Оптимизация раны царапинам анализе для обнаружения изменений в мышиной мезенхимальных стромальных клеток миграции после повреждения по растворимый экстракт сигаретного дыма

Резюме

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Аннотация

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Введение

Миграция клеток высоко скоординированных и жизненно важное значение для многих физиологических процессах, таких как развитие тканей, ремонта и регенерации, а также патологических процессов, таких как метастазирование рака и атеросклероза ^1. Понимание миграции клеток, в частности, отношение к возникающим лечения, используемых для восстановления поврежденных тканей и лечения патологических состояний, в том числе клеточной трансплантации и искусственных технологий ткани прививки ^2. Учитывая текущую заинтересованность в роли мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в опосредовании тканей ремонт ^3, количественной миграционную способность этих клеток с помощью анализа, который строго количественно, адаптации, и экономически эффективным представляет интерес. Важно отметить, что подобный анализ должен быть достаточно чувствительным, чтобы обнаружить относительно небольшие изменения в клеточной миграции емкости после повреждения. Современные методы количественной оценки миграции клеток, в том числе скретч-анализы, анализы миграции транс-а (Бойден чянтарь), micropillar массивы, и анализы клеточной зоны отчуждения обладают ряд ограничений в воспроизводимости, возможности настройки, количественного и экономической эффективности ^1,4,5. Оптимизированная царапины анализа, описанного здесь демонстрирует устойчивые результаты, поддающиеся количественной оценке и на основе образа возможности анализа, рентабельность и адаптируемость к другим приложениям.

Царапины анализы были использованы в нескольких емкостей для оценки миграции клеток и пролиферации при различных экспериментальных условиях ^5. Анализ влечет за собой посева назначенных клетки, растет их полное или почти полное слияние, и царапин полученной монослой стерильной иглой или кончиком пипетки ^6. Анализ наиболее часто выполняется путем сравнения ширины царапины над различные моменты времени в случайно выбранных местах ^7-9. Несмотря на видном использования, царапины Анализ посрамлены проблем с воспроизводимостью и количественного определения. Изменчивостьпоколение нуля не только изменяет микроокружение клеток, но также может препятствовать миграции клеток, повреждая поверхности пластины и основной внеклеточный ^{матрикс-5.} Анализы часто проводились в течение 7 до 12 часов, однако для клеточных линий отображаются медленнее и дольше миграции раз анализ, распространение становится сбивающий переменной ^7,10. Наконец, стареющие клетки, созданные в процессе царапин может выпустить факторы, которые мешают внеклеточной сигнализации требуется, чтобы закрыть разрыв в монослое ^1. Оптимизация царапинам анализа требует создания постоянной щели, чтобы не мешать с поверхностными свойствами, минимизируя длительность анализа и предупреждения нежелательной клеточной гибели во время манипуляции. Пробка на основе анализа является оптимизация зоны анализа клеток исключения. Этот анализ используют пробку помещают в середине скважины, что исключает рост клеток, но позволяет клеткам быть покрыты вокруг центральной зоны отчуждения.Для оценки миграции, стопор снимается, и полученный в результате зона отчуждения обеспечивает поверхность для миграции происходит. Тем не менее, этот анализ сложно настроить или адаптировать ^{10 и} для некоторых приложений, этот метод также может быть сопряжено с запретом.

В отличие от нуля анализов и их производных, миграции и транс-анализов (или Бойдена камеры анализов) оценки миграции путем количественного определения количества клеток, которые перемещаются из одной камеры, через микропористой мембраны фильтра, в камеру, содержащую хемотаксические агентов ^{8,11, 12.} Эта техника имеет ограниченную полезность по адгезивных клеток, таких как МСК, так как следующие миграции через пористую мембрану, клетки прилипать к стороне мембраны воздействию хемотаксиса агентов, и может быть трудно точно измерить. В то время как анализ способен исследовать некоторые трехмерные модели миграции, ограниченные типы клеток, для которых она способна точно определить их миграции клеток ограничивают ее полезность ¹⁰, Еще одной альтернативой нуля анализов использует массив микро-столб, который измеряет сотовой моторику через трехмерном пространстве с помощью способность клеток к деформации и мигрируют в массив в качестве суррогата. Polydimethlysiloxane (PDMS) эластомеры вылечить более точного форму и обрабатывают озоном и фибронектин производит однородную и неразлагаемую микросреду. Расстояние между микро-колонна также может изменяться по мере необходимости, чтобы оценить способность клеток, чтобы войти в массив ^4. Форма создается с помощью глубокой реактивного ионного травления кремниевых пластин для создания отрицательного версию высокого удлинения массива ^13. В то время как анализ подкрепляется его настраиваемость, возможность моделировать трехмерную миграцию и анализ через прямой визуализации мигрирующих клеток, трудности в создании микро-столба массивы экономически препятствует его широкому использованию.

Оптимизированная царапины анализа, описанного в этом протоколе обеспечивает эффективное, созт эффективное Способ получения в соответствии царапины, которые могут быть проанализированы с использованием свободно доступного программного обеспечения. Вместо простых измерений ширины по всей нуля до и после миграции клеток, программное обеспечение позволяет пользователю определить общей площади царапины до и после миграции. Это продвижение ограничивает вопрос, пытаясь определить, где царапина ширина измерения должны быть приняты, и будет ли ширина царапины однородно вдоль его длины. Кроме того, тщательное оптимизацию количества клеток, клеток слияния и типа и степени ущерба, нанесенного клеток обсуждается в целях дальнейшей оптимизации анализа.

протокол

Примечание: Для данного исследования, легких мезенхимальных стромальных клеток (МСК LR-) дистальной от легочной ткани были выделены либо на основе их экспрессии поверхностных маркеров клеточной (CD45 ^нег, CD31 ^нег, SCA-1 ^{высокой,} EpCam ^{нег) 14,15,} используя эксплантов из-роста ^16, или с помощью ферментативного расщепления ^17. Адгезивная LR-МСК культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы и глутамина, не 15% FBS, 1x антибиотика / противогрибкового и 2 мМ глутамина (далее полное носителе) и инкубировали при 37 ° С, _5% СО 2. LR-МСК пассировали 3-4 раз, чтобы убедиться популяцию клеток с относительно однородными характеристиками роста для анализа миграции.

1. Подготовка сливающийся монослой,

1. Для отсоединения МСК из стандартных 100 мм культуральные чашки, мыть клетки с 10 мл 37 ° C подогретого PBS, PBS аспирации и добавить 4 мл трипсина (0,25%). Выдержите 3-5 мин в 37 ° C инкубатора. Аспирируйте Cлоктей в конической трубе, добавить равный объем полной среды и центрифуге при 300 г в течение 5 мин, чтобы осадить вниз клетки.
   Примечание: Более инкубации в трипсина может изменить рецепторы клеточной поверхности и, возможно, влияет на миграцию.
2. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования клеток в свежей полной информации. Граф клеток, за исключением мертвых клеток с использованием трипанового синего и пластины 500000 мезенхимальных стромальных клеток в 4 мл полной среды на 60 мм чашки для культивирования клеток.
   Примечание: В зависимости от источника клеток, тесты могут быть необходимы, чтобы определить оптимальное количество клеток, необходимых.
3. Инкубируйте клетки до тех пор, пока пластины на 90% сплошности для оптимального прикрепления и пролиферации клеток, как правило, 48-72 ч в течение МСК.
   Примечание: 100% слияния не рекомендуется, так как многие крепления зависит от клеток опыт контактного торможения, которое может изменить их миграционную способность. Пластины с менее чем 80% слияния приведет непригодных фотографий, поскольку программное обеспечение анализа изображений будет интерпретировать разрывс между клетками, как части периметра листа (рис 1D).
4. После того, как клетки достигли слияния 90%, повреждения клеток в зависимости от конкретной программы. Для оценки повреждения клеток после воздействия экстракта растворимого сигаретного дыма (CSE), генерировать 100% CSE опираясь дым от 1 Университет Кентукки исследований сигареты (3R4F) через 25 мл полной среды в колбе Бюхнера в течение 2 мин ^18.
5. Инкубируйте клетки в течение 24 ч в 4 мл 1-4% CSE, разведенного в полной среде. После инкубации промыть клетки дважды 4 мл стерильной PBS теплой, перед заменой 4 мл свежей полной среды.
   Примечание: повреждения клеток с высокой концентрацией экстракта сигаретного дыма (> 5%) может существенно снизить слияния.

2. Создание царапинам

1. В стерильной среде, снимите крышку с 60 мм пластины поврежденных МСК, и заложить линейку (например, стерилизовать пластиковая линейка) переменногоРосс верхний край пластины. Без снятия средств массовой информации, использовать стерильную 200 мкл пипетки наконечник руководствуясь стерильной линейкой, чтобы сделать от одного до четырех параллельных царапин через пластины примерно 5 мм друг от друга и длиной 50 мм.
   Примечание: прямой край минимизирует количество вращательных корректировки, необходимые для пластины, когда она находится на предметном столике микроскопа. Это важно, что царапины появляются совершенно вертикальной (или по горизонтали) на экране. Создание нескольких царапин на 60 мм пластины не изменяет микроокружение таким образом, что влияет на миграцию клеток (данные не показаны), но может быть рассмотрен в других типах клеток. Применение небольших скважин не рекомендуется, поскольку изменчивость клеток, растущих близко к краю колодца становится более выраженным и может повлиять на равномерное образование царапин.
2. Аспирируйте СМИ и аккуратно мыть тарелки с 2 мл подогретого полный СМИ по предотвращению клетки от присоединения к центру нуля, и удалить ячейкус, что были ослаблены в царапин. Заменить 4 мл свежей полной среды.
3. С помощью стерильной постоянный маркер, пометить каждый царапина от 1-4 на нижней стороне пластины на месте, не будет мешать визуализации царапины.
   Примечание: Очень важно, чтобы изображения с тем же нуля сравнивают перед и после миграции, поскольку может быть изменение ширины к царапинам.

3. Принимая исходных изображений царапины

Примечание: Если царапина анализ проводят на нескольких пластин, рекомендуется, чтобы начальные образы всех царапин на одной пластине принято до царапины сделаны на следующей пластины.

1. Использование инвертированного фазово-контрастного микроскопа с камерой для формирования изображения, необходимые для анализа.
2. Расположите культуры пластины на микроскоп, и использовать низкую цель питания (10X), чтобы найти царапинам # 1. Если конденсат на крышке культурального планшета препятствует четкое Imagе клеток, используют нагретый сценическое до 37 ° С.
3. Ведение царапины полностью горизонтальное и в центре поля зрения, получить как можно больше изображений как необходимо, чтобы охватить 90% длины нуля в. Получение изображений различных участках нуля, без перекрытия между изображениями.
   Примечание: преломление света на краях чашки для культивирования overexposes изображения, делая их невозможно анализировать. Поэтому, не принимать изображения с первым и последним 5% длины нуля в.
4. Сохранение изображений из каждого нуля в отдельной папке.
5. Повторите этапы 3.2-3.4 царапин 2, 3, 4 и.
6. Вернуться пластин в инкубаторе сразу после начальной визуализации. Пусть клетки мигрируют по 4-7 ч.
   Примечание: 7 ч является оптимальным при оценке МСК поврежденные с ЕГЭ. Инкубации клеток в течение более 7 ч не рекомендуется, поскольку пролиферация клеток может выступать в качестве переменной для искажающего миграции клеток (смотри ниже Необязательное Примечание 8.2).

4. Анализируя Первоначальный Скретч изображений

1. Скачать ImageJ и установить плагин раны целебным средством (обратитесь к таблице материаловедения / Оборудование).
2. Откройте файл изображения в ImageJ, то нажмите кнопку "Process" и "Find Edges" чтобы выделить клетки, окружающие царапины для заживления ран Инструмент для расчета рабочей области (рис 2B). Затем нажмите "Image", "Adjust", "Цвет Threshold" и в выпадающем меню с надписью "Порог цвета" измените значение на "B & W".
3. В меню "Цвет Threshold" отрегулируйте яркость обоих пороговых ползунки, пока оптимальный контраст между царапинам и клеточной перед пока не будет достигнута. Для обеспечения наибольшей амплитудой, когда пытается создать контраст в изображении, переместите ползунок в нижней полностью вправо (полностью черный изображения), а затем настроить верхний ползунок, чтобы генерировать максимальную контрастность.
4. Медленно отрегулировать верхнюю BRIghtness слайдер слева направо, пока изображение не отображается чисто контур нуля (рис 2С). После того, как края нуля были определены, нажмите кнопку "Дополнительные инструменты" в панели инструментов ImageJ, выберите "MRI_Wound_Healing_Tool" из выпадающего меню, и нажмите кнопку "M" (который будет отображаться в панели инструментов ImageJ), чтобы выделить царапинам область и вывода компьютерной площадь в результатах вывести окно (рис 2D).
5. Скопируйте и вставьте все номера в окне результатов (рис 2E) в таблицу Excel. Убедитесь, чтобы отделить данные от отдельных царапин.

5. Принимая Заключительных изображений царапины

1. После того как клетки мигрировали (4-7 ч), повторите шаги 3.2-3.4. Изображение пластины в том же порядке, они были почесал так, что клетки на каждой пластине были равное время для переноса.
   Примечание: клетки могут быть отображены в нескольких точках времени, в зависимости от их Сенсиность к обеим изменений температуры и рН. В качестве альтернативы, изображений живых клеток может использоваться, чтобы следовать клеток в реальном времени, поскольку они мигрируют.

6. Анализируя Заключительных Скретч изображений

1. Повторите шаги 4.2-4.5 для конечных нуля изображений.

7. Расчет рабочей области, которая Количественно миграции

1. Вычислить среднюю площадь до миграции путем усреднения начальные значения области соответствующих царапин.
2. Вычислить общую сумму миграции путем вычитания окончательную область переноса для каждого изображения, рассчитанного на шаге 6, от средней области до миграции (шаг 7,1). Создание списка значений для каждого нуля, представляющего изменение в миграции.
3. Бассейн данные из нескольких царапин в той же тестовой группы (то есть все тарелки и все царапины на клетки подвергаются 0% CSE). Используйте анализ отклонений тест, чтобы проанализировать различия между экспериментальными группами.
4. Если клетки медленно мигрируюти требуют более длительного времени инкубации после расчесывания (более 10-12 часов), выполнить BrdU или ОБР включение анализа ^19, чтобы определить, является ли клетки претерпевают любой пролиферацию в течение периода, в котором анализа миграции происходит. Выберите миграции время анализа, чтобы избежать значительного пролиферацию клеток.

8. Необязательно

1. Чтобы оценить, насколько значительное старение клеток происходит в результате процедуры царапин, выполнить старение-ассоциированных бета-галактозидазы анализ на испытательную пластину в заданные моменты времени после расчесывания ^19.

Результаты

Царапина анализы, представленные здесь, были выполнены с использованием мышиных резидентов легких мезенхимальных стромальных клеток (МСК LR-) и выделяют в виде ссылки в примечаниях протокола. LR-МСК высевали при плотности 500000 клеток в 60 мм чашки для культивирования тканей, и выращивали д...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, обеспечивает надежную количественно, стандартизированный метод для выполнения и анализа скретч анализов. Простые скретч анализы, которые обычно используются во многих различных областях исследования для изучения клеточной миграции. Тем не менее, традицион...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (high glucose, no added glutamine)	Life Technologies	31053-036
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3091002
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SV3007901
Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3003401
TypeLE cell dissociation reagent	Life Technologies	12563-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3002802
Falcon standard 60mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772B
Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips	Fisher Scientific	02-707-502
Inverted light microscope with camera attachment	Variable
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healting plugin	http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistical analysis software	Microsoft Excel