Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel

Resumo

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Resumo

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Introdução

A migração celular é altamente coordenada e vital para muitos processos fisiológicos, tais como desenvolvimento do tecido, reparação e regeneração, bem como processos patológicos tais como a metástase do cancro e arteriosclerose ^1. Uma compreensão da migração celular é particularmente relevante para as terapias emergentes utilizadas para reparar tecidos danificados e tratar condições patológicas, incluindo as tecnologias de transplante de células e tecidos artificial enxerto ^2. Dado o interesse atual no papel de células estromais mesenquimais (MSCs) na mediação de reparação de tecidos ^3, quantificando a capacidade migratória destas células usando um ensaio que é rigorosamente quantificável, adaptável e relação custo-benefício é de interesse. É importante ressaltar que tal ensaio deve ser suficientemente sensível para detectar mudanças relativamente sutis na capacidade migratória celular após dano. Os métodos actuais para quantificar a migração de células, incluindo ensaios de risco, os ensaios de migração trans-poços (CH Boydenâmbares), matrizes micropillar e ensaios zona de exclusão de células possuem uma série de limitações na reprodutibilidade, personalização, quantificação e custo-efetividade ^1,4,5. O ensaio zero otimizado aqui descrito demonstra resultados robustos, capacidade de análise quantificáveis ​​e baseados em imagem, relação custo-eficácia e capacidade de adaptação a outras aplicações.

Os ensaios de raspadinhas têm sido utilizados em várias capacidades para avaliar a migração celular e proliferação em diferentes condições experimentais ^5. O ensaio implica semeando as células designadas, cultivá-las para completar ou próximo da confluência, e coçar a monocamada resultante com uma agulha estéril ou ponta de pipeta ^6. Análise é mais vulgarmente efectuada por comparação da largura do zero ao longo de múltiplos pontos de tempo em locais seleccionados aleatoriamente ^7-9. Apesar de seu uso proeminente, o ensaio do zero é confundida por problemas com a reprodutibilidade e quantificação. A variabilidade nageração de zero a não apenas altera o microambiente das células, mas também pode impedir a migração de células ao danificar a superfície da placa e da matriz extracelular subjacente ^5. Os ensaios são frequentemente realizados ao longo de 7 a 12 h, no entanto, para linhas de células exibindo migração mais lenta e os tempos de ensaio mais longos, a proliferação torna-se uma variável de confusão ^7,10. Por último, as células senescentes gerados pelo processo de coçar pode libertar factores que interferem com a sinalização extracelular necessária para fechar a fenda na monocamada ^1. Optimizar a zero ensaio requer a criação de uma diferença consistente, que não interfere com as propriedades de superfície, minimizando o comprimento de tempo de ensaio, e a prevenção da morte de células indesejáveis ​​durante a manipulação. O ensaio à base de batente consiste numa optimização do ensaio de uma zona de exclusão de células. Este ensaio utiliza uma rolha colocado no meio do poço que exclui o crescimento celular, mas permite que as células a ser revestida em volta da zona de exclusão central.Para avaliar a migração, a tampa é removida, e a zona de exclusão resultante proporciona uma superfície para a migração ocorra. No entanto, este ensaio é difícil para personalizar ou adaptar a ¹⁰ e para algumas aplicações, esta técnica também pode ser um custo proibitivo.

Em contraste com os ensaios de zero e os seus derivados, ensaios de trans-migração bem (ou ensaios de câmara de Boyden) avaliar a migração através da quantificação do número de células que se movem de uma câmara, através de um filtro de membrana microporosa, para uma câmara contendo agentes quimiotácticos ^{8,11, 12.} Esta técnica tem utilidade limitada para as células aderentes como as MSCs porque após a migração através da membrana porosa, as células aderem ao lado da membrana exposta aos agentes quimiotácticos, e pode ser difícil de quantificar com precisão. Enquanto o ensaio é capaz de analisar alguns padrões de migração tridimensionais, os tipos de células restritas para o qual é capaz de quantificar com precisão limite de migração celular sua utilidade ¹⁰. Outra alternativa para ensaios de zero usa uma rede de micro-pilar, que mede a motilidade celular através de um espaço tridimensional utilizando a capacidade das células para se deformar e migram para a matriz como um substituto. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastómeros curados sobre um molde preciso e tratada com ozono e fibronectina produz um microambiente homogénea e não degradável. Espaçamento Micro-pilar também pode ser variado conforme necessário para avaliar a capacidade das células para introduzir a matriz ^4. O molde é criado por meio de gravura de ião reactivo profundo de bolachas de silício para criar uma versão da matriz negativa de alta relação de aspecto ^13. Enquanto o ensaio é reforçada pela sua capacidade de personalização, capacidade de modelar a migração tridimensional, e análise através da visualização direta de células que migram, dificuldade em criar micro-pilar matrizes impede economicamente seu uso generalizado.

O ensaio zero otimizado descrito neste protocolo oferece uma eficiente, cosmétodo t-eficaz para produzir arranhões consistentes que podem ser analisados ​​usando o software disponível gratuitamente. Em vez de medidas de largura simples, feitas em toda a zero antes e depois da migração celular, o software permite ao usuário determinar áreas totais scratch antes e depois da migração. Este avanço limita a questão de tentar determinar onde a zero as medidas de largura devem ser tomadas, e se a largura do zero é uniforme ao longo dela de comprimento. Além disso, a optimização cuidadosa dos números de células, confluência celular e o tipo e grau do dano infligido nas células é discutida, a fim de optimizar ainda mais o ensaio.

Protocolo

Nota: Para este estudo, as células estromais mesenquimatosas do pulmão (LR-MSC) a partir de tecido de pulmão distai foram isoladas, quer com base na sua expressão de marcadores de superfície celular (CD45 ^negativo, CD31 ^negativo, Sca-1 ^elevada, EpCAM ^{neg) 14,15,} usando explante ^{out-crescimento} de 16, ou usando a digestão enzimática ^17. Aderente LR-MSC foram cultivadas em DMEM com glucose elevada e sem glutamina, 15% de FBS, glutamina mM de antibiótico / antimicótico 1x e 2 (meio completo daqui em diante) e incubou-se a 37 ° C, 5% de CO _2. LR-MSC foram passadas 3-4 vezes para assegurar uma população de células com características de crescimento relativamente homogéneas para o ensaio de migração.

1. Preparar uma monocamada confluente

1. Para separar as MSCs a partir de placas de cultura padrão de 100 mm, lavar as células com 10 ml de 37 ° C pré-aquecido PBS, aspirar o PBS e adicionar 4 ml de tripsina (0,25%). Incubar em 3-5 min a 37 ° C incubadora. Aspirar o cells para um tubo cónico, adicionar um volume igual de meio completo e centrifugação a 300 g durante 5 min para sedimentar as células para baixo.
   Nota: de incubação mais longo em tripsina pode alterar os receptores da superfície celular e, potencialmente, afectar a migração.
2. Aspirar media e células ressuspender em meio completo fresco. Contagem de células, excluindo as células mortas usando exclusão com azul de tripano e as células do estroma placa 500.000 mesenquimais em 4 ml de meio completo numa célula de 60 mm de cultura prato.
   Nota: Dependendo da fonte das células, os testes podem ser necessários para determinar o número óptimo de células necessárias.
3. Incubar as células até placas são 90% confluentes para fixação celular ideal e proliferação, normalmente 48-72 horas para MSC.
   Nota: 100% de confluência não é recomendado, uma vez que muitos inibição células experiência de contato dependentes de ancoragem, o que pode alterar a sua capacidade migratória. Placas com menos de 80% de confluência irá resultar em fotos inutilizáveis ​​porque o software de análise de imagem irá interpretar lacunas entre as células como parte do perímetro do zero (veja a Figura 1D).
4. Após as células terem atingido confluência de 90%, danificar as células conforme for apropriado para a aplicação. Para avaliar o dano celular após a exposição à fumaça de cigarro extrato solúvel (CSE), geram 100% CSE, chamando a fumaça de um cigarro Universidade de Kentucky pesquisa (3R4F) através de 25 ml de meio completo em um Kitasato mais de 2 min ^18.
5. Incubam-se as células durante 24 horas em 4 ml de 1-4% de CSE diluído em meio completo. Após incubação, lavam as células duas vezes com 4 ml de PBS estéril quente, antes de substituir com 4 ml de meio completo fresco.
   Nota: danificar as células com alta concentração de extrato de fumaça de cigarro (> 5%) pode reduzir substancialmente confluência.

2. Criação da Raspadinha

1. Em um ambiente estéril, retire a tampa da placa de 60 milímetros de MSCs danificados, e estabelecer uma borda em linha reta (por exemplo, uma régua de plástico esterilizado) acRoss da borda superior da placa. Sem remover a mídia, use um estéril ponta da pipeta 200 mL guiado pelo straight-edge estéril para fazer um a quatro arranhões paralelos em toda a placa aproximadamente 5 milímetros e 50 mm de comprimento.
   Nota: Uma borda reta minimiza a quantidade de ajustes de rotação necessários para a placa quando está no palco microscópio. É imperativo que os arranhões aparecer completamente vertical (ou horizontal) na tela. Gerando múltiplas arranhões em uma placa 60 mm não altera o microambiente de uma forma que afecta a migração de células (dados não mostrados), mas podem ser uma consideração para outros tipos de células. O uso de pequenos poços não é recomendado uma vez que a variabilidade de células crescendo perto da borda do poço se torna mais pronunciada e pode afectar a geração uniforme de arranhões.
2. Aspirar os meios e lava-se suavemente as placas com 2 ml de meio completo pré-aquecido para impedir que as células adiram ao centro do zero, e para remover célulass que foram soltos pelo coçar. Substitua com 4 ml de meio completo fresco.
3. Usando um marcador permanente estéril, etiquetar cada arranhão de 1-4 no lado inferior da placa no local que não interfira com a imagiologia do arranhões.
   Nota: É importante que as imagens do mesmo zero são comparadas antes e após a migração, já que pode haver variação na largura zero.

3. Tendo Imagens iniciais da Raspadinha

Nota: Se o ensaio de zero é efectuada em várias placas, recomenda-se que as imagens iniciais de todos os arranhões em uma única placa são tomadas antes arranhões são feitas na placa seguinte.

1. Usar um microscópio de contraste de fase invertida com uma câmara para gerar as imagens necessárias para análise.
2. Posicione a placa de cultura no microscópio, e use o objectivo de baixa potência (10X) para localizar zero # 1. Se a condensação sobre a tampa da placa de cultura está a impedir uma clara image das células, utilizar um conjunto de fase aquecida a 37 ° C.
3. Mantendo a zero completamente horizontal e no centro do campo de vista, obter o número de imagens necessárias para abranger 90% do comprimento do zero. Obter imagens de partes distintas do zero com nenhuma sobreposição entre as imagens.
   Nota: A refracção da luz nas bordas da placa de cultura superexpõe as imagens, o que os torna impossível de analisar. Portanto, não tirar fotos a partir do primeiro e duram 5% do comprimento do zero.
4. Salve imagens de cada arranhão em uma pasta separada.
5. Repita os passos de 3,2-3,4 para arranhões 2, 3 e 4.
6. Retorno placas para a incubadora imediatamente após a imagem inicial. Deixe as células migram para 4-7 horas.
   Nota: 7 horas é o ideal quando se avalia MSCs danificadas com CSE. A incubação de células durante mais de 7 horas não é recomendada porque a proliferação de células pode actuar como uma variável de confusão durante a migração celular (ver Nota Opcional 8.2 abaixo).

4. Analisando iniciais de raspadinhas Imagens

1. Baixe e instale o ImageJ Ferida plugin de instrumento de cura (consulte a Tabela de Materiais / Equipamentos).
2. Abra o arquivo de imagem em ImageJ, clique em "Processo" e "Find Edges" para destacar as células ao redor do zero para a Ferramenta de cicatrização de feridas para calcular a área de rascunho (Figura 2B). Em seguida, clique em "Imagem", "Ajuste", "Limiar de cores" e no menu dropdown rotulado "Limiar de cores" altere o valor para "B & W".
3. Dentro do menu "Limiar de cores", ajuste ambos os controles deslizantes de nível de luminosidade até um contraste perfeito entre zero e celular frente a é alcançado. Para permitir o maior alcance ao tentar criar contraste na imagem, mova o controle deslizante inferior completamente para a direita (imagem totalmente preta), e em seguida, ajuste o controle deslizante superior para gerar o máximo de contraste.
4. Ajuste lentamente o topo brideslizante lho da esquerda para a direita até que a imagem limpa mostra o contorno do zero (Figura 2C). Uma vez que foram identificadas as bordas do zero, clique em "Mais Ferramentas" na barra de ferramentas ImageJ, selecione "MRI_Wound_Healing_Tool" no menu suspenso, e pressione o botão "m" (que aparecerá na barra de ferramentas ImageJ) para destacar a área de rascunho e saída da área computada em uma janela pop-resultados out (Figura 2D).
5. Copiar e colar todos os números da janela de resultados (Figura 2E) em uma planilha excel. Certifique-se de separar os dados de arranhões individuais.

5. Tendo Imagens Finais da Raspadinha

1. Depois que as células migraram (4-7 hr), repita os passos de 3,2-3,4. Imagem das placas na mesma ordem em que foram riscados de modo que as células em cada placa tiveram o mesmo tempo para migrar.
   Nota: As células podem ser trabalhada em vários pontos de tempo, dependendo da sua sensividade de ambas as mudanças de temperatura e de pH. Alternativamente, imagens de células vivas pode ser usado para seguir as células em tempo real, à medida que migram.

6. Analisando finais de raspadinhas Imagens

1. Repita os passos de 4,2-4,5 para imagens finais zero.

7. Cálculo da área de rascunho para quantificar as Migrações

1. Calcula-se a área média pré-migração calculando a média dos valores dos respectivos riscos iniciais da área.
2. Calcule a quantidade total de migração subtraindo a área de migração final para cada imagem, calculado na etapa 6, a partir da área de pré-migração média (passo 7.1). Gerar uma lista de valores para cada um zero que representa a alteração na migração.
3. Reúnem-se os dados a partir de múltiplos arranhões dentro do mesmo grupo de teste (ou seja, todas as placas e todos os arranhões em células expostas a 0% de CSE). Use um teste de análise de variância para analisar as diferenças entre os grupos experimentais.
4. Se as células são lentos para migrare necessitam de um tempo de incubação mais longo após arranhão (superior a 10-12 h), executar um ensaio de incorporação de BrDU ou EdU ¹⁹ para determinar se as células são submetidos a qualquer proliferação durante o período em que o ensaio de migração está a ocorrer. Escolha um tempo de ensaio de migração para evitar a proliferação celular significativa.

8. Opcional

1. Para avaliar se a senescência celular é significativo que ocorre como resultado do procedimento de coçar, realizar um ensaio de beta-galactosidase associada a senescência em uma placa de ensaio em tempos predeterminados após arranhão ^19.

Resultados

Os ensaios scratch aqui apresentadas foram realizadas utilizando residentes pulmão células estromais mesenquimais murino (LR-MSCs) e isolado como referência nas notas de protocolo. O LR-MSC foram semeadas a uma densidade de 500000 células em 60 mm de cultura de tecidos prato, e cultivadas a 90% de confluência em 48 horas. Para gerar danos, 4% de CSE (descrito acima) foi incubado com as células durante 24 horas após o período de sementeira inicial, mas antes do ensaio zero. Para cada ensaio, o zero foi gerado usa...

Discussão

O protocolo descrito aqui fornece um método quantitativo robusto, padronizado para executar e analisar testes de zero. Ensaios simples arranhão são rotineiramente utilizados em muitas áreas diferentes de estudo para analisar a migração celular. No entanto, tradicionalmente o ensaio zero faltou um set-up e quantificação protocolo padronizado, o que levou a problemas com a reprodutibilidade ^7,10. Muitas das modificações e otimizações para melhorar o ensaio zero reduziram essas questões, incluindo i...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (high glucose, no added glutamine)	Life Technologies	31053-036
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3091002
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SV3007901
Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3003401
TypeLE cell dissociation reagent	Life Technologies	12563-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3002802
Falcon standard 60mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772B
Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips	Fisher Scientific	02-707-502
Inverted light microscope with camera attachment	Variable
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healting plugin	http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistical analysis software	Microsoft Excel