اضغط على زر "م" (الذي سيظهر في شريط الأدوات يماغيج) لتسليط الضوء على منطقة الصفر والإخراج المنطقة المحسوبة في نتائج نافذة المنبثقة (الشكل 2D).
5. نسخ ولصق كل الأرقام من نتائج نافذة (الشكل 2E) إلى جداول اكسل. تأكد من فصل البيانات من الخدوش الفردية.

5. أخذ الصور النهائية للخدش

1. بعد الخلايا هاجر (4-7 ساعة)، كرر الخطوات من 3،2-3،4. صورة لوحات في نفس الترتيب الذي تم خدش بحيث كان الخلايا على كل لوحة وقتا متساويا للهجرة.
   ملاحظة: هذه الخلايا يمكن تصويرها عند نقاط زمنية متعددة، اعتمادا على سينسي بهمالناقلية إلى كل من درجة الحرارة ودرجة الحموضة التغييرات. بدلا من ذلك، يمكن تصوير الخلايا الحية تستخدم لمتابعة الخلايا في الوقت الحقيقي كما تهاجر.

6. تحليل نهائي خدش الصور

1. كرر الخطوات من 4،2-4،5 للصور خدش النهائية.

7. حساب المساحة خدش لقياس الهجرة

1. حساب منطقة ما قبل الهجرة متوسط ​​عن طريق حساب متوسط ​​القيم المنطقة الأولى من الخدوش منها.
2. حساب المبلغ الإجمالي للهجرة عن طريق طرح منطقة الهجرة النهائية لكل صورة، وتحسب في الخطوة رقم 6 من متوسط ​​منطقة ما قبل الهجرة (الخطوة 7.1). إنشاء قائمة من القيم لكل الصفر يمثل التغير في الهجرة.
3. تجميع البيانات من الخدوش متعددة ضمن المجموعة اختبار نفس (أي جميع لوحات وجميع خدوش على الخلايا المعرضة ل0٪ CSE). استخدام تحليل التباين اختبار لتحليل الاختلافات بين المجموعات التجريبية.
4. إذا كانت الخلايا بطيئة للهجرةوتتطلب وقتا أطول الحضانة بعد الخدش (أكبر من 10-12 ساعة)، إجراء BrDU أو EDU التأسيس فحص ¹⁹ لتحديد ما إذا كانت الخلايا تشهد أي انتشار خلال الفترة التي مقايسة الهجرة يحدث. اختيار الهجرة الوقت مقايسة لتجنب تكاثر الخلايا كبيرا.

8. اختياري

1. لتقييم ما إذا كانت الشيخوخة خلية كبيرة ويحدث نتيجة لإجراء الخدش، وإجراء بيتا غالاكتوزيداز فحص المرتبطة الشيخوخة على لوحة اختبار في أوقات محددة سلفا بعد الخدش ^19.

النتائج

وأجريت فحوصات الصفر المقدمة هنا باستخدام خلايا اللحمة المتوسطة انسجة الرئة المقيمين الفئران (LR-اللجان الدائمة) ومعزولة كما المشار إليها في المذكرات البروتوكول. وفاز المصنف LR-اللجان الدائمة في مناطق ذات كثافة من 500،000 الخلايا في 60 ملم صحن زراعة الأنسجة، ونمت إلى 90٪ ال...

Discussion

بروتوكول الموصوفة هنا يوفر، طريقة موحدة قوية من الناحية الكمية لأداء وتحليل فحوصات الصفر. تستخدم المقايسات خدش بسيط روتيني في العديد من مناطق مختلفة من الدراسة لدراسة الهجرة الخلوية. ومع ذلك، عادة فحص الصفر يفتقر إلى موحدة مجموعة المتابعة وتقدير بروتوكول، مما أدى إ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (high glucose, no added glutamine)	Life Technologies	31053-036
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3091002
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SV3007901
Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3003401
TypeLE cell dissociation reagent	Life Technologies	12563-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3002802
Falcon standard 60mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772B
Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips	Fisher Scientific	02-707-502
Inverted light microscope with camera attachment	Variable
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healting plugin	http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistical analysis software	Microsoft Excel