Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Abstract

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

Introduction

الغلوتامات هو ناقل عصبي مثير رئيسيا في شبكية العين 1. خلايا الشبكية العقدة (RGCs)، وتلقي مدخلات متشابك glutamatergic من خلايا القطبين 2، هي الخلايا العصبية الناتج من شبكية العين التي ترسل المعلومات البصرية إلى الدماغ. وأظهرت الدراسات الفسيولوجية التي الإثارة متشابك من RGCs وتتوسط postsynaptically بواسطة مستقبلات NMDA (NMDARs) ومستقبلات أمبا (AMPARs) 3،4،5. وعلى الرغم من توسط التيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) في RGCs بواسطة AMPARs وNMDARs 3،5،6،7،8، عفوية EPSCs مصغرة (mEPSCs) على RGCs يحمل فقط عنصرا بوساطة AMPARs-4،5،9. ومع ذلك، والحد من امتصاص الغلوتامات كشف عنصرا NMDAR في EPSCs عفوية 5، مما يشير إلى أن NMDARs على التشعبات RGC قد تكون موجودة خارج نقاط الاشتباك العصبي مثير. تحركات guanylate غشاء المرتبطة (MAGUKs) مثل PSD-95 أن مستقبلات الناقل العصبي العنقودية، بما في ذلك مستقبلات الغلوتامات والقناة الايونيةالصورة في مواقع متشابك، أيضا يحمل متميزة أنماط التعبير تحت المشبك 10،11،12،13،14.

وعلى مدى العقود الأخيرة، المناعية مبائر وقبل تضمين المجهر الإلكتروني (EM) المناعية المستخدمة لدراسة التعبير مستقبلات الغشاء. على الرغم من أن المناعية متحد البؤر يكشف أنماط واسعة من التعبير مستقبلات، أقل قرارها يجعل من المستحيل استخدامها لتمييز موقع التحت خلوية. وتشير تضمين مسبقة الدراسات EM في شبكية العين الثدييات أن مفارز NMDAR موجودة في العناصر بعد المشبكي في مخروط القطبين نقاط الاشتباك العصبي خلية الشريط 15،16،17. هذا هو على النقيض الواضح على الأدلة الفسيولوجية. ومع ذلك، نشر ناتج التفاعل هو قطعة أثرية معروفة في طريقة المناعي قبل التضمين. وبالتالي، فإن هذا النهج لا تعطي عادة بيانات موثوقة إحصائيا وقد تستبعد التمييز بين التعريب لغشاء متشابك مقابل 18،19،20،21 غشاء extrasynaptic. علىمن ناحية أخرى، البيانات الفسيولوجية والتشريحية تتفق مع التعريب متشابك من AMPARs على RGCs 3،5،7،9،22. وبالتالي، يتم ترجمة مستقبلات الغلوتامات وMAGUKs في المشبك الشريط شبكية العين ليس فقط على بعد المشبكي ولكن أيضا لالمقصورات غشاء perisynaptic أو extrasynaptic. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى تحليل كمي عالية الدقة من هذه البروتينات الغشاء في المشبك الشريط في شبكية العين.

هنا، قمنا بتطوير تقنية postembedding EM immunogold لدراسة توطين تحت المشبك من مفارز NMDAR، مفارز AMPAR وPSD-95 تليها تقدير عدد وكثافة وتنوع هذه البروتينات في نقاط الاشتباك العصبي على RGCs الفئران المعنون باسم باستخدام الكوليرا السم الوحيدات ب (CTB) طرق تتبع الوراء.

Protocol

الرعاية وكان التعامل مع الحيوانات وفقا المعاهد الوطنية للصحة ورعاية الحيوان والمبادئ التوجيهية للجنة استخدام. واستمرت يوم بعد الولادة (P) 15-21 الفئران سبراغ داولي، حقن 1-1،2٪ CTB ثنائيا من خلال أكيمة متفوقة، على 12: ضوء لمدة 12 ساعة: دورة الظلام.

1. الشبكية تثبيت الأنسجة

  1. تجميع المواد التالية وأدوات: مجهر تشريح، 2 ملقط مع نصائح جيدة جدا، ومقص، ورقة فلتر السليلوز، ماصة بلاستيكية وشريحة المجهر.
  2. تخدير الفئران في غرفة مغلقة مع 2.0 مل الهالوثان (مخدر نشوق). تحديد التخدير الكافي من هذه الأساليب: عدم الانسحاب من مخلب الخلفي بعد قرصة أخمص القدمين، أو عدم وجود رد فعل طرفة. ثم قطع رأس مباشرة مع المقصلة. إزالة العينين مع مقص القزحية ووضعها في وعاء زجاجي يحتوي على 4٪ لامتصاص العرق في 0.1 م العازلة الفوسفات (PB) في 7.4 درجة الحموضة.
  3. باستخدام مجهر تشريح، وإزالة الذرةعصام بقطع الجزء الأمامي من مقلة العين. إزالة العدسة والجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلية مع ملقط.
  4. قشر الصلبة مع ملقط اثنين حتى يتم عزل شبكية العين من فنجان العين.
  5. قطع شبكية العين على الفور إلى 100-200 ميكرون شرائح سميكة بشفرة الحلاقة، وتخضع لتثبيت الرقم الهيدروجيني التحول.
  6. إصلاح شرائط شبكية العين في 4٪ امتصاص العرق في 0.1 م PB في درجة الحموضة 6.0 ل 20 - 30 دقيقة ثم في 4٪ امتصاص العرق بالإضافة إلى 0.01٪ غلوتارالدهيد في درجة الحموضة 10.5 عن 10-20 دقيقة في RT.
  7. بعد عدة غسلات في الجريدة الرسمية مع 0.15 ملي CaCl 2 (7.4 درجة الحموضة في 4 درجة مئوية)، cryoprotect شرائح الشبكية مع الجلسرين (60 دقيقة لكل منهما في 10٪، 20٪، 30٪، ثم O / N في 30٪) في 0.1 م قبل PB تجميد تبديل.

2. تجميد إحلال

ملاحظة: يتم تعديل هذا الأسلوب تجميد الإحلال من السابق بروتوكول المنشورة 19،20. أيضا، من الأهمية بمكان أن الصكوك هي باردة جدا (ارتداء قفازات)؛ سtherwise، والأنسجة قد يذوب جزئيا عند لمسها مع الصكوك. تتم كل هذه الخطوات داخل غرفة AFS ويسمح الصكوك أبدا للتحرك فوق حافة الغرفة. وبالمثل، والتبريد المناسب لجميع المواد الكيميائية المستخدمة في المؤسسة أمر ضروري.

  1. يغرق-تجميد شرائح الشبكية في البروبان السائل عند -184 درجة مئوية في صك EM الحفظ بالتبريد (CPC). باستخدام فرشاة ناعمة، ووضع العينات على قطع صغيرة من الشريط المزدوج عصا تعلق على بذرة المعادن التي تدخل في نهاية قضبان تغرق (الفتيل قبالة عازلة إضافية باستخدام فرشاة).
  2. يغرق القضبان في البروبان السائل والحفاظ على وجود نحو 5 ثوان، ثم نقل إلى أداة تجميد استبدال تلقائي (AFS) باستخدام غرفة النقل الصغيرة التي هي شغلها مع النيتروجين السائل ( 'LN 2 تبريد البرد نقل الحاويات').
  3. بعد وضع العينة المجمدة وأدوات (ملقط ومشرط) في AFS، تبريد الآلات في غرفة على الدقائق veral قبل لمس الأنسجة، أو تبريدها عن طريق وضع نصائح من الصكوك لبضع ثوان في غرفة النقل الصغيرة (مليئة النيتروجين السائل ( 'LN 2 تبريد البرد نقل الحاويات')).
  4. مرة واحدة في المؤسسة، وإزالة عينة والشريط من كعب باستخدام مشرط على ما يرام. أيضا، والحفاظ على السيطرة على تدفق غاز النيتروجين، TF (TF يوصف بأنه 'السيطرة منظم لLN 2 vaporiser') مفتوحة خلال هذه الإجراءات.
  5. قبل وضع الأنسجة المجمدة في أصحاب تضمين مسطحة (أي قبل إنشاء AFS)، وقطع دائرة رقيقة من البلاستيك ورقة واضحة ووضعه في الجزء السفلي من حامل بحيث تبطن الجزء السفلي من كل بئر. وهذا يسمح إزالة أسهل نسبيا من الكتل عينة بلمرة عند الانتهاء.
    ملاحظة: في السابق، استخدمنا طريقة بديلة لأصحاب التضمين شقة، وتوظيف مزدوجة رايشرت + الجيلاتين كبسولات (انظر بيتراليا وWenthold، 1999) <سوب> 20.
  6. استخدام التسلسل التالي التلقائي في AFS (باستخدام المصطلحات الصك): T1 = -90 درجة مئوية لمدة 32 ساعة، S1 = زيادة درجة الحرارة بمقدار 4 درجات مئوية / ساعة (11.3 ساعة)، T2 = -45 درجة مئوية لمدة 50 ساعة، S2 = زيادة درجة الحرارة بمقدار 5 درجات مئوية / ساعة (9 ساعة)، T3 = 0 درجة مئوية لمدة 40 ساعة (مجموع = 142.3 ساعة). قد يستغرق 2-4 ساعة لوضع العينات في AFS (في -90 درجة مئوية) قبل بدء تسلسل توقيت.
  7. تزج أقسام المجمدة في 1.5٪ خلات اليورانيل في الميثانول في -90 درجة مئوية لمدة> 32 ساعة في AFS. وضع قطعتين من الأنسجة (عادة) في كل من الآبار السبعة في حامل الألومنيوم تضمين شقة (ثلاث تنسجم مع AFS).
    1. وضع الأنسجة + الشريط في اليورانيل خلات / الميثانول في الآبار وإزالة الشريط في وقت لاحق، فقط قبل بداية تضمين المتوسطة (مثل Lowicryl HM20) تسلل، إذا كان من الصعب جدا لإزالة الأنسجة من الشريط.
  8. ثم زيادة التدريجية في درجة الحرارة إلى -45 درجة مئوية (+ 4 ° C لكل ساعة. في تسلسل تلقائي).
  9. غسل العينات ثلاث مرات في الميثانول precooled، باستخدام ماصة بلاستيكية يميل غرامة لإزالة الحل القديم من كل صاحب شقة التضمين، وبعد ذلك باستخدام ماصة بلاستيكية واضحة أخرى لإضافة الميثانول النقي precooled.
  10. ثم، وذلك باستخدام نفس الأسلوب، التسلل العينات تدريجيا مع انخفاض درجات الحرارة تضمين الراتنجات مثل تضمين المتوسطة (HM20 / الميثانول في 1: 1 و 2: 1، كل لمدة 2 ساعة، تليها الراتنج النقي لمدة 2 ساعة وبعد ذلك تغيير راتنجات والحفاظ O / N).
  11. تغيير الراتنج مرة أخرى في اليوم التالي، وتعديل مستوى من الراتنج للوصول فقط إلى الحافة العليا من الآبار.
  12. بلمرة العينات (-45 درجة مئوية إلى 0 درجة مئوية في تسلسل التلقائي؛ + 5 ° C لكل ساعة) مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 40 ساعة.
  13. ثم إزالة عينات من AFS. عادة، وكتل عينة لا تزال تظهر بعض الوردية اللون. وضع العينات على مقربة من ضوء الفلورسنت في غطاء الدخان الكيميائية، في RT O / N أو لفترة أطول حتى التطبيقالأذن واضحة تماما.

3. Postembedding EM Immunogold سيتولوجية مناعية

يتم تنفيذ Postembedding مناعية كما هو موضح 23،24،25: ملاحظة.

  1. قطع 1 ميكرون المقاطع مع مشراح مستدق، وصمة عار المقاطع مع طولويدين الأزرق 1٪، ودراستها لقسم التوجيه. توجيه كتلة الأنسجة لتحقيق الطائرة عرضية مثالية من باجتزاء.
  2. قطع 70 نانومتر أقسام سامسونج سميكة مع مشراح مستدق وجمعها على شبكات فتحة النيكل المطلي Formvar الكربون.
  3. غسل الشبكات مرة واحدة في H المقطر 2 O تليها مخزنة المالحة تريس، ثلاث مرات (TBS، 0.05 عازلة M تريس، 0.7٪ كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.6) غسل.
  4. احتضان شبكات في 20 قطرات ميكرولتر من 5٪ BSA في TBS لمدة 30 دقيقة، ثم في 20 قطرات ميكرولتر من مزيج يحتوي على الماعز المضادة للCTB (1: 3000) وأجسام مضادة لواحد NMDAR فرعية (المضادة للأرنب GluN2A 01:50 ، GluN2B 01:30)، أو مضاد للأرنب GluA2 / 3 (1:30)في TBS-تريتون (TBST، 0.01٪ تريتون X-100، ودرجة الحموضة 7.6) مع 2٪ BSA و 0.02 M نان 3 O / N في RT.
  5. شبكات غسيل على ثلاث قطرات منفصلة (20 ميكرولتر) من TBS (الرقم الهيدروجيني 7.6) لمدة 10، 10، و 20 دقيقة، تليها TBS (الرقم الهيدروجيني 8.2) لمدة 5 دقائق.
  6. احتضان شبكات لمدة 2 ساعة على قطرات (20 ميكرولتر) من مزيج يحتوي على حمار مفتش المضادة للأرنب (01:20) بالإضافة إلى 10 نانومتر جزيئات الذهب ومفتش حمار المضادة للماعز (01:20) بالإضافة إلى جزيئات الذهب 18 نانومتر في TBST (درجة الحموضة 8.2) مع 2٪ BSA و 0.02 M نان 3.
  7. غسل شبكات في 20 قطرات ميكرولتر من TBS (الرقم الهيدروجيني 7.6) لمدة 5 و 5 و 10 دقيقة، ثم في الماء عالى النقاء وثم تجفيفها.
  8. شبكات مباين مع 5٪ خلات اليورانيل و 0.3٪ من الرصاص سترات في H المقطر 2 O لمدة 8 و 5 دقائق في ظل ظروف مظلمة، على التوالي.
  9. للتجارب الثلاثي وضع العلامات، واحتضان شبكات O / N في RT مع 20 قطرات ميكرولتر من خليط من مكافحة الماعز CTB (1: 3000)، ومكافحة فأر PSD-95 (1: 100)، والمضادة للأرنب GluN2A (1 : 50). ثم احتضان شبكات لمدة 2 ساعة في 20 قطرات ميكرولتر من خليط من الجماعات الحكومية الدولية بالإضافة إلى 18، و 10، و 5 جزيئات الذهب نانومتر في TBST (درجة الحموضة 8.2) مع 2٪ BSA و 0.02 M نان 3. الحفاظ على نفس إجراءات وضع العلامات مزدوج لغسيل وcounterstaining بين وبعد حضانة الأضداد.
  10. تم تنفيذ الضوابط التي تم تطبيقها على الأجسام المضادة الثانوية وحدها.
  11. عرض الشبكات على EM ورقمنة الصور. معالجة الأرقام النهائية في أدوبي فوتوشوب 6.0 فقط من أجل السطوع والتباين إذا كان ذلك ضروريا (24).

4. الكمي

  1. يدويا مناطق مختارة من طبقة ضفيري الداخلية (IPL) بدون ثقوب أو تشققات في 8،000X التكبير، ثم تركيب الصورة بشكل عشوائي عمق الكامل للIPL في 25،000X التكبير.
  2. تحديد التشعبات RGC في مخروط dyads القطبين عندما أ) تحتوي على إشارة CTB نقل retrogradely (جزيئات الذهب الكبيرة)، ب) المعرض واضحة المعالم الأغشية، وشقوق، وكثافة بعد المشبكي، ج) تحتوي على اثنين على الأقل صغير جزء الذهبicles في مديرية الأمن العام، أو الجسيمات صغيرة من الذهب أكثر من واحد على طول الغشاء البلازمي extrasynaptic.
  3. جمع 45 - 55 التشعبات RGC، استنادا إلى المعايير المذكورة أعلاه، للتحليل الكمي.
  4. قياس أطوال مديرية الأمن العام وغشاء البلازما extrasynaptic من التشعبات RGC الفردية مع برامج المعاهد الوطنية للصحة يماغيج. عدد جزيئات الذهب في غضون 10 نانومتر الغشاء كما غشاء المرتبطة، على أساس سمك متوسط ​​من 7-9 نانومتر للغشاء البلازما 26.
  5. حساب كثافة الجسيمات حيث بلغ عدد جزيئات الذهب في ميكرومتر الخطي (الذهب / ميكرون). قياس المسافة بين مركز كل الجسيمات الذهب ووسط مديرية الأمن العام (للموقع متشابك) أو على حافة مديرية الأمن العام (للموقع extrasynaptic).
  6. إجراء تحليل إحصائي من قبل البرامج. استخدام اثنين من الذيل تي الاختبارات لمقارنة الوسائل. نستنتج أهمية عند P <0.05. ما لم يذكر خلاف ذلك، قيم التقرير بأنه يعني ± SEM 18.

النتائج

النتائج المعروضة هنا تظهر مختلفة لافت للنظر أنماط توطين تحت المشبك من GluA 2/3 وNMDARs على التشعبات RGC في شبكية العين الفئران، كما هو موضح سابقا 24،25. وتقع 77٪ من GluA 2/3 الجسيمات immunogold في لمحات شجيري RGC في مديرية الأمن العام (الشكل 1A)، على غرار مع?...

Discussion

وصفناها أربع تقنيات لنجاح الكمي بعد تضمين immunogold م: 1) تثبيت القصير والضعيف، 2) تجميد الاستبدال، 3) بعد دمج تلطيخ immunogold، و 4) الكمي.

EM immunogold يسمح للكشف عن بروتينات معينة في قطاعات النسيج سامسونج. الأجسام المضادة المسمى مع جزيئات الذهب ...

Disclosures

The authors have no disclosures.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل برامج جماعية من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) والمعهد الوطني للاضطرابات التواصل الأخرى الصمم و(NIDCD)، من المعاهد الوطنية للصحة (NIH). نشكر منشأة NINDS EM وNIDCD متقدمة الأساسية التصوير (رمز # شركة زيورخ للتأمين العاصمة 000081-03) للحصول على المساعدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ParaformaldehydeEMS15710
GlutarldehydeEMS16019
NaH2PO4SigmaS9638
Na2HPO4Sigma7782-85-6
CaCl2SigmaC-8106
BSASigmaA-7030
Triton X-100SigmaT-8787
NaOHSigma221465
NaN3JT BakerV015-05
GlycerolGibco BRL15514-011
Lowicryl HM 20Polysciences15924-1
Tris-BaseFisherBP151-500
TrisFisher04997-100
Anti-GluN2AMilliporeAB1555PDilution 1/50
Anti-GluN2BMilliporeAB1557PDilution 1/30
Anti-GluA2/3MilliporeAB1506Dilution 1/30
Anti-PSD-95MilliporeMA1–046Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particlesEMS25704Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particlesEMS25814Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particlesEMS25812Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particlesJackson ImmunoResearch705-215-147Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids.EMSFCF2010-Ni
Uranyl acetateEMS22400-1
MethanolEMS67-56-1
Lead citrateLeica
Leica EM AFSLeica
Leica EM CPCLeica
UltromicrotomeLeica
JEOL 1200 EMJEOL
liquid nitrogen Roberts Oxygen
PropaneRoberts Oxygen
CTBList Biological Laboratories1041-1.2%
Anti-CTBList Biological Laboratories703Dilution 1/4000

References

  1. Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
  2. Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
  3. Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
  4. Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
  5. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  6. Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
  7. Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
  8. Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
  9. Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
  10. Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
  11. Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
  12. Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
  13. Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
  14. Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
  15. Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
  16. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  17. Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
  18. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
  19. Petralia, R. S., Wenthold, R. J., Ariano, M. A. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. , 46-74 (1998).
  20. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
  21. Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
  22. Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
  23. Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
  24. Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
  25. Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
  26. Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , (1991).
  27. Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
  28. Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
  29. Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
  30. Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
  31. Merighi, A., Polak, J. M., Priestley, J. V. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. , 51-87 (1992).
  32. Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
  33. Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
  34. Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
  35. Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
  36. Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

108 perisynaptic immunogold NMDA PSD 95

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved