Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke

Résumé

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Résumé

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Introduction

La migration cellulaire est hautement coordonnée et essentielle pour de nombreux processus physiologiques tels que le développement des tissus, la réparation et la régénération, ainsi que des processus pathologiques tels que les métastases du cancer et ^une artériosclérose. Une bonne compréhension de la migration cellulaire est particulièrement pertinent pour les nouvelles thérapies utilisées pour réparer les tissus endommagés et traiter des conditions pathologiques, y compris les technologies de transplantation de cellules et de tissus artificiels greffage ^2. Compte tenu de l'intérêt actuel pour le rôle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans la médiation de la réparation des tissus ^3, la quantification de la capacité de migration de ces cellules en utilisant un dosage qui est rigoureusement quantifiables, adaptable et rentable est d'intérêt. Surtout, un tel essai doit être suffisamment sensible pour détecter des changements relativement subtiles dans la capacité migratoire cellulaire après les dommages. Les méthodes actuelles pour quantifier la migration des cellules, y compris des essais à gratter, des essais de migration trans-puits (Boyden chambres), tableaux micropilier et l'exclusion de la zone cellulaire tests possèdent une gamme de limitations dans la reproductibilité, de personnalisation, de quantification et coût-efficacité ^1,4,5. Le dosage de zéro optimisé décrit ici démontre des résultats robustes, des capacités d'analyse et quantifiables basés sur l'image, coût-efficacité, l'adaptabilité et à d'autres applications.

Des dosages de grattage ont été utilisés dans de multiples capacités d'évaluer la migration et la prolifération cellulaire dans différentes conditions expérimentales ^5. Le test implique l'ensemencement des cellules désignées, les cultiver à compléter ou à proximité de la confluence, et gratter la monocouche résultant avec une aiguille stérile ou pipette ^6. L'analyse est le plus souvent réalisée en comparant la largeur de la rayure sur plusieurs points de temps à des endroits choisis au hasard ^7-9. En dépit de son utilisation importante, l'essai de rayure est confondu par des problèmes avec la reproductibilité et la quantification. La variabilité dansgénération de la rayure ne modifie pas le micro-environnement des cellules, mais peut également empêcher la migration des cellules en endommageant la surface de la plaque sous-jacente et la matrice ^{extracellulaire-5.} Les dosages sont effectués fréquemment plus de 7 à 12 heures, mais pour des lignées cellulaires présentant migration plus lente et de plus longs temps de dosage, la prolifération devient un facteur de confusion ^7,10. Enfin, les cellules sénescentes générés par le processus de grattage peuvent libérer des facteurs qui interfèrent avec la signalisation extracellulaire nécessaire pour combler l'écart dans la monocouche ^1. Optimiser le dosage de zéro nécessite la création d'un espace cohérent qui ne perturbe pas les propriétés de surface, ce qui minimise dosage longueur de temps, et de prévenir la mort des cellules non désirées lors de la manipulation. Le dosage est basé bouchon une optimisation du dosage d'une zone d'exclusion de cellules. Cet essai utilise un bouchon placé au milieu du puits, qui exclut la croissance des cellules, mais permet aux cellules d'être plaqués autour de la zone d'exclusion central.Pour évaluer la migration, le bouchon est enlevé, et la zone d'exclusion résultante fournit une surface pour la migration se produise. Toutefois, ce dosage est difficile pour personnaliser ou adapter ¹⁰ et pour certaines applications, cette technique peut également être prohibitif.

Contrairement aux tests de grattage et de leurs dérivés, des tests de migration trans-de puits (ou de Boyden dosages de chambre) évaluer la migration en quantifiant le nombre de cellules qui se déplacent d'une chambre, à travers une membrane de filtration microporeuse, dans une chambre contenant des agents chimiotactiques ^{8,11, 12.} Cette technique a une utilité limitée pour les cellules adhérentes comme MSC, car après la migration à travers la membrane poreuse, les cellules adhèrent au côté de la membrane exposée aux agents chimiotactiques, et peuvent être difficiles à quantifier avec précision. Alors que le test est en mesure d'examiner certains schémas de migration en trois dimensions, les types de cellules restreintes pour lesquelles il est en mesure de quantifier avec précision la limite de la migration des cellules de son utilitaire ¹⁰. Une autre alternative pour des essais de rayure utilise une matrice de micro-colonne, qui mesure la motilité cellulaire à travers un espace à trois dimensions en utilisant la capacité des cellules à se déformer et à migrer dans la matrice en tant que substitut. Polydimethlysiloxane (PDMS) élastomères durcis sur un moule précis et traités avec de l'ozone et de la fibronectine produit un micro-environnement homogène et non dégradable. Micro-pilier espacement peut également être modifié selon les besoins pour évaluer la capacité des cellules pour entrer dans le tableau ^4. Le moule est créée par profonde gravure ionique réactive de plaquettes de silicium pour créer une version négative de la haute rapport d'aspect ¹³ gamme. Bien que le dosage est renforcé par sa personnalisation, la capacité de modéliser la migration en trois dimensions, et l'analyse par la visualisation directe des cellules migrantes, la difficulté à créer des réseaux de micro-pilier économique empêche son utilisation généralisée.

Le dosage de zéro optimisé décrit dans ce protocole offre une efficacité, des cosProcédé de t-efficace pour produire des rayures uniformes qui peuvent être analysées en utilisant un logiciel disponible gratuitement. Au lieu de simples mesures de largeur faites à travers le scratch avant et après la migration cellulaire, le logiciel permet à l'utilisateur de déterminer les zones à gratter totaux avant et après la migration. Cet avancement limite la question d'essayer de déterminer où le zéro les mesures de largeur doivent être prises, et si la largeur de la rayure est uniforme le long de sa longueur. En outre, une optimisation soignée du nombre de cellules, la confluence des cellules et le type et le degré de dommages infligés aux cellules est discutée afin d'optimiser le dosage.

Protocole

Remarque: Pour cette étude, des cellules stromales mésenchymateuses du poumon (LR-MSC) à partir de tissu pulmonaire distale ont été isolés soit en fonction de leur expression de marqueurs de surface cellulaire (CD45 ^neg, CD31 ^neg, Sca-1 ^élevé, EpCAM ^{neg) 14,15,} à l'aide explantation hors ^croissance de 16, ou en utilisant une digestion enzymatique ^17. LR-adhérent CSM ont été cultivées dans du DMEM riche en glucose avec et sans glutamine, 15% de FBS, de la glutamine mM antibiotique / antimycotique, et deux 1x (médias désormais complet) et on incube à 37 ° C, 5% CO _2. LR-MSC ont été passées 3-4 fois afin d'assurer une population de cellules ayant des caractéristiques de croissance relativement homogènes pour l'essai de migration.

1. Préparation d'une monocouche confluente

1. Pour détacher MSC de boîtes de culture de 100 mm, laver les cellules avec 10 ml de 37 ° C préchauffé PBS, aspirer le PBS et ajouter 4 ml de trypsine (0,25%). Incuber 3 à 5 min dans un incubateur à 37 °. Aspirer le cElls dans un tube conique, ajouter un volume égal de milieu complet et centrifuger à 300 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules vers le bas.
   Remarque: incubation plus long peut modifier la trypsine dans les récepteurs de la surface cellulaire et potentiellement affecter la migration.
2. Aspirer le milieu et remettre les cellules dans un milieu complet frais. Compter les cellules, à l'exclusion des cellules mortes en utilisant exclusion du bleu trypan et de la plaque de cellules stromales mésenchymateuses 500.000 dans 4 ml de milieu complet sur une boîte de culture cellulaire de 60 mm.
   Note: En fonction de la source des cellules, des tests peuvent être nécessaires pour déterminer le nombre optimal de cellules nécessaires.
3. Incuber les cellules jusqu'à ce que les plaques sont 90% de confluence pour une fixation optimale des cellules et la prolifération, habituellement 48-72 h pour MSC.
   Remarque: 100% de confluence est pas recommandé, car un grand nombre de cellules expérience inhibition de contact de l'ancrage à charge, ce qui peut modifier leur capacité migratoire. Plaques avec moins de 80% de confluence se traduira par des photos inutilisables parce que le logiciel d'analyse d'image va interpréter écarts entre les cellules dans le cadre du périmètre de la rayure (voir figure 1D).
4. Après que les cellules ont atteint 90% de confluence, les cellules comme endommager approprié pour l'application. Pour évaluer les dommages cellulaires après exposition à soluble extrait de la fumée de cigarette (CSE), générer 100% CST en dessinant la fumée à partir du 1er Université du Kentucky cigarette de recherche (3R4F) à travers 25 ml de milieu complet dans un flacon Büchner plus de 2 min ^18.
5. Incuber les cellules pendant 24 heures dans 4 ml 1-4% CST diluée dans un milieu complet. Après incubation, laver les cellules deux fois avec 4 ml de PBS chaud stérile, avant de remplacer avec 4 ml de milieu complet frais.
   Remarque: endommager les cellules avec des concentrations élevées de l'extrait de la fumée de cigarette (> 5%) peut réduire sensiblement la confluence.

2. Création du Scratch

1. Dans un environnement stérile, retirer le couvercle de la plaque de 60 mm de MSC endommagés, et de jeter un bord droit (par exemple, une règle en plastique stérilisé) across le rebord supérieur de la plaque. Sans retirer le support, utiliser une pipette de 200 pi stérile guidée par le straight-edge stérile pour faire de un à quatre rayures parallèles à travers la plaque d'environ 5 mm d'intervalle et 50 mm de long.
   Remarque: A bord droit minimise la quantité de réglages en rotation nécessaires à la plaque quand il est sur la platine du microscope. Il est impératif que les rayures apparaissent complètement verticale (ou horizontale) sur l'écran. Générer de multiples rayures sur une plaque de 60 mm ne modifie pas le micro-environnement d'une manière qui affecte la migration des cellules (données non présentées), mais elle peut être une considération pour les autres types de cellules. L'utilisation de petits puits est déconseillé car la variabilité de la croissance de cellules près du bord du puits devient plus prononcée et peut affecter la génération uniforme de rayures.
2. Aspirer les médias et laver délicatement les plaques avec 2 ml de milieux complets pré-chauffé pour empêcher les cellules d'adhérer au centre de la rayure, et de supprimer la cellules qui ont été ébranlée par le grattage. Remplacer avec 4 ml de milieu complet frais.
3. L'utilisation d'un marqueur permanent stérile, étiqueter chaque scratch parmi 1-4 sur la face inférieure de la plaque à l'emplacement qui ne sera pas interférer avec l'imagerie des rayures.
   Remarque: Il est important que les images de la même zéro sont comparés avant et après la migration, car il peut y avoir des variations dans la largeur de zéro.

3. Prenant images initiales de la rayure

Remarque: Si le dosage de zéro est effectuée sur des plaques multiples, il est recommandé que les images initiales de toutes les rayures sur une seule plaque sont prises avant rayures sont faites sur la plaque suivante.

1. Utiliser un microscope à contraste de phase inversée avec un appareil pour générer les images nécessaires à l'analyse.
2. Placer la plaque de culture sur le microscope, et d'utiliser l'objectif de faible puissance (10X) pour localiser zéro # 1. Si de la condensation sur le couvercle de la plaque de culture est une entrave claire image des cellules, utilisez un ensemble de stade chauffé à 37 ° C.
3. Garder le scratch complètement horizontal et dans le centre du champ de vision, obtenir autant d'images que nécessaire pour englober 90% de la longueur de la rayure. Obtenir des images de parties distinctes de la rayure sans chevauchement entre les images.
   Remarque: La réfraction de la lumière sur les bords de la boîte de culture surexpose les images, ce qui les rend impossibles à analyser. Par conséquent, ne pas prendre des images de la première et dernière 5% de la longueur de la rayure.
4. Enregistrez les images de chaque zéro dans un dossier distinct.
5. Répétez les étapes 3.2 à 3.4 pour les égratignures 2, 3, et 4.
6. Remettre les assiettes à l'incubateur immédiatement après l'imagerie initiale. Laissez cellules migrent pour 4-7 heures.
   Remarque: 7 h est optimale lors de l'évaluation MSC endommagés avec le CST. Incubation des cellules pendant plus de 7 heures est pas recommandé car la prolifération cellulaire peut agir comme un facteur de confusion pour la migration cellulaire (voir la note 8.2 ci-dessous en option).

4. Analyse initiales Scratch Images

1. Télécharger ImageJ et installer le plugin de guérison des plaies outil (se référer à la Table des Matières / Équipement).
2. Ouvrez le fichier d'image dans ImageJ, puis cliquez sur "Process" et "Trouver Edges" de mettre en évidence les cellules environnantes le scratch pour la guérison des plaies outil pour calculer l'aire de zéro (figure 2B). Ensuite, cliquez sur "Image", "Ajuster", "Seuil de couleur" et dans le menu déroulant intitulé "Seuil de couleur" changer la valeur de "B & W."
3. Dans le menu "seuil de couleur", régler les deux curseurs de seuil de luminosité jusqu'à ce contraste optimal entre le zéro et la cellule avant est atteint. Afin de permettre la plus grande gamme en essayant de créer contraste de l'image, déplacez le curseur en bas complètement à droite (image complètement noire), puis ajustez le curseur dessus pour générer un contraste maximum.
4. Ajuster lentement le bri topghtness curseur de gauche à droite jusqu'à ce que l'image affiche proprement le contour de la rayure (figure 2C). Une fois les bords de la rayure ont été identifiés, cliquez sur "Plus Outils» dans la barre d'outils ImageJ, sélectionnez "MRI_Wound_Healing_Tool" dans le menu déroulant, puis appuyez sur la touche "m" (qui apparaîtra dans la barre d'outils ImageJ) pour mettre en évidence la zone de zéro et la sortie de la zone calculée dans une fenêtre de résultats pop-out (figure 2D).
5. Copier et coller tous les numéros de la fenêtre des résultats (figure 2E) dans un tableur Excel. Assurez-vous de séparer les données individuelles des égratignures.

5. Compte Images finales du Scratch

1. Après que les cellules ont migré (4-7 heures), répétez les étapes 3.2 à 3.4. Image les plaques dans le même ordre qu'ils ont été rayés de sorte que les cellules sur chaque plaque ont eu le temps égal à migrer.
   Remarque: Les cellules peuvent être visualisés à de multiples points dans le temps, en fonction de leur sensitivité à la fois des changements de température et de pH. Alternativement, imagerie de cellules vivantes peut être utilisé pour suivre les cellules en temps réel lors de leur migration.

6. Analyse finales Scratch Images

1. Répétez les étapes 4.2 à 4.5 pour des images de Final Scratch.

7. Calcul de la zone de Scratch pour quantifier la migration

1. Calculer la superficie moyenne de pré-migration par la moyenne des valeurs de la zone de départ des rayures respectifs.
2. Calculer le montant total de la migration en soustrayant la zone de migration finale pour chaque image, calculée à l'étape 6, à partir de la zone de pré-migration moyenne (étape 7.1). Générer une liste de valeurs pour chaque zéro représentant l'évolution de la migration.
3. Regrouper les données provenant de plusieurs rayures à l'intérieur du même groupe d'essai (à savoir toutes les plaques et les griffes sur les cellules exposées à 0% CSE). Utiliser une analyse de l'essai Écart d'analyser les différences entre les groupes expérimentaux.
4. Si les cellules sont lentes à migreret exiger un temps d'incubation plus longue après grattage (supérieure à 12.10 h), effectuer une BrDU ou EdU incorporation test ¹⁹ pour déterminer si les cellules sont en cours de prolifération pendant toute la période pendant laquelle l'essai de migration est en cours. Choisir un temps d'essai de migration pour éviter la prolifération cellulaire significative.

8. Facultatif

1. Pour évaluer si la sénescence cellulaire importante est en cours à la suite de la procédure de grattage, effectuer une bêta-galactosidase dosage de la sénescence associée sur une plaque d'essai à des moments prédéterminés après grattage ^19.

Résultats

Les tests de grattage présentées ici ont été réalisées en utilisant des cellules stromales mésenchymateuses résidents du poumon murins (LR-MSC) et isolés comme référence dans les notes de protocole. La LR-MSC ont été ensemencées à une densité de 500.000 cellules dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm, et cultivé à 90% de confluence en 48 heures. Pour générer des dommages, 4% CST (décrite ci-dessus) a été incubé avec les cellules pendant 24 heures après la période initiale d'ensemenc...

Discussion

Le protocole décrit ici offre une méthode quantitative robuste standardisée pour réaliser et analyser les tests de grattage. Dosages à gratter simples sont couramment utilisés dans de nombreux domaines d'étude pour examiner la migration cellulaire. Cependant, traditionnellement le dosage de zéro a manqué un set-up et la quantification protocole standardisé, qui a conduit à des problèmes avec la reproductibilité ^7,10. Beaucoup de modifications et optimisations pour améliorer le dosage de zér...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (high glucose, no added glutamine)	Life Technologies	31053-036
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3091002
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SV3007901
Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3003401
TypeLE cell dissociation reagent	Life Technologies	12563-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3002802
Falcon standard 60mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772B
Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips	Fisher Scientific	02-707-502
Inverted light microscope with camera attachment	Variable
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healting plugin	http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistical analysis software	Microsoft Excel