Un modèle de souris pour induite par laser néovascularisation choroïdienne

Résumé

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Résumé

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Introduction

La dégénérescence maculaire (AMD) liée à l'âge est l'un des principales causes de cécité chez les personnes âgées de plus de 50 ^1-3. AMD peut être classée en deux formes: atrophique ("sec") et AMD néovasculaire («humide») AMD. Le premier est caractérisé par une atrophie géographique de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), choriocapillaire et photorécepteurs, tandis que le second est caractérisé par l'invasion de vaisseaux anormaux de la choroïde dans les couches rétiniennes externes provoquer une fuite, une hémorragie, et la fibrose, et, finalement, conduisant à la cécité ^1,2. Parmi les deux formes, la DMLA néovasculaire représente la majorité de la perte de vision ^1. Heureusement, cette forme a de nombreuses options de gestion pharmacologiques efficaces, tandis que son homologue atrophique a actuellement pas prouvé traitements médicaux ^3. En outre, parce que la forme néovasculaire a été facilement ré-capitulé dans un modèle animal, il a été plus largement accessible à A baseRecherche MD explorer les mécanismes pathologiques sous-jacents afin de développer de nouvelles thérapies ^4.

Le premier modèle animal expérimental de la néovascularisation choroïdienne (NVC) est développé par Ryan et al. dans des primates non humains ^5. Ce modèle de rupture induite par la membrane de Bruch par photocoagulation au laser, ce qui a provoqué une réponse inflammatoire locale résultant dans l'angiogenèse similaire à celui observé dans la DMLA néovasculaire. La progression histopathologique de l'angiogenèse post-induction laser a été trouvé pour imiter la DMLA néovasculaire, qui a confirmé la validité du modèle ^6. Les primates non humains offrir l'anatomie la plus proche de l'homme, mais, malheureusement, sont coûteux à entretenir, ne peut pas être facilement manipulées génétiquement, et avoir un cours de temps lente progression de la maladie ^7. Par contraste, des modèles de rongeurs sont beaucoup plus rentable de maintenir, peuvent être manipulées génétiquement avec une relative facilité, et ont une beaucoup plus rapide course de progression de la maladie (les expériences peuvent être effectuées sur une échelle de temps de semaine contre mois). Ces expériences ne doivent être effectués chez les rongeurs pigmentées car il est très difficile de visualiser chez les animaux albinos.

Le modèle CNV souris induit par laser, d'abord développé par le groupe Campochiaro dans la fin des années 90 ^{à 10,} a grandi pour devenir le modèle animal dominant dans la majorité des études récentes ^11-16. En raison de la pathogénie complexe et encore peu claire de CNV, le modèle laser a été appliquée dans tous les aspects de la recherche DMLA humide allant de l'étude des mécanismes moléculaires de conduite angiogenèse à l'évaluation de nouvelles modalités thérapeutiques à usage humain avenir. Par exemple, Sakurai et al. et Espinosa-Heidmann et al. utilisé le modèle de laser pour étudier l'effet des macrophages sur le développement de la CNV en utilisant des souris transgéniques et des traitements pharmacologiques d'appauvrissement ^{15, 16.} Giani et al. et Hoerster et al. utilisé la tomographie par cohérence optique (OCT) à l'image de la CNV dans un effort pour caractériser la progression de la CNV et comparer les résultats histopathologiques aux résultats observés sur imagerie OCT ^12,17 induite par laser. Enfin, des études impliquant l'injection intravitréenne d'agents anti-angiogéniques ont été utilisés comme pré-requis pour les essais sur l'homme et ont été vital dans le développement de la première génération d'agents anti-VEGF utilisés dans la gestion de la DMLA néovasculaire aujourd'hui ^10,18,19.

Des modèles alternatifs pour expérimentale CNV utilisent des méthodes chirurgicales pour induire CNV. Cette procédure consiste à injecter les substances pro-angiogéniques (par exemple des vecteurs viraux recombinants surexprimant VEGF, injection sous-rétinien de cellules RPE et / ou des billes de polystyrène) pour imiter l'expression accrue de VEGF vu dans la DMLA néovasculaire, dans le but de provoquer l'angiogenèse ^8,20. Cependant, cette méthode donne une fréquence considérablement plus faible de la néovascularisation; ces études ont montré que dans CNVSouris C57 / BL6 se produit dans 31% des injections contre la ~ taux de réussite de 70% vu dans la méthode de la photocoagulation au laser dans la même souche de souris ^8,14. Pour ces raisons, et compte tenu des avantages de l'utilisation des rongeurs contre des primates non humains, le modèle de souris de CNV induite par laser est devenu le modèle animal de la norme pour la plupart CNV DMLA néovasculaire expériences d'étude ^8.

L'œil de la souris est un tissu délicat minuscule de travailler avec. Manœuvre de l'œil de visualiser la rétine est difficile et nécessite beaucoup de pratique jusqu'à ce que la maîtrise est atteint. Cette tâche est compliquée par le fait qu'il doit être appris avec la main dominante et non dominante. En outre, après les mouvements fins nécessaires pour visualiser la rétine ont été tirées, la coordination entre les deux mains et la pédale de commande de fonctionnement du laser sont importants. Dans cet article, nous avons cherché à distiller les défis de l'apprentissage de toutes les manipulations physiques impliqués dans la CNV proc induite par laseredure dans un guide qui aiderait les opérateurs à atteindre un succès rapide avec ce modèle.

Protocole

Tous les animaux sont traités en conformité avec le Guide de l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire édition 2013, l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) Déclaration pour l'utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research, et approuvée par l'animal institutionnel Entretien et utilisation Comité pour l'Université Northwestern.

Remarque: La procédure suivante peut être fait entièrement avec un seul opérateur; cependant, il est beaucoup plus efficacement réalisé avec deux opérateurs avec les tâches réparties en conséquence.

1. Préparez la station laser et pré-laser

1. Positionner le laser et lampe à fente où il peut être facilement accessible. Allumez laser et réglé les paramètres pré-déterminée (par exemple 75 um taille de spot, une puissance de 100 mW, 100 msec).
   ATTENTION: Assurez-opérateur porte tous les animaux et la sécurité laser équipement de protection individuelle et de sécurité laser pertinente signes sont affichés à l'extérieur de la salle d'opération.
   1. Avant d'utiliser des animaux de laboratoire, trouver les paramètres idéaux en utilisant un étalonnage, souris non expérimentale. Paramètres laser dépendent du laser utilisé. Idéal paramètres sont définis par le réglage le plus bas de la puissance du laser qui provoque constamment la formation «bulle» lorsqu'il est correctement centré. Voir la vidéo par exemple de lésion avec la formation adéquate «bulle».
2. Préparer la station de pré-laser de sorte que l'anesthésie, animal plus chaud, les mouchoirs en papier, et toutes les gouttes pour les yeux (Tropicamide, Tétracaïne, et des larmes artificielles) sont à portée de main à l'opérateur.
   1. Assurez-vous que l'animal est plus chaud pré-chauffé à corriger la température (37 ° C) avant l'injection anesthésique dans la première souris afin d'éviter l'hypothermie induite par l'anesthésie.
3. Placez stade de la souris sur plus chaud de sorte qu'il peut retenir la chaleur et de rester au chaud une fois la procédure laser commence.

2. Souris anesthésie et de préparation au laser

1. Avant injectioning anesthésie, inspecter l'œil macroscopiquement pour vous assurer qu'il n'a pas de malformations ou anomalies qui diminuent la clarté de la cornée (par exemple de la cataracte).
2. Peser souris.
3. Enregistrer le poids, le sexe, et le numéro d'identification de l'animal.
4. Utilisation de poids, calculer le montant approprié d'anesthésie pour être utilisé sur la base des directives données par l'institution (par exemple, 100 mg / kg de chlorhydrate de kétamine, 10 mg / kg de xylazine OU tribromoéthanol 250 mg / kg; pour une souris de 20 g injecter 0,20 ml xylazine / kétamine cocktail ou 0,25 ml de tribromoéthanol). Une table des doses pré-calculé par le poids par incréments de 1 g afin de réduire les erreurs mathématiques.
5. Scruff souris et injecter un anesthésique par voie intrapéritonéale basées sur des calculs à l'étape 2.4.
6. Placez la souris sur l'animal chaud et attendre jusqu'à ce que la souris est complètement anesthésié en vérifiant le réflexe de la pédale par pincement de l'orteil (environ 3-5 min).
7. Enrouler un tissu essuyez et protéger le secteur de la souris nasale pour empêcher aspiration de liquide roll-off. Passez la souris sur le côté et déposer une goutte (environ 30 pi) de chlorhydrate de tétracaïne dans chaque œil pour l'anesthésie topique. Attendre 2 min pour solution pour prendre effet.
8. Répétez l'étape 2.7 avec une goutte de Tropicamide topique pour dilatation pupillaire. Vous pouvez également utiliser le chlorhydrate de phényléphrine (2,5%) pour la dilatation.
9. Attendre 2 min de solutions prennent effet; garder animal chaud pendant ce temps.
10. Après un temps approprié est écoulé, placer rapidement la souris sur la scène de la souris et de placer la scène sur le menton reste de la lampe à fente.
11. Allumez la lampe à fente à la luminosité de la lumière le plus bas et vérifier le degré de dilatation de la pupille. Si l'élève est pas dilaté suffisamment (environ 2,5-3 mm), retourner la souris à l'animal chaud et attendre. Alternativement, administrer une autre goutte de Tropicamide. Une fois que l'œil est suffisamment dilaté, passez à l'intervention au laser.

3. Procédure Laser

Remarque: Veiller à l'autre pes personnes dans la salle porter des lunettes de protection lorsqu'ils sont loin de laser protégé lampe à fente oculaire

1. Ajuster la position de la souris sur la souris-scène, alors qu'il est idéalement positionné pour la visualisation du nerf optique (voir 3.1.2).
   1. Orienter la souris sur son support de sorte qu'il se trouve à l'horizontale, perpendiculaire à la fente faisceau de la lampe, avec la tête d'un côté et de l'autre queue. Le placement de la souris Idéal fera optique visualisation du nerf beaucoup plus facile une fois lamelle est appliquée.
   2. Tourner légèrement la souris de sorte qu'il est à un angle de ~ 170 ° avec la tête plus près à l'opérateur de laser.
   3. Assurez-vous que la souris est aussi proche que possible de lampe à fente, mais toujours dans une position où il est stable et où la main de l'opérateur aura assez d'espace pour la manipulation très bien.
2. Après la souris est idéalement placé, placer une goutte de solution de larmes artificielles sur une 25 mm x 25 mm lamelle de verre.
   1. Déposer une goutte de solution de larmes artificielles sur le opp de la sourisoeil Osite - cet œil assurera est hydratée et la formation aident à retarder de la cataracte.
3. Tenez coin de lamelle entre le pouce et les doigts pointeur; position de sorte que le verre est coincé entre les deux bouts de doigts.
4. Enveloppez doucement les trois autres doigts autour du corps de l'animal pour le soutien et la stabilisation de la main. Position main de sorte que la lamelle de verre peut être facilement placé sur l'oeil de la souris.
   1. Assurez-vous que le poignet est stabilisée sur une surface ferme afin de réduire les tremblements de la main.
5. Une fois position stable est obtenue, appuyez avec une lamelle de verre (avec goutte de larme artificielle encore adhéré) sur l'œil de la souris.
   1. Assurez-vous que la lamelle est positionnée aussi perpendiculairement que possible pour le faisceau laser afin d'éviter la dispersion laser de faisceau ou de réflexion. La lamelle agit comme une lentille de contact pour aplatir la cornée.
6. Regardez à travers la lampe à fente et avec la main libre bascule concentrer untrétine de IL peuvent être visualisées. La rétine aura une couleur jaune clair / rouge selon l'endroit visualisé,, vaisseaux rouges distinctes seront visibles.
7. Lentement et soigneusement manipuler la tête et / ou lamelle souris jusqu'à la visualisation du nerf optique. Le nerf optique sera de couleur jaune avec plusieurs vaisseaux qui en émane.
8. Une fois que l'opérateur a confirmé la visualisation du nerf optique, allumez laser faisceau de focalisation.
9. Une fois faisceau laser a été allumé, manœuvrer focalisation laser faisceau à la position désirée (environ 1 diamètre de disque du nerf optique).
10. Concentrez faisceau laser sur l'EPR du fond de l'oeil. Mise au point est réalisé en ayant le faisceau laser la plus nette et la plus claire. Si visant faisceau semble ovale ou de mise au point, bascule focus lampe à fente ou repositionner lamelle de verre.
11. Une fois que le faisceau de visée est axée sur RPE, initier administration laser à l'aide pied la gâchette du laser.
    1. Soyez sûr d'éviter vaisseaux rétiniens pour empêcher qu'il intraoculairemorrhage.
12. Surveillez l'apparition d'une bulle immédiatement après l'administration de laser. Le contour du tir laser doit être claire et non trouble en aucune façon.
    1. Si le tir laser ne conduit pas à la formation de bulles, ou de la zone d'impact semble floue (aspect trouble avec la frontière mal définie circulaire vs clair frontière, nettement définie d'un impact de succès), ou si l'hémorragie est observée après l'administration de laser, ne inclure ces lésions pour une analyse future.
13. Répétez les étapes 3.10 à 3.12 pour toutes les positions souhaitées CNV (généralement à 3, 6, 9, et 12 heures positions autour du nerf optique). Si inductions laser sont appliqués à environ égale distance de nerf optique, recentrage devrait pas être nécessaire. Toutefois, en raison de la forte courbure de l'œil de la souris et de petites variations qui peuvent exister dans la rétine, en recentrant le faisceau peut être nécessaire entre les administrations laser consécutives.
14. Enregistrement dans un ordinateur portable l'emplacement et le résultat de elaser ach administration de tir et le résultat (succès, brumeux, une hémorragie, etc.) de chaque tir administré pour l'œil. Veillez à placer le laser en mode stand-by lorsqu'il ne sert pas.
15. Répéter 3,1 à 3,14 pour l'autre oeil de la souris, si nécessaire, en utilisant l'autre main pour la stabilisation et une nouvelle lamelle.
16. Après tous les coups de laser souhaités sont administrés, éteignez laser et la lampe à fente.
17. Jeter la lamelle et le lieu souris sur chauds pour récupération de l'anesthésie. Inspecter macroscopiquement oeil pour tout préjudice et placer une goutte de solution de larmes artificielles pour garder l'oeil hydraté et de prévenir le développement futur de la cataracte potentiellement. Une fois que la souris se remet de l'anesthésie, revenir à la cage.

	AVERTIN	AVERTIN	AVERTIN	XYL / KET	XYL / KET
Souris Poids (g)	Dose (mg / kg)	Concentration de la solution (mg / ml)	Anesthésique Dose (ml)	Dose (mg / kg)	Anesthésique Dose (ml)
15	250	20	0,1875	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,15
16	250	20	0,2	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,16
17	250	20	0,2125	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,17
18	250	20	0,225	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,18
19	250	20	0,2375	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,19
20	250	20	0,25	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,2
21	250	20	0,2625	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,21
22	250	20	0,275	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,22
23	250	20	0,2875	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,23
24	250	20	0,3	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,24
25	250	20	0,3125	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,25
26	250	20	0,325	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,26
27	250	20	0,3375	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,27
28	250	20	0,35	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,28
29	250	20	0,3625	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,29
30	250	20	0,375	100 mg / kg de kétamine; 10 mg / kg de xylazine	0,3

Tableau 1: Posologie XyIKet graphique.

Résultats

La quantification des lésions de NVC peut être effectuée par l'analyse des choroïde plat monté à l'aide de coloration par immunofluorescence pour étiqueter les navires CNV. Les deux méthodes les plus fréquemment employées de préparation de tissu sont étiquetage FITC-dextran, fait par perfusion immédiatement avant le sacrifice animal, ou post-mortem immuno-coloration avec un marqueur des cellules endothéliales. Ces deux méthodes ont été décrites en détail précédemment ^13,14,21;

Discussion

Il ya plusieurs facteurs qui peuvent affecter la livraison de laser et le développement des lésions CNV résultante après succès laser induction. Ces facteurs doivent être contrôlés et normalisés afin d'avoir les résultats les plus fiables. Le plus pertinent de ces facteurs sont la sélection de la souris (génotype, âge et sexe), sélection anesthésie, et les paramètres de laser.

Le modèle de souris spécifique utilisé peut avoir un effet significatif sur le cours du déve...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm (green) argon ophthalmic laser	IRIDEX	GLx	any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lamp	Carl Zeiss	30SL-M	any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanol	Sigma	T48402-25G	used to make anesthetic
tert-amyl alcohol	Sigma	152463-1L	used to make anesthetic
amber glass vials + septa	Wheaton	WH-223696	tribromoethanol storage
tissue wipes	VWR	82003-820	miscellaneous
1% Tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	pupillary dilation
0.5% Tetracaine hydrochloride	Alcon	0065-0741-12	topical anesthesia
artificial tears	Alcon	58768-788-25	hydration
heat therapy pump (for animal warming)	Kent Scientific	HTP-1500	used to maintain animal body temp
warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510EA	maintains animal body temperature
30 G insulin needles	BD	328418	IP anesthesia injection
scale	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	mouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	flatten cornea to visualize mouse retina
xylazine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
ketamine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
Volocity	PerkinElmer		used for volumetric re-construction
ImageJ	National Institutes of Health		used for image analysis