Lazer kaynaklı Koroid Neovaskülarizasyonlarında A Fare Modeli

Özet

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Özet

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Giriş

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) 50 ^1-3 yaş üstü bireylerde körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. AMD iki formda sınıflandırılabilir: atrofik ("kurutmak") AMD ve neovasküler ("ıslak") AMD. Eski ikinci sızıntı, kanama ve fibrozis neden dış retina katmanlarının içine koroid anormal damarların işgali ile karakterize edilirken, retina pigment epiteli (RPE), koriokapillaris ve fotoreseptör coğrafi atrofi ile karakterize ve sonuçta bir körlük ^1,2 yol açar. İki formları, neovasküler AMD görme kaybı ¹ çoğunluğu oluşturuyor. Onun atrofik muadili şu anda hiçbir tıbbi tedaviler ³ kanıtlamıştır oysa Neyse ki, bu form sayısız etkili farmakolojik tedavi seçenekleri vardır. Neovasküler formu kolaylıkla bir hayvan modelinde yeniden teslim oldu edilmiştir çünkü Ayrıca, temel A'ya daha yaygın olarak erişilebilir olmuşturYeni tedaviler ⁴ geliştirmek için altta yatan patolojik mekanizmaların keşfetmek MD araştırma.

Deneysel koroid neovaskülarizasyon (KNV) ilk hayvan modeli Ryan ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. insan olmayan primatlar ^5. Neovasküler AMD görülene benzer anjiyojenez ile sonuçlanan bir lokal enflamatuar bir yanıt neden olduğu lazer fotokoagülasyon ile Bruch zarının Bu model bağlı kopma. Anjiyogenez sonrası lazer indüksiyon histopatolojik ilerleme modelinin geçerliliğini ⁶ doğruladı neovasküler AMD, taklit bulunmuştur. Insan olmayan primatlar insanlara en çok benzeyen anatomi sunuyoruz, ama ne yazık ki, kolayca genetik manipüle edilemez, bakımı pahalı ve hastalığın ilerlemesi ⁷ yavaş bir zaman kursumuz var. Buna karşın bir, kemirgen modelleri çok daha düşük maliyetli sürdürmek, genetik göreli kolaylıkla manipüle edilebilir, ve cou hızlı bir çok şey varhastalık ilerlemesinin rse (deney ay karşısında haftalık bir zaman ölçeğinde yapılabilir). Bu albino hayvanlarda görselleştirmek için çok zor olduğu gibi bu deneyler sadece pigmentli kemirgenlerde yapılmalıdır.

İlk sonlarında 90 en ¹⁰ Campochiaro grubu tarafından geliştirilen fare lazer kaynaklı CNV modeli, son çalışmalar ^11-16 çoğunda baskın bir hayvan modeli olarak büyümüştür. Nedeniyle CNV karmaşık ve hala belirsiz patogenez, lazer modeli gelecekte insan kullanımı için yeni tedavi modaliteleri değerlendirmek için anjiyogenez sürüş moleküler mekanizmaları inceleyerek kadar ıslak AMD araştırma tüm yönleriyle uygulanmıştır. Örneğin, Sakurai ve diğ. ve Espinoza-HEIDMANN ve diğ. transgenik fareler ve farmakolojik tükenme tedavileri ^{15, 16} kullanılarak KNV gelişimi üzerine makrofajlar etkisini araştırmak için lazer modeli kullanılır. Giani ve ark. ve Hoerster diğ. görüntüye kullanılan optik koherens tomografi (OCT) lazer kaynaklı KNV ilerlemesini karakterize ve Ekim görüntüleme ^12,17 görülen bulgulara histopatolojik bulguları karşılaştırmak için bir çaba CNV. Son olarak, anti-anjiyogenik ajanlar intravitreal enjeksiyonunu içeren çalışmalar insan denemeleri için ön koşul olarak kullanılan ve neovasküler AMD ^10,18,19 yönetiminde kullanılan anti-VEGF ajanların ilk nesil gelişmekte hayati önem oylandı.

Deneysel CNV için alternatif modeller KNV ikna etmek için cerrahi yöntemler kullanmaktadır. Bu prosedür, pro-anjiyojenik maddeler enjekte içerir (VEGF aşırı eksprese eden örneğin, rekombinant viral vektörler, RPE hücreleri ve / veya polistiren boncuklar subretinal enjeksiyon) anjiyojenezi ^8,20 neden amacıyla, neovasküler AMD görülen artış olarak VEGF ifadesini taklit etmek. Bununla birlikte, bu yöntem, neovaskülarizasyonun büyük ölçüde düşük bir oranda verir; Bu çalışmalar, bu KNV gösterdiC57 / BL6 fareleri iki ayrı fare ^8,14 aynı gerginlik lazer fotokoagülasyon yönteminde görülen ~% 70 başarı oranı karşı enjeksiyonlar 31% 'unda görülür. Bu nedenlerden dolayı, ve insan olmayan primatlar karşı kemirgenler kullanmanın avantajları göz önüne alındığında, lazer kaynaklı KNV'ların fare modeli en neovasküler AMD çalışma deneyleri ⁸ KNV'nin standart hayvan modeli haline gelmiştir.

Fare gözü ile çalışmak için bir minik, narin bir dokudur. Retina görselleştirmek için göz Manevra zordur ve ustalık elde edilene kadar çok pratik gerektirir. Bu görev hakim ve baskın olmayan el ile öğrenmiş olmalıdır gerçeği ile karmaşık. Retina görselleştirmek için gerekli ince hareketleri öğrenmiş edildikten sonra Dahası, her iki el ve lazer işletim ayak pedalı arasındaki koordinasyon önemlidir. Bu yazıda, lazer kaynaklı KNV yordam katılan fiziksel manipülasyonlar tüm öğrenme zorlukları damıtmak çalıştıoperatörler bu model ile hızlı bir başarı elde yardımcı olacak bir rehber haline edure.

Protokol

Tüm hayvanlar Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım 2013 Edition Kılavuzu uyarınca tedavi edilir, Görme ve Oftalmoloji (ARVO) Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım Tablosu Araştırma Derneği ve Kurumsal Hayvan tarafından onaylanmış Bakım ve Northwestern Üniversitesi için kullanın Komitesi.

Not: Aşağıdaki prosedür bir operatör tamamen yapılabilir; görevler buna göre bölünmüş olan ancak çok daha verimli iki operatörleri ile yapılmaktadır.

1. Lazer ve Ön lazer Station hazırlayın

1. Kolayca erişilebilir olabilir lazer ve yarık lamba yerleştirin. Lazer açın ve parametrelerini ayarlamak önceden belirlenmiş (örneğin 75 mikron spot büyüklüğü, 100 mW güç, 100 milisaniye süre).
   DİKKAT: emin olun operatör tüm hayvan ve lazer güvenlik, kişisel koruyucu ekipman ve ilgili lazer güvenlik işaretleri prosedür odası dışında görüntülenen giyer.
   1. Herhangi bir deneysel hayvan kullanmadan önce, bir kalibrasyon, deneysel olmayan fareyi kullanarak İdeal parametreler bulmak. Lazer parametreleri kullanılan lazer bağlıdır. İdeal parametreleri düzgün odaklı olduğunda sürekli "balon" oluşmasına neden olur düşük lazer güç ayarı tarafından belirlenir. Uygun "balon" oluşumu ile lezyonun örneğin videoyu izleyin.
2. Anestezi, sıcak hayvan, doku mendil ve tüm göz damlaları (Tropikamid, Tetrakain ve yapay gözyaşı) operatöre ulaşılabilecek kolayca böylece ön lazer istasyonu hazırlayın.
   1. Hayvan sıcak olun olup anestezi kaynaklı hipotermi önlemek için ilk fare içine anestezik enjekte önce sıcaklık (37 ° C) düzeltmek için önceden ısıtılmış.
3. Isı tutma ve lazer işlemi başladıktan sonra sıcak kalabilir, böylece sıcak fare sahne yerleştirin.

2. Fare Anestezi ve Pre-lazer Hazırlık

1. Enjekte önceanestezi ing, hiçbir deformiteleri veya kornea netlik (örn katarakt) azaltmak anormallikleri vardır sağlamak için makroskopik göz inceleyin.
2. Fareyi tartılır.
3. Tutanak ağırlığı, cinsiyet, ve hayvan kimlik numarası.
4. 20 g bir fare için, 0.20 ml ksilazin / Ketamin Kokteyli enjekte; ağırlığı kullanılarak, anestezi, uygun miktarda hesaplamak 10 mg / kg ksilazin TD tribromoethanol 250 mg / kg (örneğin, 100 mg / kg ketamin hidroklorür kurum tarafından verilen ilkelere dayalı olarak kullanılmak üzere tribromoethanol OR 0.25 mi). Matematiksel hatalarını azaltmak amacıyla 1 g artışlarla ağırlığı başına önceden hesaplanmış dozajların bir tablo yazıldı.
5. Scruff fare ve enjekte anestezi intraperitoneal adımda 2.4 hesaplamalara dayalı.
6. Sıcak hayvan fare yerleştirin ve fare tamamen ayak tutam (yaklaşık 3-5 dakika) yoluyla pedal refleksini kontrol ederek anestezi kadar bekleyin.
7. Silin, bir doku Roll up ve Aspirat önlemek için farenin burun alanını korumakSıvı roll-off iyon. Rulo yan fare ve topikal anestezi için her bir göz içine tetrakain hidroklorür damla (yaklaşık 30 ul) yerleştirin. Çözelti etkili olması için 2 dakika bekleyin.
8. Pupil dilatasyonu topikal tropikamid bir damla adımı yineleyin 2.7. Seçenek olarak ise, dilatasyon fenilefrin hidroklorür (% 2.5) kullanımı.
9. Çözümler etkili olması için 2 dakika bekleyin; Bu süre boyunca sıcak üzerinde hayvan tutun.
10. Uygun zaman geçtikten sonra, hızlı bir şekilde fare sahnede fare koyun ve yarık lamba çene geri kalanı sahne yerleştirin.
11. Düşük ışık parlaklığına biyomikroskopta açın ve pupilla dilatasyonu derecesini kontrol edin. Öğrenci yeterince (yaklaşık 2,5-3 mm) dilate değilse, sıcak hayvana fare dönmek ve bekleyin. Alternatif olarak, tropikamid başka damla yönetmek. Göz yeterince dilate sonra, lazer prosedürüne devam edin.

3. Lazer Prosedürü

Not: Diğer p emin olunersons odasında lazer korumalı yarık lamba göz parçasından uzakta koruyucu gözlük

1. Bu ideal optik sinir görselleştirme (3.1.2 bakınız) konumlandırılmış böylece fare sahnede fare yerleşimini ayarlayın.
   1. Yatay yatıyor böylece diğer azından bir tarafında baş ve kuyruk, lamba ışın yarık dik, sahibine fare yönlendirmek. İdeal fare yerleştirme kapak kayma uygulandıktan sonra çok daha kolay optik sinir görselleştirme yapacaktır.
   2. Daha yakın lazer operatörü baş bir ~ 170 ° 'lik açıyla yani hafifçe fare çevirin.
   3. Kararlı ve nerede operatörün eli ince manipülasyon için yeterli alana sahip olacak olduğu bir pozisyonda yine lambayı yarık henüz mümkün olduğunca o fare kadar yakın olduğundan emin olun.
2. Fare ideal yerleştirilmesinden sonra, bir 25 mm x 25 mm ebadındaki bir cam lamel yapay gözyaşı çözeltisi bir damla yerleştirin.
   1. Farenin opp suni gözyaşı çözümün bir damla yerleştirinosite göz - Bu sağlayacaktır göz sulu ve yardım gecikme katarakt olduğunu.
3. Başparmak ve işaretçi parmakları arasında lamel köşesini tutun; konumu ve böylece cam iki parmak uçları arasında sıkılır.
4. Yavaşça destek ve el stabilizasyonu için hayvanın vücudu etrafında kalan üç parmaklarını sarın. Pozisyon eli böylece cam lamel kolayca farenin göze yerleştirilebilir.
   1. Bilek El titreme azaltmak için sağlam bir yüzey üzerinde stabilize olduğundan emin olun.
5. Kararlı pozisyon elde edildikten sonra, dikkatle farenin gözün üzerine (hala yapışık yapay gözyaşı damla ile) cam lamel basın.
   1. Lamel lazer ışını yayılımını veya yansımasını önlemek amacıyla lazer ışını mümkün olduğunca dik olarak konumlandırılmış emin olun. Lamel kornea düzleştirmek için bir kontakt lens gibi davranır.
6. Toggle unt odak yarık lamba ile ve serbest el ile bakmakil retina görülebilir. Retina görüntülenmiştir yere bağlı açık sarı / kırmızı renk olacak, farklı, kırmızı damarlar görünür olacaktır.
7. Yavaş ve dikkatli bir optik siniri görüntülenmesi kadar fare kafasını ve / veya lamel işlemek. Optik sinir o yayılan çok sayıda gemi ile, sarı renkli olacaktır.
8. Operatör optik sinirin görselleştirme onaylamıştır sonra, ışın odaklama lazeri açın.
9. Lazer ışını açıldıktan sonra, istenilen pozisyona (optik sinir yaklaşık 1 disk çapı) ışını odaklama lazer manevra.
10. Göz fundus RPE üzerinde lazer ışınını odaklanın. Uygun odak keskin ve net lazer ışını sahip sağlanır. Işını amaçlayan yarık lamba odak veya yeniden pozisyon cam lamel geçiş, oval ya da odak dışı görünüyorsa.
11. Hedefleme ışını RPE odaklanmıştır sonra, lazerin ayak tetiği kullanarak lazer yönetimini başlatmak.
    1. Intraoküler önlemek için retina damarları önlemek için emin olun oraji.
12. Hemen lazer uygulamasından sonra bir kabarcığın görünüm için izleyin. Lazer atış hatları net ve hiçbir şekilde puslu olmamalıdır.
    1. Lazer atış kabarcığı oluşumuna yol açmaz ise, ya da darbe alan (genel ort başarılı etkisi net, keskin tanımlı sınırına kötü tanımlanmış dairesel kenarlıklı bulutlu bir görünüm) puslu görünüyor, ya da kanama lazer uygulamasından sonra görülürse, DEĞİL yapmak gelecek analizi için bu lezyonlar bulunur.
13. Tekrarlayın istenen tüm CNV pozisyonları için 3.10-3.12 (genellikle 3'te, 6, 9, ve optik sinir etrafında 00:00 pozisyonları) yineleyin. Lazer indüksiyonlar optik sinir yaklaşık aynı mesafede uygulanırsa, yeniden yoğunlaşma gerekli olmamalıdır. Ancak, retina bulunabilecek ışını refocusing ardışık lazer idareleri arasında gerekli olabilir fare göz ve küçük değişimlerin güçlü eğrilik.
14. Bir dizüstü konumu ve e sonucu rekorach lazer atış idaresi ve sonuç (başarılı, puslu, kanama vb.) göz için her uygulanan vurdu. Kullanılmadığı zaman stand-by modunda lazer yerleştirmek emin olun.
15. Gerekirse istikrar ve yeni bir lamel için ters elinizi kullanarak, fare, diğer göz için 3.1-3.14 tekrarlayın.
16. İstenen tüm lazer çekim uygulanır sonra lazer kapatın ve yarık-lamba.
17. Anestezi kurtarma için sıcak üzerinde lamel ve yer fareyi atın. Makroskobik herhangi bir yaralanma için göz kontrol ve sulandırılmış göz tutmak ve potansiyel gelecek katarakt gelişimini önlemek için yapay gözyaşı çözümün bir damla yerleştirin. Fare anestezi kurtarır sonra kafese geri döner.

	AVERTIN	AVERTIN	AVERTIN	XYL / KET	XYL / KET
Fare Ağırlık (g)	Doz (mg / kg)	Çözelti konsantrasyonu (mg / ml)	Anestetik doz (mi)	Doz (mg / kg)	Anestetik doz (mi)
15	250	20	0,1875	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.15
16	250	20	0,2	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.16
17	250	20	0,2125	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.17
18	250	20	0.225	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.18
19	250	20	0,2375	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.19
20	250	20	0.25	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0,2
21	250	20	0,2625	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.21
22	250	20	0.275	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.22
23	250	20	0,2875	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.23
24	250	20	0.3	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.24
25	250	20	0.3125	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.25
26	250	20	0.325	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.26
27	250	20	0,3375	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.27
28	250	20	0.35	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.28
29	250	20	0,3625	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.29
30	250	20	0.375	100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin	0.3

Tablo 1: XyIKet Doz Şeması.

Sonuçlar

KNV lezyonlarının Niceleme CNV gemileri etiket immünoflüoresans boyama kullanarak düz monte choroids analizi yoluyla yapılabilir. Doku hazırlık iki en sık kullanılan yöntemler hemen endotel hücre işaretleyici ile hayvan kurban, ya da ölüm sonrası immün boyama önce perfüzyon yoluyla yapılan FITC-dekstran etiketleme vardır. Bu yöntemlerin ikisi de detaylı ^13,14,21 daha önce tarif edilmiştir, sırasıyla her biri 1 ve 2 örneklerini gös...

Tartışmalar

Başarılı lazer indüksiyon sonrası lazer teslimat ve sonuçtaki KNV lezyon gelişimini etkileyen birden fazla faktör vardır. Bu faktörler kontrollü ve en güvenilir sonuçlar elde etmek için standardize edilmelidir. Bu faktörlerin en uygun fare seçimi (genotipi, yaş, cinsiyet ve), anestezik seçimi, ve lazer ayarları vardır.

Kullanılan özel fare modeli KNV gelişme seyri üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. En yaygın olarak kullanılan genotip C57BL / 6 faredir. Hayv...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm (green) argon ophthalmic laser	IRIDEX	GLx	any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lamp	Carl Zeiss	30SL-M	any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanol	Sigma	T48402-25G	used to make anesthetic
tert-amyl alcohol	Sigma	152463-1L	used to make anesthetic
amber glass vials + septa	Wheaton	WH-223696	tribromoethanol storage
tissue wipes	VWR	82003-820	miscellaneous
1% Tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	pupillary dilation
0.5% Tetracaine hydrochloride	Alcon	0065-0741-12	topical anesthesia
artificial tears	Alcon	58768-788-25	hydration
heat therapy pump (for animal warming)	Kent Scientific	HTP-1500	used to maintain animal body temp
warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510EA	maintains animal body temperature
30 G insulin needles	BD	328418	IP anesthesia injection
scale	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	mouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	flatten cornea to visualize mouse retina
xylazine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
ketamine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
Volocity	PerkinElmer		used for volumetric re-construction
ImageJ	National Institutes of Health		used for image analysis