Optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en Murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por Soluble Extracto humo del cigarrillo

Resumen

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Resumen

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Introducción

La migración celular es altamente coordinada y vital para muchos procesos fisiológicos tales como el desarrollo de tejidos, la reparación y la regeneración, así como procesos patológicos tales como la metástasis del cáncer y la arteriosclerosis ^1. Una comprensión de la migración celular es particularmente relevante para las nuevas terapias utilizadas para reparar los tejidos dañados y tratar condiciones patológicas, incluidas las tecnologías de trasplante de células y tejido artificial injerto ^2. Dado el interés actual en el papel de las células estromales mesenquimales (MSC) en la mediación de la reparación de tejidos ^3, la cuantificación de la capacidad migratoria de estas células utilizando un ensayo que es rigurosamente cuantificables, adaptable y rentable es de interés. Es importante destacar que dicho ensayo deberá ser lo suficientemente sensible para detectar cambios relativamente sutiles en la capacidad migratoria celular después del daño. Los métodos actuales para cuantificar la migración de células, incluyendo los ensayos de cero, los ensayos de migración trans-pocillos (Boyden chámbar), matrices microcolumnas, y ensayos de la zona de exclusión de células poseen una serie de limitaciones en la reproducibilidad, personalización, cuantificación, y la rentabilidad ^1,4,5. El ensayo cero optimizado descrito aquí demuestra resultados robustos, capacidades de análisis cuantificables y basados ​​en imágenes, la rentabilidad y la capacidad de adaptación a otras aplicaciones.

Los ensayos de cero se han utilizado en múltiples capacidades para evaluar la migración y la proliferación celular en diferentes condiciones experimentales ^5. El ensayo implica la siembra de las células designadas, el crecimiento de ellos para completar o cerca de confluencia, y arañar la monocapa resultante con una aguja estéril o punta de la pipeta ^6. Análisis es más comúnmente lleva a cabo comparando el ancho de la cero a través de múltiples puntos de tiempo en lugares seleccionados al azar ^7-9. A pesar de su uso prominente, el ensayo cero es confundida por problemas con la reproducibilidad y la cuantificación. La variabilidad engeneración del cero no sólo altera el microambiente de las células, pero también puede impedir la migración de células al dañar la superficie de la placa y la matriz extracelular subyacente ^5. Los ensayos se llevan a cabo con frecuencia más de 7 a 12 horas, sin embargo, para las líneas celulares que muestran la migración más lenta y tiempos de ensayo más largos, la proliferación se convierte en una variable de confusión ^7,10. Por último, las células senescentes generados por el proceso de rascado pueden liberar factores que interfieren con la señalización extracelular requerida para cerrar la brecha en la monocapa ^1. Optimización del ensayo de cero requiere la creación de un vacío constante que no interfiera con las propiedades de superficie, minimizando ensayo de duración de tiempo, y la prevención de la muerte celular no deseada durante la manipulación. El ensayo basado tapón es una optimización de un ensayo de zona de exclusión celular. Este ensayo utiliza un tapón colocado en el centro del pozo que excluye el crecimiento celular, pero permite que las células se sembraron alrededor de la zona de exclusión central.Para evaluar la migración, se quita el tapón, y la zona de exclusión resultante proporciona una superficie para que se produzca la migración. Sin embargo, este ensayo es difícil personalizar o adaptar ¹⁰ y para algunas aplicaciones, esta técnica también puede tener un costo prohibitivo.

En contraste con los ensayos de cero y sus derivados, los ensayos de migración trans-bien (o ensayos de cámara de Boyden) evaluar la migración mediante la cuantificación del número de células que se mueven de una cámara, a través de una membrana de filtro microporoso, en una cámara que contiene agentes quimiotácticos ^{8,11, 12.} Esta técnica tiene una utilidad limitada para las células adherentes como MSCs porque después de la migración a través de la membrana porosa, las células se adhieren a un lado membrana expuesta a los agentes quimiotácticos, y pueden ser difíciles de cuantificar con precisión. Mientras que el ensayo es capaz de examinar algunos patrones de migración en tres dimensiones, los tipos de células restringidas de las que es capaz de cuantificar con precisión el límite de migración celular su utilidad ¹⁰. Otra alternativa a los ensayos de cero utiliza una matriz de micro-pilar, que mide la motilidad celular a través de un espacio tridimensional utilizando la capacidad de las células para deformar y migrar en la matriz como un sustituto. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastómeros curados sobre un molde preciso y tratados con ozono y fibronectina produce un microambiente homogénea y no degradable. Espaciamiento Micro-pilar también se puede variar como sea necesario para medir la capacidad de las células para entrar en la matriz ^4. El molde se crea a través de grabado iónico reactivo profundo de obleas de silicio para crear una versión negativa de la matriz de alta relación de aspecto ^13. Mientras que el ensayo se refuerza por su personalización, capacidad de modelar la migración tridimensional, y el análisis a través de la visualización directa de células que migran, dificultad en la creación de matrices de micro-pilar económicamente impide su uso generalizado.

El ensayo cero optimizado descrito en este protocolo proporciona un eficiente, cosmétodo t-efectiva para producir rasguños consistentes que pueden ser analizados utilizando el software de libre acceso. En lugar de medidas de ancho simples hechas a través del cero antes y después de la migración celular, el software permite al usuario determinar las áreas totales de arañazos antes y después de la migración. Este avance limita el problema de tratar de determinar dónde está el cero las medidas de ancho se deben tomar, y si el ancho de la cero es uniforme a lo largo de su longitud. Además, la optimización cuidadosa del número de células, la confluencia celular y el tipo y grado de daño causado a las células se discute con el fin de optimizar aún más el ensayo.

Protocolo

Nota: Para este estudio, las células estromales mesenquimales de pulmón (LR-MSC) a partir de tejido de pulmón distal fueron aislados ya sea en base a su expresión de marcadores de superficie celular ^(neg CD45, CD31 ^neg, Sca-1 ^alto, EpCAM ^{neg) 14,15,} usando explante fuera el crecimiento ^16, o el uso de la digestión enzimática ^17. Adherente LR-MSCs se cultivaron en DMEM con alta glucosa y sin glutamina, 15% FBS, glutamina mM de antibiótico / antimicótico, y 2 1x (de ahora en adelante medios de comunicación completa) y se incubó a 37 ° C, 5% de CO _2. LR-MSCs se pasaron 3-4 veces para asegurar una población de células con características de crecimiento relativamente homogéneas para el ensayo de migración.

1. Preparación de una monocapa confluente

1. Para separar las MSC de placas de cultivo estándar 100 mm, lavar las células con 10 ml de 37 ° C PBS precalentado, aspirar el PBS y añadir 4 ml de tripsina (0,25%). Incubar 3-5 min en una incubadora a 37ºC. Aspirar el cells en un tubo cónico, añadir un volumen igual de medio completo y se centrifuga a 300 g durante 5 min para sedimentar las células hacia abajo.
   Nota: Longer incubación en tripsina puede alterar los receptores de la superficie celular y potencialmente afectar a la migración.
2. Aspirar los medios de comunicación y Resuspender las células en medio completo fresco. Recuento de células, con exclusión de células muertas usando la exclusión de azul de tripano y la placa células estromales mesenquimales 500.000 en 4 ml de medio completo en un 60 mm placa de cultivo celular.
   Nota: Dependiendo de la fuente de las células, las pruebas pueden ser necesarias para determinar el número óptimo de células necesarias.
3. Se incuban las células hasta que las placas son 90% de confluencia para la fijación celular y la proliferación óptima, por lo general de 48-72 h para MSCs.
   Nota: No se recomienda el 100% de confluencia, ya que muchos de inhibición experiencia células contactos dependiente de anclaje, que puede alterar su capacidad migratoria. Placas con menos de 80% de confluencia se traducirá en fotos inutilizables debido a que el software de análisis de imagen interpretará brechas entre las células que forman parte del perímetro de la cero (ver Figura 1D).
4. Después de que las células han alcanzado 90% de confluencia, dañar las células según sea apropiado para la aplicación. Para evaluar el daño celular después de la exposición al humo del cigarrillo extracto soluble (CSE), generará 100% CSE dibujando el humo de 1 Universidad de Kentucky cigarrillo investigación (3R4F) a través de 25 ml de medio completo en un Kitasato más de 2 min ^18.
5. Se incuban las células durante 24 horas en 4 ml 1.4% CSE diluido en medio completo. Después de la incubación, se lavan las células dos veces con 4 ml de PBS estéril caliente, antes de sustituir con 4 ml de medio completo fresco.
   Nota: Las células Dañar con altas concentraciones de extracto de humo de cigarrillos (> 5%) pueden reducir sustancialmente confluencia.

2. Creación de Scratch

1. En un ambiente estéril, retire la tapa de la placa de 60 mm de MSC dañados, y sentar un borde recto (por ejemplo, una regla de plástico esterilizada) across el borde superior de la placa. Sin quitar los medios de comunicación, utilizar una punta de pipeta 200 l estéril guiada por la recta de punta estéril para hacer una a cuatro rayas paralelas a través de la placa de aproximadamente 5 mm de distancia y 50 mm de largo.
   Nota: Un borde recto minimiza la cantidad de ajustes rotacionales necesarias para la placa cuando está en la platina del microscopio. Es imperativo que los arañazos aparecen completamente vertical (u horizontal) en la pantalla. Generación de múltiples arañazos en una placa de 60 mm no altera el microambiente de una manera que afecta a la migración celular (datos no presentados), pero puede ser una consideración para otros tipos de células. No se recomienda el uso de pozos más pequeños ya que la variabilidad de las células que crecen cerca del borde del pozo se hace más pronunciada y puede afectar a la generación uniforme de arañazos.
2. Aspirar los medios y lavar suavemente las placas con 2 ml de medio completo pre-calentado para evitar que las células se adhieran a la centro de la cero, y de quitar celulars que se han aflojado por el rascado. Reemplace con 4 ml de medio completo fresco.
3. Utilizando un marcador permanente estéril, etiquetar cada arañazo de 1-4 en la parte inferior de la placa en el lugar que no interfiera con las imágenes de los arañazos.
   Nota: Es importante que las imágenes de la misma cero se comparan antes y después de la migración, ya que no puede haber variación en el ancho cero.

3. Teniendo iniciales Imágenes del rasguño

Nota: Si el ensayo cero se realiza en múltiples placas, se recomienda que se tomen las imágenes iniciales de todos los arañazos en un solo plato antes de arañazos se hacen en la siguiente placa.

1. Utilice un microscopio de contraste de fase invertida con una cámara para generar las imágenes necesarias para el análisis.
2. Coloque la placa de cultivo en el microscopio, y utilizar el objetivo de baja potencia (10X) para localizar cero # 1. Si la condensación en la tapa de la placa de cultivo está impidiendo una imag clarae de las celdas, utilice un escenario calienta a 37 ° C.
3. Mantener el cero totalmente horizontal y en el centro del campo de visión, obtener tantas imágenes como sea necesario para abarcar el 90% de la longitud del cero. Obtener imágenes de partes distintas del cero sin superposición entre las imágenes.
   Nota: La refracción de la luz en los bordes de la placa de cultivo sobreexpone las imágenes, haciéndolas imposibles de analizar. Por lo tanto, no tome imágenes de la primera y el último 5% de la longitud del cero.
4. Guardar imágenes de cada cero en una carpeta separada.
5. Repita los pasos 3,2 a 3,4 para los rasguños 2, 3 y 4.
6. Placas a la incubadora volver inmediatamente después de la impresión inicial. Deje que las células migran por 4-7 hr.
   Nota: 7 horas es óptimo cuando se evalúa MSC dañadas con CSE. La incubación de las células durante más de 7 horas no se recomienda debido a la proliferación de células puede actuar como una variable de confusión para la migración celular (véase la nota opcional 8.2 más adelante).

4. Análisis iniciales de Scratch Imágenes

1. Descargar ImageJ e instalar el plugin Herramienta Curación de Heridas (consulte la Tabla de Materiales / Equipo).
2. Abra el archivo de imagen en ImageJ, haga clic en "Proceso" y "Find Edges" para destacar las células que rodean el cero para la Herramienta de Curación de Heridas para calcular el área de borrador (Figura 2B). A continuación, haga clic en "Imagen", "Ajuste", "Umbral de color" y en el menú desplegable llamado "Umbral de color" cambiar el valor a "B & W".
3. Dentro del menú "Umbral de color", ajuste ambos controles deslizantes de umbral de luminosidad hasta conseguir un contraste óptimo entre el cero y celular frente. Para permitir la mayor rango cuando se trata de crear un contraste en la imagen, mueva el control deslizante inferior completamente a la derecha (imagen completamente negro), y luego ajuste el control deslizante superior para generar el máximo contraste.
4. Lentamente ajustar el bri superiordeslizador llo de izquierda a derecha hasta que la imagen muestra limpiamente el contorno del cero (Figura 2C). Una vez se han identificado los bordes de la cero, haga clic en "Más Herramientas" en la barra de herramientas ImageJ, seleccione "MRI_Wound_Healing_Tool" en el menú desplegable y pulse el botón "m" (que aparecerá en la barra de herramientas ImageJ) para resaltar la zona cero y la salida de la zona calculada en los resultados de una ventana pop-out (Figura 2D).
5. Copie y pegue todos los números de la ventana de resultados (Figura 2E) en una hoja de cálculo Excel. Asegúrese de separar los datos de arañazos individuales.

5. Teniendo Finales Imágenes del rasguño

1. Después de que las células han migrado (07.04 h), repita los pasos 3,2-3,4. Imagen de las placas en el mismo orden en que fueron rayados por lo que las células en cada placa han tenido el mismo tiempo a migrar.
   Nota: Las células se pueden obtener imágenes en múltiples puntos de tiempo, dependiendo de su sensitividad tanto a los cambios de temperatura y pH. Alternativamente, imágenes de células vivas se puede utilizar para seguir las células en tiempo real a medida que migran.

6. Analizar finales de Scratch Imágenes

1. Repita los pasos 4,2-4,5 para imágenes Final Scratch.

7. Cálculo del área de borrador para cuantificar las Migraciones

1. Calcule el área media previa a la migración promediando los valores de área iniciales de los respectivos arañazos.
2. Calcular la cantidad total de la migración restando el área de la migración final para cada imagen, calculado en el paso 6, de la zona de pre-migración promedio (paso 7.1). Generar una lista de valores para cada cero que representa el cambio en la migración.
3. Agrupar los datos de varios rasguños dentro del mismo grupo de prueba (es decir, todas las placas y todos los rasguños en las células expuestas a 0% CSE). Utilice un análisis de varianza de prueba para analizar las diferencias entre los grupos experimentales.
4. Si las células son lentos para migrary requieren un tiempo de incubación más largo después del rascado (mayor a 10-12 hr), realizan un ensayo de incorporación de BrDU o EdU ¹⁹ para determinar si las células están experimentando cualquier proliferación durante el periodo en el que se está produciendo el ensayo de migración. Elija un momento ensayo de migración para evitar la proliferación celular significativa.

8. Opcional

1. Para evaluar si la senescencia celular significativa se produce como resultado del procedimiento de rascado, lleve a cabo un ensayo de beta-galactosidasa asociada a la senescencia en una placa de ensayo en momentos predeterminados después de rascarse ^19.

Resultados

Los ensayos de cero aquí presentados se realizaron con residentes de pulmón de células estromales mesenquimales murinos (LR-MSC) y se aislaron como se indica en las notas de protocolo. La LR-MSC se sembraron a una densidad de 500.000 células en un 60 mm placa de cultivo tisular, y se cultivaron hasta 90% de confluencia en 48 hr. Para generar daños, 4% CSE (descrito anteriormente) se incubó con las células durante 24 hr después del periodo de siembra inicial pero antes de que el ensayo cero. Para cada ensayo, el ...

Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona un método cuantitativo robusto, estandarizado para realizar y analizar los ensayos de cero. Los ensayos de cero simples se utilizan rutinariamente en muchas áreas diferentes de estudio para examinar la migración celular. Sin embargo, tradicionalmente el ensayo cero ha carecido de una puesta a punto y cuantificación protocolo estandarizado, lo que ha dado lugar a problemas con la reproducibilidad ^7,10. Muchas de las modificaciones y optimizaciones para mejorar el ens...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (high glucose, no added glutamine)	Life Technologies	31053-036
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3091002
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SV3007901
Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3003401
TypeLE cell dissociation reagent	Life Technologies	12563-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3002802
Falcon standard 60mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772B
Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips	Fisher Scientific	02-707-502
Inverted light microscope with camera attachment	Variable
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healting plugin	http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistical analysis software	Microsoft Excel