Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

Resumen

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Resumen

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Introducción

Edad relacionados con la degeneración macular (AMD) es una de las principales causas de ceguera en personas mayores de 50 ^1.3. AMD se puede clasificar en dos formas: atrófica ("secar") y AMD neovascular ("húmeda") de AMD. El primero se caracteriza por la atrofia geográfica del epitelio pigmentario de la retina (RPE), coriocapilar, y los fotorreceptores, mientras que el último se caracteriza por la invasión de vasos anormales de la coroides en las capas externas de la retina causando fugas, hemorragia y fibrosis, y en última instancia que conduce a la ceguera ^1,2. De las dos formas, AMD neovascular da cuenta de la mayoría de la pérdida de visión ^1. Afortunadamente, esta forma tiene numerosas opciones de gestión farmacológicos eficaces, mientras que su contraparte atrófica Actualmente no ha probado los tratamientos médicos ^3. Además, debido a la forma neovascular ha sido re-capitulado fácilmente en un modelo animal, ha sido más ampliamente accesible a A básicaInvestigación MD explorar los mecanismos patológicos subyacentes a fin de desarrollar nuevas terapias ^4.

El primer modelo animal experimental de la neovascularización coroidea (CNV) fue desarrollado por Ryan et al. en primates no humanos ^5. Esta ruptura modelo inducido de la membrana de Bruch a través de la fotocoagulación con láser, lo que provocó una respuesta inflamatoria local dando como resultado en la angiogénesis similar a la observada en neovascular AMD. Se encontró que la progresión histopatológico de la angiogénesis inducción post-láser para imitar la DMAE neovascular, que confirmó la validez del modelo de ^6. Los primates no humanos ofrecer la anatomía más similares a los humanos, pero desafortunadamente, son caros de mantener, no puede ser manipulado fácilmente genéticamente, y tienen un curso lento tiempo de progresión de la enfermedad ^7. En contraste, los modelos de roedores son mucho más rentable para mantener, pueden ser manipulados genéticamente con relativa facilidad, y tienen un mucho más rápido course de progresión de la enfermedad (experimentos pueden llevarse a cabo en una escala de tiempo de semana frente a meses). Estos experimentos solamente deben llevarse a cabo en roedores pigmentadas ya que es muy difícil de visualizar en animales albinos.

El modelo CNV inducida por láser del ratón, primero desarrollado por el grupo Campochiaro a finales del 90 de ^10, se ha convertido en el modelo animal dominante en la mayoría de los estudios recientes ^11-16. Debido a la patogénesis complejo y todavía no está claro de CNV, el modelo de láser se ha aplicado en todos los aspectos de la investigación AMD húmeda que van desde el estudio de los mecanismos moleculares de conducción de la angiogénesis para la evaluación de nuevas modalidades de tratamiento para el futuro uso humano. Por ejemplo, Sakurai et al. y Espinosa-Heidmann et al. utilizado el modelo de láser para investigar el efecto de los macrófagos en el desarrollo de la CNV utilizando ratones transgénicos y los tratamientos farmacológicos de agotamiento ^{15, 16.} Giani et al. y Hoerster et al. usado tomografía óptica de coherencia-(OCT) para la imagen de la CNV en un esfuerzo por caracterizar la progresión de la CNV y comparar los resultados con los hallazgos histopatológicos observados en imágenes de OCT ^12,17 inducida por láser. Finalmente, los estudios que implican la inyección intravítrea de agentes anti-angiogénicos se han utilizado como pre-requisitos para los ensayos en humanos y fueron vitales en el desarrollo de la primera generación de agentes anti-VEGF utilizadas en la gestión de AMD neovascular hoy ^10,18,19.

Modelos alternativos para la CNV experimental utilizan métodos quirúrgicos para inducir la CNV. Este procedimiento implica la inyección de sustancias pro-angiogénicos (por ejemplo, vectores virales recombinantes que sobreexpresan VEGF, inyección subretiniana de células del EPR y / o perlas de poliestireno) para imitar el aumento de la expresión del VEGF se ve en neovascular AMD, con el objetivo de causar la angiogénesis ^8,20. Sin embargo, este método produce una incidencia drásticamente inferior de la neovascularización; estos estudios mostraron que en la CNVRatones C57 / BL6 se produce en 31% de las inyecciones frente al ~ 70% de éxito visto en el método de la fotocoagulación con láser en la misma cepa de ratones ^8,14. Por estas razones, y dadas las ventajas del uso de roedores en comparación con primates no humanos, el modelo de ratón de la CNV inducida por láser se ha convertido en el modelo animal estándar para la mayoría de CNV neovasculares experimentos de estudio de AMD ^8.

El ojo es un ratón, delicado tejido minúsculo para trabajar. Maniobras del ojo para visualizar la retina es difícil y requiere mucha práctica hasta que se alcanza la maestría. Esta tarea se complica por el hecho de que debe ser aprendido con la mano dominante y no dominante. Por otra parte, después de que los finos movimientos necesarios para visualizar la retina se han aprendido, la coordinación entre ambas manos y el pedal de funcionamiento del láser son importantes. En este trabajo, hemos tratado de destilar los desafíos de aprender todas las manipulaciones físicas involucradas en la CNV proc inducida por láseredure en una guía que ayudará a los operadores a lograr un rápido éxito con este modelo.

Protocolo

Todos los animales son tratados de acuerdo con la Guía del Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 2013 Edition, la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y aprobada por el Animal Institucional Cuidado y el empleo Comisión de la Universidad Northwestern.

Nota: El siguiente procedimiento se puede realizar en su totalidad con un operador; sin embargo, se llevó a cabo mucho más eficiente con dos operadores con las tareas se dividen en consecuencia.

1. Prepare la estación láser y Pre-láser

1. Coloque el láser y lámpara de hendidura donde puede ser fácilmente accesible. A su vez en láser y ajustado a los parámetros predeterminados (por ejemplo, 75 micras de tamaño punto, 100 mW de potencia, 100 ms de duración).
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el operador lleva todas las señales de seguridad láser animales y equipo de protección personal y de seguridad láser pertinente se muestran fuera de la sala de procedimientos.
   1. Antes de usar cualquier animales de experimentación, encontrar parámetros ideales utilizando una calibración, el ratón no experimental. Los parámetros del láser dependerá del láser utilizado. Ideal parámetros son definidos por el ajuste de la potencia del láser más bajo que hace que constantemente la formación de "burbuja" cuando se enfoca correctamente. Ver video de ejemplo de lesión con la formación adecuada "burbuja".
2. Prepare la estación de pre-láser de modo que la anestesia, todas las gotas para los ojos (tropicamida, tetracaína, y lágrimas artificiales) animales más cálido, toallitas de tejidos, y son fácilmente a su alcance para el operador.
   1. Asegúrese de que los animales más cálido se precalienta para corregir la temperatura (37 ° C) antes de la inyección de anestésico en primer ratón con el fin de evitar la hipotermia inducida por anestesia.
3. Coloque etapa del ratón en más cálido por lo que puede retener el calor y permanecer caliente una vez que comience el procedimiento láser.

2. Ratón Anestesia y Preparación Pre-láser

1. Antes de inyectaring anestesia, inspeccione el ojo macroscópicamente para asegurarse de que no tiene deformaciones o anomalías que disminuyen la claridad de la córnea (por ejemplo, cataratas).
2. Pesar ratón.
3. Apunte el peso, el sexo y el número de identificación de los animales.
4. Usando peso, calcular la cantidad adecuada de anestesia que se utilizará en base a las directrices dadas por la institución (por ejemplo, 100 mg / kg de clorhidrato de ketamina, 10 mg / kg de xilazina O tribromoetanol 250 mg / kg; para un ratón de 20 g inyectar 0,20 ml de xilazina / cóctel de ketamina O 0,25 ml de tribromoetanol). Tener una tabla de dosis previamente calculado por peso en incrementos de 1 g con el fin de reducir los errores matemáticos.
5. Scruff ratón e inyectar anestesia intraperitoneal basan en cálculos del paso 2.4.
6. Coloca el ratón sobre los animales más cálido y espere hasta que el ratón está completamente anestesiado marcando el reflejo pedal a través pizca dedo del pie (aproximadamente 3-5 minutos).
7. Enrolle un tejido limpiar y proteger la zona nasal del ratón para evitar que aspiratión de líquido roll-off. Ratón rollo en su lado y colocar una gota (aproximadamente 30 l) de clorhidrato de tetracaína en cada ojo para la anestesia tópica. Espere 2 minutos para la solución tenga efecto.
8. Repita el paso 2.7 con una gota de tropicamida tópico para la dilatación pupilar. Como alternativa, utilice clorhidrato de fenilefrina (2,5%) para la dilatación.
9. Espere 2 minutos para las soluciones que se apliquen; mantener a los animales en el más cálido durante este tiempo.
10. Una vez transcurrido el tiempo adecuado, colocar rápidamente el ratón en el escenario del ratón y colocar la etapa en la barbilla resto de lámpara de hendidura.
11. Encienda la lámpara de hendidura para el brillo de la luz más baja y comprobar el grado de dilatación pupilar. Si alumno no se dilata de manera adecuada (aproximadamente 2,5 a 3 mm), devuelva ratón para animales más caliente y esperar. Alternativamente, administrar otra gota de tropicamida. Una vez que el ojo es suficientemente dilatada, continúe con el procedimiento con láser.

Procedimiento 3. Láser

Nota: Asegúrese de otra personas en la sala de llevar gafas de protección cuando están lejos de láser protegido lámpara de hendidura ocular

1. Ajuste la colocación del ratón en la etapa del ratón, por lo que está en una posición ideal para la visualización de nervio óptico (ver 3.1.2).
   1. Oriente el ratón sobre su soporte de manera que quede en posición horizontal, perpendicular a la hendidura del haz de la lámpara, con la cabeza en un lado y la cola en el otro. Colocación Ideal ratón hará que la visualización del nervio óptico mucho más fácil una vez que se aplica hoja de la cubierta.
   2. Ligeramente gire el ratón por lo que es en un ángulo de 170 ° ~ con la cabeza más cerca de operador de láser.
   3. Asegúrese de que el ratón es tan cerca como sea posible de la lámpara de hendidura, sin embargo, todavía en una posición en la que es estable y donde la mano del operador tendrá espacio suficiente para la manipulación fina.
2. Después de que el ratón está en una posición ideal, coloque una gota de solución de lágrimas artificiales en un 25 mm x 25 mm cubreobjetos de vidrio.
   1. Coloque una gota de solución de lágrima artificial en del opp del ratónojo osite - este ojo se asegurará se hidrata y la formación ayuda retardo de cataratas.
3. Mantenga esquina de cubreobjetos entre el pulgar y los dedos de puntero; posición de modo que el vidrio se comprime entre las puntas de los dedos de ambas.
4. Envolver suavemente los tres dedos restantes en todo el cuerpo del animal para el apoyo y la estabilización mano. Posición de la mano de modo que el cubreobjetos de vidrio se puede colocar fácilmente en el ojo del ratón.
   1. Asegúrese de que la muñeca se estabiliza en una superficie firme con el fin de reducir el temblor de las manos.
5. Una vez que se obtiene la posición estable, presione con cuidado cubreobjetos de vidrio (con la gota de lágrima artificial todavía adherido) en el ojo del ratón.
   1. Asegúrese de que el cubreobjetos se coloca lo más perpendicular posible al rayo láser con el fin de prevenir la dispersión de haz de láser o la reflexión. El cubreobjetos actúa como una lente de contacto para aplanar la córnea.
6. Mira a través de la lámpara de hendidura y con la mano libre de palanca centrarse untretina il se pueden visualizar. La retina tendrá un color claro-amarillo / rojo dependiendo de la ubicación visualizada, vasos, rojas definidas serán visibles.
7. Poco a poco y con cuidado manipular cabeza de ratón y / o cubreobjetos hasta visualizar el nervio óptico. El nervio óptico será de color amarillo con múltiples vasos que irradian de él.
8. Una vez que el operador ha confirmado la visualización del nervio óptico, encienda el láser de enfoque del haz.
9. Una vez que haz de láser se ha encendido, maniobrar enfoque del láser de haz a la posición deseada (aproximadamente 1 diámetro del disco del nervio óptico).
10. Enfoque rayo láser en la RPE del fondo de ojo. El enfoque correcto se logra haciendo que el rayo láser más nítida y más clara. Si el objetivo del haz se ve oval o fuera de foco, alternar el foco de la lámpara de hendidura o colocar cubreobjetos de vidrio.
11. Una vez que el haz de encuadre se centra en RPE, iniciar la administración láser utilizando gatillo pie del láser.
    1. Asegúrese de evitar los vasos de la retina para prevenir intraocular quemorrhage.
12. Atento a la aparición de una burbuja inmediatamente después de la administración láser. El contorno de la disparo de láser debe ser clara y no turbia de ninguna manera.
    1. Si el disparo de láser no da lugar a la formación de burbujas, o área de impacto se ve nebuloso (aspecto turbio con borde circular mal definido vs. clara frontera claramente definida de un impacto con éxito), o si la hemorragia es visto después de la administración de láser, NO incluir estas lesiones para el análisis futuro.
13. Repita los pasos 03.10 a 03.12 para todas las posiciones deseadas de la CNV (por lo general a las 3, 6, 9, y 12 en punto alrededor del nervio óptico). Si se aplican las inducciones láser en aproximadamente misma distancia del nervio óptico, el nuevo enfoque no debería ser necesario. Sin embargo, debido a la fuerte curvatura del ojo del ratón y pequeñas variaciones que puedan existir en la retina, la reorientación de la viga puede ser necesario entre las administraciones de láser consecutivos.
14. Grabar en un cuaderno la ubicación y el resultado de correoadministración disparo de láser ada y resultado (éxito, nebuloso, hemorragia, etc.) de cada disparo se administra para el ojo. Asegúrese de colocar el láser en modo de espera cuando no esté en uso.
15. Repita 03/01 a 03/14 para el ratón del otro ojo, si es necesario, usando la mano opuesta para la estabilización y un nuevo cubreobjetos.
16. Después se administran todos los disparos de láser deseados, apague láser y con lámpara de hendidura.
17. Deseche cubreobjetos y el lugar del ratón en más cálido para la recuperación de la anestesia. Macroscópicamente inspeccionar ojo por cualquier lesión y colocar una gota de solución de lágrimas artificiales para mantener el ojo hidratado y potencialmente prevenir futuro desarrollo de cataratas. Una vez que el ratón se recupere de la anestesia, volver a la jaula.

	AVERTIN	AVERTIN	AVERTIN	XYL / KET	XYL / KET
Ratón Peso (g)	Dosis (mg / kg)	concentración de la solución (mg / ml)	Dosis anestésico (ml)	Dosis (mg / kg)	Dosis anestésico (ml)
15	250	20	0.1875	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.15
16	250	20	0.2	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.16
17	250	20	0.2125	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.17
18	250	20	0,225	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.18
19	250	20	0.2375	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.19
20	250	20	0.25	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.2
21	250	20	0.2625	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.21
22	250	20	0,275	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.22
23	250	20	0.2875	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.23
24	250	20	0.3	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.24
25	250	20	0.3125	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.25
26	250	20	0,325	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.26
27	250	20	0.3375	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.27
28	250	20	0.35	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.28
29	250	20	0.3625	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.29
30	250	20	0,375	100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina	0.3

Tabla 1: Dosis XyIKet Chart.

Resultados

La cuantificación de las lesiones CNV se puede realizar mediante el análisis de coroides-plana montada utilizando la tinción de inmunofluorescencia para etiquetar los vasos de la CNV. Los dos métodos utilizados con mayor frecuencia de la preparación del tejido son etiquetado FITC-dextrano, hecho a través de la perfusión inmediatamente antes del sacrificio de los animales, o post-mortem inmuno-tinción con un marcador de células endoteliales. Ambos métodos se han descrito anteriormente en detalle ^{13,14,21;<...}

Discusión

Existen múltiples factores que pueden afectar la entrega de láser y la consiguiente desarrollo de la lesión NVC tras éxito láser inducción. Estos factores deben ser controlados por y estandarizados con el fin de tener los resultados más confiables. El más pertinente de estos factores son la selección del ratón (genotipo, edad y sexo), la selección de anestésico, y la configuración de láser.

El modelo específico de ratón utilizada puede tener un efecto significativo en el curs...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm (green) argon ophthalmic laser	IRIDEX	GLx	any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lamp	Carl Zeiss	30SL-M	any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanol	Sigma	T48402-25G	used to make anesthetic
tert-amyl alcohol	Sigma	152463-1L	used to make anesthetic
amber glass vials + septa	Wheaton	WH-223696	tribromoethanol storage
tissue wipes	VWR	82003-820	miscellaneous
1% Tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	pupillary dilation
0.5% Tetracaine hydrochloride	Alcon	0065-0741-12	topical anesthesia
artificial tears	Alcon	58768-788-25	hydration
heat therapy pump (for animal warming)	Kent Scientific	HTP-1500	used to maintain animal body temp
warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510EA	maintains animal body temperature
30 G insulin needles	BD	328418	IP anesthesia injection
scale	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	mouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	flatten cornea to visualize mouse retina
xylazine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
ketamine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
Volocity	PerkinElmer		used for volumetric re-construction
ImageJ	National Institutes of Health		used for image analysis