JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Аннотация

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Введение

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является одним из ведущих причин слепоты у лиц в возрасте старше 50 1-3. AMD могут быть классифицированы в двух формах: атрофический ("сухой") AMD и неоваскулярная ("мокрый") драмов. Первая характеризуется географической атрофии пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), choriocapillaris, и фоторецепторов, в то время как последний характеризуется вторжением аномальных сосудов от сосудистой оболочки в наружных слоях сетчатки вызывает утечки, кровотечение, и фиброз, и в конечном итоге приводит к слепоте 1,2. Из двух форм, неоваскулярной ВМД составляет для большинства потери зрения 1. К счастью, эта форма не имеет многочисленные эффективные варианты фармакологические управления, в то время как его коллега атрофический в настоящее время имеет не доказано медицинского лечения 3. Кроме того, поскольку неоваскулярная Форма легко повторно капитулировали на животной модели, он был более широко доступным для основной АИсследование MD изучения основополагающих патологические механизмы для того, чтобы развивать новые методы лечения 4.

Первая модель животных экспериментальной хориоидальной неоваскуляризации (CNV) была разработана Райан и др. в нечеловеческих приматов 5. Эта модель индуцированного разрыв мембраны Бруха с помощью лазерной коагуляции, которая вызвала местной воспалительной реакции в результате ангиогенеза, аналогичной видели в неоваскулярной ВМД. Гистопатологическая прогрессирование ангиогенеза после лазерной индукции был найден, чтобы имитировать неоваскулярной драмов, что подтвердил законность в модели 6. Номера для человека приматов предложить наиболее похожий анатомии человека, но, к сожалению, являются дорогими в обслуживании, не может быть легко генетически модифицированных, и у вас медленный ход времени прогрессирования заболевания 7. Контрастно, модели грызунов являются гораздо более экономически эффективным для поддержания, может быть генетически манипулировать с относительной легкостью, и имеют гораздо быстрее КоуРГП прогрессирования заболевания (эксперименты могут проводиться на временной шкале недель против месяцев). Эти эксперименты должны проводиться только в пигментных грызунов, поскольку это очень трудно представить себе в альбиносов животных.

Мышь лазерно-индуцированный модель ЦНВ, впервые разработанная группой Campochiaro в конце 90-х 10, выросла в доминирующей моделью для животных в большинстве последних исследований 11-16. Из-за сложной и до сих пор неясно патогенезе CNV, лазер модель была применена во всех аспектах исследования мокрой AMD, начиная от изучения молекулярных механизмов ангиогенеза вождения к оценке новых методов лечения в будущем человеческого использования. Например, Sakurai и др. и Эспиноса-Heidmann др. используется лазерный модель для изучения влияния макрофагов на развитие ХНВ с использованием трансгенных мышей и фармакологические методы лечения истощения 15, 16. Джани др. и др Hoerster, б оптико-когерентной томографии (ОКТ) к изображению лазер-индуцированной ЦНВ в попытке охарактеризовать прогрессирование ХНВ и сравнить гистопатологические выводы результатами исследований на ОКТ изображений 12,17. Наконец, исследования с участием инъекции в антиангиогенных агентов были использованы в качестве предпосылок для испытаний на людях и были жизненно важное значение в разработке первого поколения анти-VEGF средств, используемых в управлении неоваскулярной AMD сегодня 10,18,19.

Альтернативные модели экспериментальной CNV использовать хирургические методы, чтобы побудить CNV. Эта процедура предполагает введение проангиогенные веществ (например рекомбинантными вирусными векторами с гиперэкспрессией VEGF, субретинальная инъекции RPE клеток и / или гранул полистирола), чтобы имитировать повышенную экспрессию VEGF видно на неоваскулярной ВМД, с целью нанесения ангиогенез 8,20. Тем не менее, этот метод дает значительно меньшую частоту неоваскуляризации; Эти исследования показали, что CNV вС57 / BL6 мышей происходит в 31% по сравнению с инъекциями ~ 70% успеха видели в методе лазерной коагуляции в том же духе мышей 8,14. По этим причинам, а также учитывая преимущества использования грызунов по сравнению с не-приматов, модель мышь лазерно-индуцированной CNV стала стандартной модели животных ХНВ для большинства экспериментов неоваскулярных 8 учебных AMD.

Глаз мыши представляет собой незначительный, тонкий ткань работать. Маневрирование глаза, чтобы визуализировать сетчатку трудно и требует много практики, пока мастерство не будет достигнута. Эта задача осложняется тем, что он должен быть извлечены с доминирующей и не доминирующей рукой. Кроме того, после того, как мелкие движения, необходимые для визуализации сетчатки были извлечены, координация между обеими руками и педали операционной лазер важны. В этой статье, мы стремились, чтобы отогнать проблемы обучения всех физических манипуляций, участвующих в лазерно-индуцированной CNV прокedure в руководстве, что бы помочь операторам добиться быстрого успеха с этой моделью.

протокол

Все животные лечатся в соответствии с Руководством по части уходу и использованию лабораторных животных 2013 издание, Ассоциация по исследованиям в видении и офтальмологии (ARVO) Заявление для использования животных в офтальмологических и Vision Research, и, как утверждается институциональной животных Уход и использование комитета по Северо-западного университета.

Примечание: Следующая процедура может быть сделано полностью с одним оператором; Однако, это гораздо более эффективно проводятся с двумя операторами с задачами разделить соответствующим образом.

1. Подготовьте станции Лазерная и долазерную

  1. Расположите лазер и щелевой лампы, где она может быть легко доступны. Включите лазер и установить предварительно определяется параметрами (например 75 размер мкм место, 100 мВт мощности, 100 мс продолжительность).
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, оператор носит все животное и лазерной безопасности средств индивидуальной защиты и безопасности уместны лазерного знаки отображаются вне процедурной комнате,
    1. Перед использованием экспериментальных животных, найти оптимальные параметры, используя калибровки, неэкспериментальных мыши. Лазерные параметры будут зависеть от используемого лазера. Идеальное параметры определяются самой низкой лазерной установкой мощности, которая последовательно вызывает "пузырь" образование, когда должным образом сфокусированы. Смотрите видеосюжет например поражения с надлежащей "пузырь" формирования.
  2. Подготовьте заранее лазерной станции, так что анестезия, животное теплее, ткани салфетки, и все глазные капли (Tropicamide, тетракаин, и искусственные слезы) легко в пределах досягаемости для оператора.
    1. Убедитесь, что животное теплее предварительно нагревают до нужной температуры (37 ° С) перед инъекцией анестетика в первом мыши, чтобы избежать анестезии, вызванной гипотермии.
  3. Поместите этап мыши на теплее, поэтому он может сохранять тепло и оставаться теплым, как только начинается процедура лазер.

2. Мышь Анестезия и долазерную Подготовка

  1. Перед InjectING анестезии, осмотрите глаз макроскопически, чтобы он не имеет деформаций или аномалий, которые уменьшают прозрачность роговицы (например, катаракты).
  2. Взвесьте мыши.
  3. Запись вес, пол и идентификационный номер животного.
  4. Используя вес, рассчитать необходимое количество анестетика для использования на основании принципов, данных института (например, 100 мг / кг кетамина гидрохлорида, 10 мг / кг ксилазина ИЛИ tribromoethanol 250 мг / кг; в течение 20 г мыши вводят 0,20 мл ксилазина / кетамин коктейль или 0,25 мл). tribromoethanol Есть таблица предварительно рассчитанных дозах на вес с шагом в 1 г, чтобы уменьшить математические ошибки.
  5. Скрафф мыши и ввести анестетик внутрибрюшинно на основе расчетов на этапе 2.4.
  6. Поместите курсор на животных теплой и подождите, пока мышь не будет полностью под наркозом, проверяя педали рефлекс с помощью пальца щепоткой (примерно 3-5 мин).
  7. Сверните ткань вытереть и защитить носовой области мышки, чтобы предотвратить aspiratион жидкости спадом. Мыши рулона на бок и поместить каплю (приблизительно 30 мкл) гидрохлорида тетракаина в каждый глаз за местной анестезии. Подождите 2 минуты для решения вступили в силу.
  8. Повторите шаг 2.7 с одной капли местного Tropicamide для расширение зрачков. Кроме того, использование Фенилэфрин гидрохлорид (2,5%) по дилатации.
  9. Подождите 2 минуты для решения вступили в силу; держать животное на теплее в это время.
  10. После соответствующей выдержки времени, быстро разместить мышь на сцене мыши и поместите этап на подбородке остальной щелевой лампы.
  11. Включите щелевой лампы в низкой яркости света и проверьте степень расширение зрачков. Если ученик не адекватно расширены (примерно 2,5-3 мм), вернуться мыши животного теплой и ждать. В качестве альтернативы, управлять другой каплю Tropicamide. После того, как глаз достаточно расширены, перейдите к процедуре лазерной.

3. Лазерная Процедура

Примечание: Убедитесь, что другие рersons в комнате носить защитные очки, когда вдали от лазерной защитой щелевой лампы окуляра

  1. Регулировка размещение мыши на мыши стадии, так что он идеально расположен для визуализации зрительного нерва (см 3.1.2).
    1. Расположите курсор на его владельца, так что лежит горизонтально, перпендикулярно щелевой лампы ближнего света, с головой на одной стороне и хвост в другом. Идеальное расположение мыши сделает зрительный нерв визуализации намного легче один раз покровное применяется.
    2. Слегка поверните мышь, так что на ~ 170 ° углом с главой ближе к лазерным оператора.
    3. Убедитесь, что мышь как можно ближе к щелевой лампы, но все еще в положении, когда она стабильна, и где рука оператора будет иметь достаточно места для тонкой манипуляции.
  2. После мышь идеально расположен, поместите одну каплю раствора искусственного слезоточивый на 25 мм х 25 мм покровным стеклом.
    1. Положите одну каплю раствора искусственного слезоточивый на НПЗ мышиosite глаз - это обеспечит глаз увлажняется и формирование задержки помощь катаракты.
  3. Держите угол покровного между большим и указатель пальцев; Положение так, что стекло зажата между кончиками пальцев обеих.
  4. Аккуратно заверните оставшиеся три пальца вокруг тела животного для поддержки и стабилизации руки. Положение рук так, что стекло покровное может быть легко размещены на глаз мыши.
    1. Будьте уверены, что запястье стабилизируется на твердой поверхности, чтобы уменьшить тремор рук.
  5. После того, как устойчивое положение получается, тщательно нажмите покровное стекло (с каплей искусственных слез еще придерживался) на глаз мыши.
    1. Убедитесь, что покровное позиционируется как перпендикулярно, как можно лазерного луча для того, чтобы предотвратить лазерный луч разброс или отражение. Покровное действует как контактная линза, чтобы сгладить роговицы.
  6. Посмотрите щелевой лампы и свободной рукой тумблер сосредоточиться ЕНТIL сетчатки могут быть визуализированы. Сетчатка будет иметь светло-желтый / красный цвет в зависимости от расположения визуализируется, различные сосуды, красные будут видны.
  7. Медленно и осторожно манипулировать головой мыши и / или покровное до визуализации зрительный нерв. Зрительный нерв будет желтого цвета с множеством сосудов, исходящих из него.
  8. После того, как оператор подтвердил визуализацию зрительного нерва, включите лазера фокусировки луча.
  9. После того, как лазерный луч был включен, маневрировать лазера фокусировки луча в нужное положение (примерно 1 диаметр диска от зрительного нерва).
  10. Фокус лазерного луча на ПЭС глазного дна. Правильное фокус достигается при наличии острых и ясный луч лазера. Если целью луч выглядит овальной или не в фокусе, переключение внимания щелевой лампы или повторно позиции покровного стекла.
  11. После прицеливания луч фокусируется на ПЭС, инициировать лазерное управление с помощью триггера ноги лазера.
    1. Будьте уверены, чтобы избежать сосудов сетчатки по предотвращению внутриглазного онmorrhage.
  12. Следите за появлением пузырьков сразу после лазерной администрации. Схема лазерного выстрела должно быть ясно и не туманные в любом случае.
    1. Если лазер выстрел не приводит к образованию пузырьков, или площадь воздействия выглядит туманно (мутный вид с плохо определены границы круговой против ясного, резко выраженной границы успешного воздействия), или если кровотечение видно после лазерной администрации, не включают в себя эти повреждения для последующего анализа.
  13. Повторите шаги 3,10-3,12 для всех требуемых положениях CNV (обычно через 3, 6, 9 и 12 часов позиции вокруг зрительного нерва). Если лазерные индукции применяются примерно в таком же расстоянии от зрительного нерва, переориентация не должно быть необходимым. Тем не менее, из-за сильного изгиба глаза мыши и небольших изменений, которые могут существовать в сетчатке, переориентации светового пучка может быть необходимым между последовательными лазерными введений.
  14. Запись в тетради расположение и результат еACH лазерной администрация выстрел, и результат (успешно, туманно, кровоизлияния и т.д.). каждого вводимого выстрела для глаз. Будьте уверены, чтобы поместить лазер в режиме ожидания, когда он не используется.
  15. Повторите 3.1-3.14 для другого глаза мыши при необходимости, с помощью противоположной стороны для стабилизации и нового покровное.
  16. После того как все желаемые лазерные выстрелы вводят, выключите лазер и щелевой лампы.
  17. Откажитесь покровное и место мыши на теплее для восстановления после анестезии. Макроскопически проверить глаза за любой ущерб и поместить каплю искусственного решения слезоточивого держать глаз о водой и потенциально предотвратить развитие катаракты будущее. После того, как мыши оправится от анестезии, вернуться к клетке.
Avertin Avertin Avertin XYL / КЭТ XYL / КЭТ
Вес мыши (г) Доза (мг / кг) Решение Концентрация (мг / мл) Обезболивающий доза (мл) Доза (мг / кг) Обезболивающий доза (мл)
15 250 20 0,1875 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0,15
16 250 20 0,2 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0.16
17 250 20 0,2125 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0.17
18 250 20 0,225 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0.18
19 250 20 0,2375 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0,19
20 250 20 0,25 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0,2
21 250 20 0,2625 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0.21
22 250 20 0,275 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0.22
23 250 20 0,2875 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0.23
24 250 20 0,3 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0.24
25 250 20 0,3125 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0,25
26 250 20 0,325 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0,26
27 250 20 0,3375 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0.27
28 250 20 0,35 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0.28
29 250 20 0,3625 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0,29
30 250 20 0.375 100 мг / кг кетамина; 10 мг / кг ксилазина 0,3

Таблица 1: XyIKet Дозировка карта.

Результаты

Количественная оценка CNV поражений может быть выполнена путем анализа плоских монтажа сосудистой оболочки глаза с помощью иммунофлуоресцентного маркировать сосуды Cnv. Два наиболее часто используемые методы подготовки ткани FITC-декстран маркировка, осуществляется с помощью перфузии ?...

Обсуждение

Есть несколько факторов, которые могут повлиять на лазерный доставку и результирующий развития CNV поражения после успешного лазерной индукции. Эти факторы должны контролироваться для стандартизированы и для того, чтобы иметь наиболее надежные результаты. Наиболее близким из этих фак...

Раскрытие информации

The authors declare they have no competing financial interests.

Благодарности

The authors would like to acknowledge Jonathan Chou, MD for his assistance on preparation and editing of the final manuscript and Wenzhong Liu for the OCT data. We would also like to acknowledge support from the Macula Society Research Grant (AAF), support from an unrestricted grant to Northwestern University from Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, and support from NIH-EY019951.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
532 nm (green) argon ophthalmic laserIRIDEXGLxany ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lampCarl Zeiss30SL-Many slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanolSigmaT48402-25Gused to make anesthetic
tert-amyl alcoholSigma152463-1Lused to make anesthetic
amber glass vials + septaWheatonWH-223696tribromoethanol storage
tissue wipesVWR82003-820miscellaneous 
1% TropicamideFalcon PharmaceuticalsRXD2974251pupillary dilation
0.5% Tetracaine hydrochlorideAlcon 0065-0741-12topical anesthesia
artificial tearsAlcon 58768-788-25hydration
heat therapy pump (for animal warming)Kent ScientificHTP-1500used to maintain animal body temp
warming padKent ScientificTPZ-0510EAmaintains animal body temperature
30 G insulin needlesBD328418IP anesthesia injection
scaleAmerican Weigh ScaleAWS-1KG-BLKmouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm)VWR48366089flatten cornea to visualize mouse retina
xylazineobtained from institutionobtained from institutionanesthesia
ketamineobtained from institutionobtained from institutionanesthesia
VolocityPerkinElmerused for volumetric re-construction
ImageJNational Institutes of Healthused for image analysis

Ссылки

  1. Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. Age related macular degeneration. Surv Ophthalmol. 32, 375-413 (1988).
  2. Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
  3. Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-Related Macular Degeneration. NEJM. 358, 2606-2617 (2008).
  4. Poor, S. H., et al. Reliability of the Mouse Model of Choroidal Neovascularization Induced by Laser Photocoagulation. IOVS. 55, 6525-6534 (2014).
  5. Ryan, S. J. The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration. Trans Am Ophthalmol Soc. 77, 707-745 (1979).
  6. Miller, H., Miller, B., Ishibashi, T., Ryan, S. J. Pathogenesis of laser induced choroidal subretinal neovascularization. IOVS. 31, 899-908 (1990).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molr Aspects Mede. 33, 487-509 (2012).
  8. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal Models of Choroidal and Retinal Neovascularization. Prog Retin Eye Res. 29, 500-519 (2010).
  9. Zeiss, C. J. REVIEW PAPER: Animals as Models of Age Related Macular Degeneration An Imperfect Measure of the Truth. Vet Pathol Online. 47, 396-413 (2010).
  10. Tobe, T., et al. Targeted Disruption of the FGF2 Gene Does Not Prevent Choroidal Neovascularization in a Murine Model. Am J Pathol. 153, 1641-1646 (1998).
  11. He, L., Marneros, A. G. Macrophages Are Essential for the Early Wound Healing Response and the Formation of a Fibrovascular Scar. Am J Pathol. 182, 2407-2417 (2013).
  12. Hoerster, R., et al. In vivo and ex vivo characterization of laser induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
  13. Jawad, S., et al. The Role of Macrophage Class A Scavenger Receptors in a Laser Induced Murine Choroidal Neovascularization Model. IOVS. 54, 5959-5970 (2013).
  14. Lambert, V., et al. Laser induced choroidal neovascularization model to study age related macular degeneration in mice. Nat Protocols. 8, 2197-2211 (2013).
  15. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage Depletion Inhibits Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3578-3585 (2003).
  16. Espinosa Heidmann, D. G., et al. Macrophage Depletion Diminishes Lesion Size and Severity in Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3586-3592 (2003).
  17. Giani, A., et al. In Vivo Evaluation of Laser Induced Choroidal Neovascularization Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography. IOVS. 52, 3880-3887 (2011).
  18. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF Is Major Stimulator in Model of Choroidal Neovascularization. IOVS. 41, 3158-3164 (2000).
  19. Reich, S. J., et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molr Vis. 9, 210-216 (2003).
  20. Baffi, J., Byrnes, G., Chan, C. C., Csaky, K. G. Choroidal Neovascularization in the Rat Induced by Adenovirus Mediated Expression of Vascular Endothelial Growth Factor. IOVS. 41, 3582-3589 (2000).
  21. Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. JoVE. , 2563 (2011).
  22. Espinosa-Heidmann, D. G., et al. Age as an Independent Risk Factor for Severity of Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 43, 1567-1573 (2002).
  23. Zhu, Y., et al. Improvement and Optimization of Standards for a Preclinical Animal Test Model of Laser Induced Choroidal Neovascularization. PLoS ONE. 9, e94743 (2014).
  24. Weinstock, M., Stewart, H. C. Occurrence in rodents of reversible drug induced opacities of the lens. British J Ophthalmol. 45, 408-414 (1961).
  25. Ridder III, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of Cataract Development in Anesthetized Mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

106AMD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены