نموذج الفأر ليزر بفعل اتساع الأوعية الدموية المشيمية

Summary

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Abstract

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Introduction

الضمور البقعي (AMD) المرتبطة بالعمر هو واحد من الأسباب الرئيسية للعمى في الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 50 ^1-3. AMD يمكن تصنيفها إلى نوعين: ضامر ("تجف") AMD وحديث التوعي ("الرطب") AMD. يتميز السابق بضمور الجغرافي للالظهارة الصبغية الشبكية (RPE)، المشيماء الشعيرية، وخلايا مستقبلة للضوء، في حين يتميز هذا الأخير من غزو السفن غير طبيعية من المشيمية في طبقات الشبكية الخارجي مما تسبب في تسرب، والنزف، والتليف، وفي نهاية المطاف مما يؤدي إلى العمى ^1،2. من الشكلين، وحسابات التوعية المستحدثة AMD بالنسبة للغالبية من فقدان البصر ^1. لحسن الحظ، هذا النموذج لديه خيارات عديدة للإدارة الدوائية الفعالة، في حين أن نظيرتها الضموري قد حاليا أي ثبت العلاجات الطبية ^3. وعلاوة على ذلك، لأن النموذج التوعية المستحدثة تم بسهولة إعادة استسلمت في نموذج حيواني، فقد كان أكثر سهولة على نطاق واسع والأساسيةبحث MD استكشاف الآليات المرضية الكامنة من أجل تطوير علاجات رواية ^(4).

تم تطوير نموذج حيواني الأول من اتساع الأوعية الدموية المشيمية التجريبية (CNV) عن طريق ريان وآخرون. في الرئيسيات غير البشرية ^5. هذه القطيعة نموذج الناجم عن غشاء بروك عبر الضوئي بالليزر، مما تسبب في الاستجابة الالتهابية المحلية مما أدى إلى تكوين الأوعية الدموية شبيهة بتلك التي شوهدت في التوعية المستحدثة AMD. تم العثور على تطور الأنسجة من الأوعية الدموية تحريض ما بعد الليزر لتقليد حديث التوعي AMD، التي أكدت صحة النموذج ^6. الرئيسيات غير البشرية تقدم علم التشريح الأكثر مماثلة على البشر، ولكن للأسف، هي مكلفة للحفاظ على، لا يمكن بسهولة التلاعب بها وراثيا، ولها دوام بطء تطور المرض ^7. على النقيض من نماذج القوارض هي أكثر من ذلك بكثير للحفاظ على فعالية من حيث التكلفة، ويمكن التلاعب بها وراثيا مع السهولة النسبية، ولها أسرع بكثير فصول التوجيه الجامعيRSE من تطور المرض (ويمكن إجراء التجارب على نطاق ووقت أسابيع مقابل شهرا). وينبغي إجراء هذه التجارب إلا في القوارض المصطبغة كما أنه من الصعب جدا تصور في الحيوانات البيضاء.

نموذج CNV يسببها الليزر الفأر، وضعت لأول مرة من قبل مجموعة Campochiaro في أواخر 90 ¹⁰ و، نمت لتكون النموذج الحيواني السائد في معظم الدراسات الحديثة ^11-16. بسبب المرضية المعقدة ويزال من غير الواضح من CNV، وقد تم تطبيق نموذج الليزر في جميع جوانب البحث AMD الرطب بدءا من دراسة الآليات الجزيئية القيادة الأوعية الدموية لتقييم طرق العلاج الجديدة للاستخدام البشري في المستقبل. على سبيل المثال، ساكوراي وآخرون. واسبينوزا-Heidmann وآخرون. استخدام نموذج الليزر لدراسة تأثير الضامة على تطوير CNV باستخدام الفئران المعدلة وراثيا والعلاجات الدوائية نضوب ^{15، 16.} Giani وآخرون. وHoerster وآخرون. تستخدم البصرية تماسك التصوير المقطعي (أكتوبر) لصورة CNV في محاولة لتوصيف تطور CNV ومقارنة النتائج النسيجية لنتائج نشاهد في أكتوبر التصوير ^12،17 الليزر التي يسببها. وأخيرا، وقد استخدمت الدراسات التي تنطوي على حقن intravitreal من العوامل المضادة للعائية كما شرطان أساسيان للمحاكمات الإنسان وكانت حيوية في تطوير الجيل الأول من مضادات VEGF المستخدمة في إدارة حديث التوعي AMD اليوم ^10،18،19.

نماذج بديلة لالتجريبي CNV تستخدم الأساليب الجراحية للحث على CNV. ويشمل هذا الإجراء حقن المواد المؤيدة للعائية (مثل ناقلات فيروسية المؤتلف overexpressing VEGF، حقن تحت الشبكية من خلايا RPE و / أو الخرز البوليسترين) لتقليد زيادة التعبير VEGF ينظر في التوعية المستحدثة AMD، وذلك بهدف التسبب في الأوعية الدموية ^8،20. ومع ذلك، وهذه الطريقة تعطي معدلات أقل بشكل كبير من اتساع الأوعية الدموية. وأظهرت هذه الدراسات أن CNV فييحدث C57 / BL6 الفئران في 31٪ من عمليات الحقن مقابل ~ نسبة النجاح 70٪ يرى في طريقة الضوئي ليزر في نفس سلالة من الفئران ^8،14. لهذه الأسباب، ونظرا للمزايا استخدام القوارض مقابل الرئيسيات غير البشرية، أصبح نموذج الفأر التي يسببها الليزر CNV النموذج الحيواني القياسي لCNV لمعظم حديث التوعي تجارب الدراسة AMD ^8.

العين الماوس هي ضئيلة، الأنسجة الحساسة للعمل مع. المناورة من العين لتصور شبكية العين صعبة وتتطلب قدرا كبيرا من التدريب حتى يتم تحقيق إتقان. ويزيد من تعقيد هذه المهمة من حقيقة أنه يجب أن يتعلمها مع اليد المسيطرة وغير المسيطرة. وعلاوة على ذلك، بعد أن تم تعلم حركات غرامة المطلوبة لتصور شبكية العين، والتنسيق بين كلتا اليدين ودواسة القدم تشغيل الليزر مهمة. في هذه الورقة، سعينا لاستخلاص تحديات تعلم كل من التلاعب المادية تشارك في الليزر التي يسببها CNV بروكedure إلى دليل من شأنه أن يساعد مشغلي تحقيق النجاح السريع مع هذا النموذج.

Protocol

يتم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية 2013 الطبعة، ورابطة للبحوث في الرؤية والعيون (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية، والتي وافق عليها الحيوان المؤسسي الرعاية واستخدام اللجنة لجامعة نورث وسترن.

ملاحظة: يمكن أن يتم الإجراء التالي تماما مع مشغل واحد. ومع ذلك، يجري ذلك بشكل أكثر كفاءة مع اثنين من المشغلين مع مهام تقسيم وفقا لذلك.

1. إعداد محطة الليزر وقبل الليزر

1. ضع الليزر والمصباح الشقي حيث يمكن الوصول إليها بسهولة. بدوره على الليزر وتعيين المعلمات محددة مسبقا (على سبيل المثال 75 ميكرون حجم البقعة، 100 ميجاوات، 100 ميللي ثانية مدتها).
   تنبيه: تأكد مشغل ترتدي يتم عرض جميع معدات الوقاية الشخصية الحيوانية وسلامة الليزر والليزر السلامة ذات الصلة علامات خارج الغرفة الداخلي.
   1. قبل استخدام أي حيوانات التجارب، والعثور على المعلمات مثالية باستخدام المعايرة، والماوس غير التجريبية. سيعتمد المعلمات الليزر على الليزر المستخدمة. يتم تعريف المعلمات مثالية من وضع أدنى طاقة الليزر التي تسبب باستمرار "فقاعة" تشكيل عندما ركزت بشكل صحيح. انظر الفيديو على سبيل المثال الآفة مع سليم "فقاعة" تشكيل.
2. إعداد المحطة قبل الليزر بحيث التخدير والحيوان أكثر دفئا، وتقضي على الأنسجة، وجميع قطرات العين (تروبيكاميد، تتراكائين، والدموع الاصطناعية) هي في متناول اليد بسهولة إلى المشغل.
   1. تأكد من أن الحيوانات أكثر دفئا هو قبل تسخينها إلى درجة حرارة تصحيح (37 ° C) قبل حقن مخدر في الماوس الأول من أجل تجنب يسببها التخدير انخفاض حرارة الجسم.
3. ضع الماوس على مرحلة أكثر دفئا لذلك يمكن الاحتفاظ بالحرارة وتبقى دافئة عندما يبدأ إجراء الليزر.

2. الماوس التخدير والتحضير المسبق ليزر

1. قبل حقنالتخدير جي، وفحص العين ظاهريا للتأكد من أنه لا يوجد لديه تشوهات أو شذوذ أن يقلل من وضوح القرنية (مثل إعتام عدسة العين).
2. وزن الماوس.
3. سجل الوزن والجنس ورقم الحيوانية.
4. باستخدام الوزن، وحساب كمية مناسبة من مخدر لاستخدامها على أساس المبادئ التوجيهية التي قدمها مؤسسة (على سبيل المثال 100 ملغ / كغ من هيدروكلوريد الكيتامين، 10 ملغ / كغ زيلازين أو ثلاثي بروم إيثانول 250 ملغ / كغ؛ ل20 ز الماوس حقن 0.20 مل زيلازين / الكيتامين كوكتيل OR 0.25 مل من ثلاثي بروم إيثانول). لدينا جدول جرعات محسوبة مسبقا في الوزن في الزيادات من 1 غرام من أجل الحد من الأخطاء الحسابية.
5. القفا الماوس وحقن مخدر تستند البريتونى على حسابات في الخطوة 2.4.
6. ضع الماوس على الحيوانات أكثر دفئا والانتظار حتى يتم تخدير الماوس بشكل كامل عن طريق التحقق من المنعكس دواسة عن طريق قرصة اصبع القدم (حوالي 3-5 دقائق).
7. نشمر عن أنسجة مسح وحماية منطقة الماوس، الأنف لمنع aspiratأيون السائل لفة قبالة. الماوس لفة على جانبها ووضع قطرة (حوالي 30 ميكرولتر) من تتراكائين هيدروكلوريد في كل عين للتخدير الموضعي. الانتظار 2 دقيقة عن حل نافذة المفعول.
8. كرر الخطوة 2.7 مع قطرة واحدة من تروبيكاميد موضعي لالحدقة تمدد. بدلا من ذلك، استخدم هيدروكلوريد فينيليفرين (2.5٪) للتمدد.
9. الانتظار 2 دقيقة عن حلول نافذة المفعول. إبقاء الحيوانات على أكثر دفئا خلال هذا الوقت.
10. بعد انقضاء الوقت المناسب، ضع بسرعة الماوس على المسرح الماوس ووضع المرحلة على بقية الذقن من المصباح الشقي.
11. تشغيل المصباح الشقي إلى أدنى سطوع الضوء وتحقق درجة من الحدقة تمدد. إذا لم يتم المتوسعة التلميذ بشكل كاف (حوالي 2.5-3 مم)، والعودة الماوس للحيوان أكثر دفئا والانتظار. بدلا من ذلك، تدير آخر قطرة من تروبيكاميد. مرة واحدة العين المتوسعة بما فيه الكفاية، والمضي قدما لإجراء الليزر.

3. إجراء الليزر

ملاحظة: تأكد ع الآخرersons في غرفة ارتداء نظارات واقية عندما تكون بعيدا عن محمية الليزر المصباح الشقي العين قطعة

1. ضبط وضع الماوس على مرحلة الماوس، بحيث يتم وضع مثالي لرؤية العصب البصري (انظر 3.1.2).
   1. توجيه الماوس على صاحبها لذلك تقع أفقيا، عموديا على شق شعاع مصباح، مع رئيس في جانب واحد والذيل في الطرف الآخر. ووضع الماوس المثالي جعل البصري التصور الأعصاب أسهل بكثير بمجرد تطبيق زلة تغطية.
   2. تحويل قليلا الماوس لذلك هو في ~ 170 درجة زاوية مع رئيس أقرب إلى مشغل الليزر.
   3. تأكد من أن الفأر هو أقرب ما يكون إلى شق مصباح، ومع ذلك لا يزال في وضع يمكنها من حيث أنها مستقرة وأين سوف يد المشغل لديها مساحة كافية للتلاعب على ما يرام.
2. بعد وضع الماوس بشكل مثالي، وضع قطرة واحدة من حل مصطنعة المسيل للدموع على 25 ملم × 25 ملم الزجاج ساترة.
   1. وضع قطرة واحدة من حل مصطنعة المسيل للدموع على مقابل الفأرالعين osite - ورطب هذا سيضمن العين وتشكيل مساعدة تأخير إعتام عدسة العين.
3. عقد الزاوية ساترة بين الإبهام والأصابع مؤشر. موقف بحيث يتم ضغط الزجاج بين نصائح كل من الأصابع.
4. بلطف التفاف ثلاثة أصابع المتبقية حول جسم الحيوان لدعم وتثبيت اليد. موقف اليد بحيث ساترة الزجاج يمكن وضعها بسهولة على العين الفأر.
   1. مما لا شك فيه أن المعصم يستقر على سطح ثابت من أجل الحد من ناحية الزلزال.
5. مرة واحدة يتم الحصول على وضع مستقر، اضغط بعناية ساترة الزجاج (مع قطرة المسيل للدموع مصطنعة لا يزال الالتزام) على العين الفأر.
   1. تأكد من وضع ساترة كما عمودي ممكن لشعاع الليزر لمنع شعاع الليزر مبعثر أو التأمل. تعمل ساترة كما العدسات اللاصقة لشد القرنية.
6. ننظر من خلال المصباح الشقي ومع يد التركيز تبديل الاتحاد الوطني للعماليمكن تصور الشبكية ايل. سوف الشبكية لديها ضوء أصفر / أحمر اللون اعتمادا على الموقع تصور، ومتميزة، والسفن الحمراء تكون مرئية.
7. ببطء وبعناية التلاعب رئيس الماوس و / أو ساترة حتى تصور العصب البصري. والعصب البصري يكون أصفر اللون مع سفن متعددة يشع منه.
8. مرة واحدة وقد أكد مشغل التصور من العصب البصري، بدوره على الليزر التركيز شعاع.
9. مرة واحدة وقد تحولت شعاع الليزر على، والمناورة ليزر تركز شعاع إلى الموضع المطلوب (حوالي 1 قرص قطره من العصب البصري).
10. تركيز شعاع الليزر على RPE من قاع العين. ويتحقق الخشوع عن طريق الحصول على أشد وأوضح شعاع الليزر. إذا تهدف شعاع يبدو بيضاوي أو خارج التركيز، تبديل التركيز المصباح الشقي أو إعادة الموقف من الزجاج ساترة.
11. بمجرد تركز شعاع تهدف على RPE، والشروع في إدارة يزر باستخدام الزناد القدم الليزر.
    1. تأكد من تجنب الأوعية الشبكية لمنع بالعين انهmorrhage.
12. مشاهدة لظهور فقاعة على الفور بعد تناوله ليزر. يجب أن تكون الخطوط العريضة للطلقة ليزر واضحة وليس ضبابي بأي شكل من الأشكال.
    1. إذا لم يكن نتيجة اطلاق النار ليزر في تشكيل فقاعة، أو مجال تأثير تبدو ضبابية (ظهور غائم مع غير واضحة الحدود الدائري مقابل واضح، حدود محددة تماما من تأثير ناجح)، أو إذا كان ينظر إلى نزيف بعد تناوله ليزر، لا وتشمل هذه الآفات لتحليل المستقبل.
13. كرر الخطوات 3،10-3،12 لجميع المواقف المطلوبة CNV (عادة في 3 و 6 و 9 و 12 وظيفة الساعة حول العصب البصري). إذا تم تطبيق الحث الليزر على نفس المسافة تقريبا من العصب البصري، وينبغي ألا يكون من الضروري إعادة التركيز. ولكن نظرا لانحناء قوي للعين الماوس والاختلافات الصغيرة التي قد تكون موجودة في شبكية العين، إعادة تركيز شعاع قد يكون من الضروري بين الإدارات الليزر متتالية.
14. سجل في دفتر الموقع ونتيجة لهإدارة منظمة العمل ضد الجوع طلقة ليزر ونتيجة (ناجحة، ضبابي، والنزف، الخ.) من كل طلقة تدار للعين. تأكد من وضع الليزر في وضع الاستعداد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
15. كرر 3،1-3،14 عن الماوس، العين الأخرى، إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام الجانب المعاكس لتحقيق الاستقرار وساترة جديدة.
16. بعد تدار عن طلقات الليزر المطلوب، إيقاف الليزر وطولية مصباح.
17. تجاهل ساترة ومكان الماوس على أكثر دفئا للتعافي من التخدير. ظاهريا فحص العين عن أي ضرر ووضع قطرة من محلول المسيل للدموع اصطناعية للحفاظ على العين رطبة وربما منع تطور الساد في المستقبل. عند انتعاش الماوس من التخدير، والعودة إلى القفص.

تركيز المحلول (ملغ / مل) 20

	AVERTIN	AVERTIN	AVERTIN	XYL / KET	XYL / KET
الماوس الوزن (ز)	جرعة (ملغ / كغ)	التخدير جرعة (مل)	جرعة (ملغ / كغ)	التخدير جرعة (مل)
15	250	20	0.1875	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.15
16	250	20	0.2	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.16
17	250	20	0.2125	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.17
18	250	20	0،225	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.18
19	250	20	0.2375	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.19
20	250	20	0.25	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.2
21	250	20	0.2625	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.21
22	250	20	0.275	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.22
23	250	20	0.2875	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.23
24	250	20	0.3	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.24
25	250	20	0.3125	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.25
26	250	20	0،325	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.26
27	250	0.3375	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.27
28	250	20	0.35	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.28
29	250	20	0.3625	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.29
30	250	20	0.375	100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين	0.3

الجدول 1: XyIKet الجرعة الرسم البياني.

النتائج

الكمي للآفات CNV لا يمكن أن يؤديها من خلال تحليل choroids مسطحة شنت باستخدام المناعي تلطيخ لتسمية السفن CNV. طريقتين يعملون في معظم الأحيان من إعداد الأنسجة هي العلامات FITC-ديكستران، يتم عن طريق نضح فورا قبل التضحية بالحيوانات، أو بعد الوفاة المناعية تلطيخ مع علامة الخلية ا?...

Discussion

هناك عوامل متعددة يمكن أن تؤثر على تسليم الليزر والناتجة عن تطوير الآفة CNV بعد نجاح الليزر الاستقراء. يجب السيطرة على هذه العوامل لوموحدة من أجل الحصول على النتائج الأكثر موثوقية. والأكثر أهمية من هذه العوامل هي اختيار الماوس (النمط الجيني والعمر والجنس)، واختيار مخد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm (green) argon ophthalmic laser	IRIDEX	GLx	any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lamp	Carl Zeiss	30SL-M	any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanol	Sigma	T48402-25G	used to make anesthetic
tert-amyl alcohol	Sigma	152463-1L	used to make anesthetic
amber glass vials + septa	Wheaton	WH-223696	tribromoethanol storage
tissue wipes	VWR	82003-820	miscellaneous
1% Tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	pupillary dilation
0.5% Tetracaine hydrochloride	Alcon	0065-0741-12	topical anesthesia
artificial tears	Alcon	58768-788-25	hydration
heat therapy pump (for animal warming)	Kent Scientific	HTP-1500	used to maintain animal body temp
warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510EA	maintains animal body temperature
30 G insulin needles	BD	328418	IP anesthesia injection
scale	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	mouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	flatten cornea to visualize mouse retina
xylazine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
ketamine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
Volocity	PerkinElmer		used for volumetric re-construction
ImageJ	National Institutes of Health		used for image analysis